Y khoa, dược - Chương 5: Miễn dịch không nhiễm trùng

HIV, nhiễm khuẩn và xác ñịnh kháng thể ñơn dòng. AF BS AF BS AF BS AF BS Cơ chất AF BS AF BS AF BS AF BS Kỹ thuật gồm nhiều bước ñược tổng hợp của 3 phương pháp chính (ñiện di SDS- Page, wethern bot, ELISE) - ðiện di protein trên gel acrylamit ñể tách protein. - Chuyển protein từ bảng gel lên màng lai (nitroxenlulose) - Phủ huyết thanh chứa kháng thể lên màng lai và tiến hành lai - Rửa những kháng thể không bắt cặp kháng nguyên trên màng lai ( proten) - Thêm kháng kháng thể cộng hợp enzym ñể kháng thể phản ứng với phức hợp (kháng nguyên - kháng thể). - Bổ sung cơ chất ñể enzyme thủy phân cơ chất thành dung dịch màu. - Xác ñịnh nồng ñộ kháng thể trong huyết thanh thông qua việc ño màu dung dịch bằng phổ kế. 7.6. Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch. Thông thường các ñộc tố nấm mốc (AFB1) trong nông sản thực phẩm rất thấp (ở dạng lượng vết). ðể ñịnh lượng với ñộ chính xác AFB1 ta cần phải làm giàu mẫu bằng phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch. Sắc ký ái lực miễn dịch ñược dựa trên phản ứng ñặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên (AFB1). Phương pháp này không những chỉ ñặc hiệu mà còn ñơn giản, dễ thực hiện và không ñộc hại cho người sử dụng. Nguyên lý của sắc ký ái lực miễn dịch Cột sắc ký ái lực miễn dịch ñược minh hoạ trên hình 7.10. Trên những hạt gel kháng thể ñặc hiệu với chất cần phân tích ñược gắn một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính. Các hạt gel này ñược nhồi trong một cột nhỏ (cột sắc ký). Khi cho dịch chiết mẫu qua các cột này các chất cần phân tích (kháng nguyên) sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu ñã qua cột, ta rửa cột ñể loại bỏ những phần không bắt cặp ñặc hiệu với kháng thể. Sau ñó sử dụng dung môi ñể kéo kháng nguyên ra khỏi kháng thể. Dung dịch thu ñược, xác ñịnh bằng phương pháp ELISA hoặc một số phương pháp phân tích khác. 7.7. Phương pháp ñiện di miễn dịch 1- ðiện di khuyếch tán miễn dịch Nguyên tắc. Kỹ thuật này dựa trên hiện tượng khuyếch tán kháng nguyên và kháng thể nhưng không phải là khuyếch tán tự nhiên mà người ta sử dụng dòng ñiện ñể hướng dẫn cho kháng nguyên và kháng thể gặp nhau nhanh hơn. Kháng nguyên chuyển ñộng từ cực âm sang cực dương, kháng thể chuyểng ñộng ngược lại cho ñến khi kháng nguyên gặp kháng thể tạo thành các vòng cung kết tủa có thể nhìn ñược bằng mắt hoặc thông qua thuốc nhuộm ñặc hiệu. Cách thực hiện. - Chuẩn bi gel agar hoặc gel agarose (1% trong ñệm barbitone pH = 8,2). - Trải gel trên phiến kính dày khoảng 3mm. - ðục hai giếng cách nhau khoảng 1cm theo chiều dài của phiến kính. - Chuyển phiến kính vào buồng ñiện di có chứa dung dịch ñệm barbitone pH = 8,2. - Cho mẫu phân tích chứa kháng nguyên ở phía cực âm ( khoảng 5÷10µl). - Cho một lượng tương ứng kháng thể ở phía cực dương. - Tiến hành ñiện di ở ñiện thế 8v/1cm trong vòng 30 phút. Hình 7.10: Cột sắc ký ái lực miễn dịch - Nếu có phản ứng kháng nguyên kháng thể thì sẽ xuất hiện các vòng cung kết tủa có thể nhìn ñược bằng mắt hoặc thông qua thuốc nhuộm CBB, 0,025% (Coomassie briliant blue). 2- ðiện di hội tụ ñẳng ñiện Kỹ thuật này cho phép tách biệt ñược các protein theo ñiểm ñẳng ñiện của chúng ở tại các vị trí pH khác nhau trên bản gel. Gradient pH ñược tạo ra trong bản gel sẽ ñược hình thành giữa cực âm và cực dương trong quá trình ñiện di. Kết quả là các protein sẽ di chuyển do sức hút của các nhóm ñiện tích ñối với cực dương và cực âm cho ñến khi các protein khác biệt ñiện tích này sẽ ñạt tới ñiểm ñẳng ñiện của chúng thì dừng lại. Dãy pH trên bản gel ñược duy trì ổn ñịnh khi ta sử dụng một hợp chất ñiện di lưỡng tính và ñược gọi là các ampholit mang. Những ion lưỡng tính này có ñiểm ñẳng ñiện xác ñịnh ñược lựa chọn và phân bổ ñều thành một dãy pH mong muốn. Hỗn hợp ampholit này ñược bán sẵn từ các hãng nổi tiếng trên thế gới. Người ta có thể sử dụng gel polyacrylamit ñể ñiện di, ñối với những phân tử quá kồng kềnh ta có thể sử dụng gel agarose . Sau khi chuẩn bị xong: mẫu phân tích, khuôn gel, ... ta ñặt vào buồng ñiện di, nối ñiện cực vào bộ nguồn và tiến hành ñiện di. Thời gian ñiện di phụ thuộc vào thang pH, thường người ta ñiện di qua ñêm ở nhiệt ñộ 40C. 3- ðiện di hai chiều (2D-Page) ðiện di hai chiều trên gel polyacrylamit ñược dùng ñể mô tả phương pháp tách tách các phân tử protein theo hai chiều ðiện di 2 chiều có ñộ phân giải cao, bao gồm có ñiện di hội tụ và ñiện di protein SDS - Page. ðiện di hai chiều là một công cụ hết sức hữu íc trong nghiên cứu cơ bản và trong nghiên cứu lâm sàng. Nhờ ñiện di hai chiều (2D-Page) các kháng thể tinh chế có thể ñược chuyể thấm miễn dịch ñể phát hiện kháng nguyên và các epitop tương ứng. ðiện di hai chiều kết hợp với nhuộm bạc cũng cho phép ñánh giá chính xác mức ñộ tinh sạch của một loại protein nhất ñịnh.(xem phần mô phỏng) + Yêu câu pyê Là một hiện tượng phức tạp thực hiện bởi nhiều loại tế bào gồm nhiều công ñoạn với cơ chế ñiều hòa tế nhị. Nếu ví hệ thống miễn dịch như một dàn nhạc thì các tế bào là những nhạc công còn tuyến ức là một nhạc trưởng. 1.2. Miễn dịch học cổ ñiển, miễn dịch học hiện ñại Miễn dịch học cổ ñiển Miễn dịch học cổ ñiển hay còn gọi là miễn dịch học truyền nhiễm, là học thuyết về tính ñề kháng của cơ thể và các biện pháp tiêm chủng phòng các bệnh truyền nhiễm như: bệnh lao, bệnh sởi, ho gà, uốn ván, bạch hầu... Miễn dịch học hiện ñại Miễn dịch học hiện ñại còn gọi là miễn dịch không nhiễm trùng. Miễn dịch học hiện ñại không ñối lập với miễn dịch học cổ ñiển mà phát triển xa hơn sang các lĩnh vực khác như :Ghép mô, Ghép cơ quan, miễn dịch khối u, xác ñịnh kháng nguyên nhóm máu, phát hiện khiếm khuyết miễn dịch bẩm sinh, bệnh tự miễn... Các nguyên tắc của miễn dịch học hiện ñại ñược phát hiện nhờ phân tích di truyền các cơ chế ngăn cản gép mô, gép cơ quan từ người này sang người khác, các yếu tố chấn áp sự phát triển của tế bào ưng thư. Qua nhiều phân tích cho thấy nguyên nhân thải loại mảnh gép hoặc phát sinh tế bào ung thư là mang tính di truyền, còn cơ chế ñào thải hoặc chống lại sự phát triển của tế bào ung thư thì mang tính chất miễn dịch. Tuy nhiên miễn dịch học cổ ñiển hay miễn dịch học hiện ñại ñều là những bộ phận của miễn dịch học nói chung và vì thế miễn dịch học nhiễm trùng ñứng ngang hàng với miễn dịch học gép mô, ... và ñều ñược xây dựng trên nền tảng của miễn dịch di truyền học. 1.3. Phân hạng tính miễn dịch. Tính miễn dịch tự nhiên và tính miễn dịch thu ñược. Miễn dịch tự nhiên Miễn dịch tự nhiên, hay còn gọi là miễn dịch bẩm sinh, không có tính ñặc hiệu. Bắt ñầu xuất hiện và tiến hoá từ loài cá, chim, thú và ñến loài người. Miễn dịch tự nhiên gồm các thành viên là hàng rào vật lý như da, màng nhầy, ñại thực bào, mono bào, tế bào bạch cầu ña nhân, bạch cầu ưa axit và các chất tiết (cytokin) của tế bào. Miễn dịch thu ñược Miễn dịch thu ñược hay còn gọi là miễn dịch thích ứng có tính ñặc hiệu cao, có sự tham gia của các thụ thể tế bào lympho và ñại thực bào. Có hai loại tính miễn dịch thu ñược ñó là: - Miễn dịch dịch thể ñược biểu hiện khả năng phản ứng của kháng thể hoà tan, là thành phần tiết của tế bào lympho B. - Miễn dịch qua trung gian tế bào là khả năng ñáp ứng của tất cả các tế bào lympho. 1.4. Khái niệm về kháng nguyên Kháng nguyên (antigen) là vật chất sống hoặc chết từ môi trường bên ngoài lọt vào cơ thể ñộng vật theo nhiều ñường khác nhau. Phần lớn chúng có bản chất protein và xa lạ với chính cơ thể ñộng vật “ Cái không phải tôi”. Kháng nguyên từ bên ngoài lọt vào cơ thể phần lớn là các vi sinh vật gây bệnh như virus, vi khuẩn, kí sinh trùng... Con ñường khác của sự xuất hiện kháng nguyên trong cơ thể là tế bào hay vi cấu trúc của cơ thể bị biến ñổi thành xa lạ với chính cơ thể như: tế bào ung thư, các mô lạ trong cơ thể. Kháng nguyên ñặc hiệu (chất sinh miễn dịch) là chất có khả năng kích thích sinh kháng thể ñể chống lại chính nó, hoặc liên kết với kháng thể, các thụ thể ñặc hiệu của các tế bào lympho. ðặc ñiểm chung của kháng nguyên ñặc hiệu là những phân tử của chúng có kích thước lớn. Kích thước lớn thì mới có thể mang hết trong mình những tín hiệu của của một hệ thống di truyền ngoại lai. ðặc ñiểm chung thứ hai là các phân tử kháng nguyên mang những nhóm ñặc hiệu của kháng nguyên. Chính ñể chống những nhóm ấy mà cơ thể ñã sinh ra trung tâm hoạt ñộng của kháng thể. Ngoài ra kháng nguyên phải có cấu trúc phức tạp. Như vậy tất cả các chất sinh miễn dịch ñều là kháng nguyên, song một số chất kháng nguyên thì lại không gây ñáp ứng miễn dịch. Ví dụ như hapten là chất có trọng lượng phân tử thấp có thể gắn với kháng thể ñặc hiệu nhưng không kích thích tạo kháng thể nên không phải là kháng nguyên thực thụ. 1.5 Khái niệm về kháng thể Kháng thể hay còn gọi là Antibody là các globulin có trong huyết thanh của ñộng vật có khả năng liên kết ñặc hiệu với kháng nguyên ñã kích thích sinh ra nó. Kháng thể theo ñịnh nghĩa trên còn gọi là kháng thể miễn dịch hay kháng thể ñặc hiệu (immunoglobulin) Kháng thể tự nhiên hay còn gọi là kháng thể không ñặc hiệu, có sẵn ở trong các dịch thể trước khi tiếp xúc với kháng nguyên như sữa, nước tiểu . 1.6. Cơ chế bảo vệ không ñặc hiệu 1.6.1. Hàng rào vật lý Bao gồm da và các niêm mạc ngăn cách giữa nội môi và môi trường xung quanh. Da: Bao gồm lớp ngoài biểu bì lớp trong là các mô liên kết tạo ra hàng rào vật lý ngăn cản sự xâm nhập của các vi sinh vật. Thông thường vi sinh vật không xâm nhập vào cơ thể mà chủ yếu chúng vào cơ thể qua vết thương, sau ñó vào các mạch máu và tới các cơ quan. Niêm mạc: màng bao phủ các bộ phận ñường ruột, hô hấp, sinh dục..Cũng như da niêm mạc bao gồm lớp biểu mô ở ngoài và mô liên kết ở trong. Phía dýới là những tuyến tiết dịch ñể bắt giữ vi sinh vật. Do niêm mạc có ñộ ẩm cao nên một số virus, vi khuẩn có thể sống sót ví dụ như vi khuẩn gây bệnh giang mai.. Dịch thể: Nước mắt, nước tiểu .. là những dịch thể có khả năng cuốn trôi vi sinh vật. 1.6.2. Hàng rào vi sinh vật Phần lớn là các vi sinh vật ñường tiêu hóa phân bố trên xoang miệng, vi sinh vật ñường hô hấp, bộ phận sinh dục. Bình thường chúng không gây bệnh và không xâm nhập vào cơ thể. Chúng chiếm các vị trí và ngăn không cho các VSV gây bệnh vào cơ thể. 1 6.3.Hàng rào hóa học ðộ pH: pH thấp ngăn sự phát triển của vi sinh vật Dịch vi: Dịch vị trong dạ dày cùng với các enzym có pH rất thấp ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Interferon: (IFN) Là nhóm glucoprotein cảm ứng chứa khoảng 146- 166 amino acid, chúng xuất hiện trong các tế bào cơ thể người khi bị nhiễm virus ñể chống lại virus. Hiện nay người ta biết có tới 22 gen ở nhiều loại tế bào khác nhau của người như ñại thực bào, tế bào lympho, các tế bào thuộc cơ quan lympho trung tâm và ngoại vi có khả năng sản xuất IFN khi chúng bị nhiễm virus. ðến năm 1980 người ta ñã phân lập ñược các gen mã hoá tổng hợp ba loại IFN và xây dựng công nghệ sản xuất INF bằng phương pháp tái tổ hợp. IFN là loại protein tương ñối ñơn giản, là sản phẩm của tế bào sống, nên bản thân nó không ñộc. Có 3 loại IFN: α, β, và γ khác nhau bởi số amino axit và hoạt tính sinh học của chúng. α-IFN do bạch cầu sản xuất khi có virut xâm nhập, β-IFN do nguyên bào sợi sản xuất, còn γ-IFN do bạch cầu sản xuất qua phản ứng của hệ miễn dịch. IFN tác dụng chống virus theo các cơ chế sau: - IFN không tác ñộng trực tiếp lên virus, mà tác ñộng lên tế bào ñể tế bào tổng hợp ra các loại protein ñặc biệt, có khả năng kìm hãm sự phát triển của virus xâm nhập cơ thể bằng cách ngăn cản sự khởi ñầu của dịch mã và phá huỷ ARN thông tin của virus. - IFN còn có tác dụng ức chế sự tăng sinh nhanh chóng của tế bào ác tính, do tác ñộng ngăn cản quá trình dịch mã và tổng hợp protein trong tế bào. - IFN có tác dụng tăng cường sự biểu hiện của glucoprotein MHC lớp I và II trên bề mặt của tế bào, tạo ñiều kiện cho tế bào của hệ thống miễn dịch nhận diện kháng nguyên virus. - IFN với tư cách là một lymphokin tham gia quá trình ñiều hoà miễn dịch, thúc ñẩy quá trình biệt hoá của tế bào lympho T, NK, ðTB. Interleukin: Interleukin là một lymphokin bao gồm có Interleukin-1 (IL-1) và Interleukin-2 (IL-2). Nó có khả năng giúp cơ thể ñiều hoà miễn dịch, tăng khả năng miễn dịch và chống ung thư. IL-2 là một cytokin quan trọng nhất ñối với sự phát triển và ñáp ứng miễn dịch thích ứng. IL-2 có vai trò chính trong hoạt hoá các tế bào lympho T. Bố thể:là một nhón protein huyết thanh thuộc hệ thống miễn dịch bẩm sinh không ñặc hiệu. Nó cũng là nhóm glucoprotein có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào vi sinh vật. Hoạt ñộng của bố thể làm tổn thương thành tế bào vi sinh vật gây bệnh sau ñó làm tan tế bào. 1.6.4.Hiện tượng thực bào Nhiều loại bạch cầu tham gia vào quá trình bảo vệ không ñặc hiệu theo con ñường thực bào. Các tế bào này ñều có nguồn gốc từ tế bào nguồn trong tuỷ xương. (hình 1.1) * Bạch cầu hạt: bao gồm bạch cầu trung tính ña nhân, bạch cầu kiềm bạch cầu ưa axit; trong tế bào bạch cầu hạt thường chứa nhiều hạt sinh chất nhỏ và các chất khác nhau. Bạch cầu trung tính (PMN-polymorphonuclear neutrophile): chứa các hạt không bắt màu thuốc nhuộm, ñược tạo thành khối lượng lớn ở tuỷ xương và thường xuyên có ở trong máu. PMN ñóng vai trò chính trong bảo vệ không ñặc hiệu chống nhiễm trùng, chúng có khả năng thực bào các chất lạ kể cả vi sinh vật và phế thải của tế bào theo cơ chế hoá ứng ñộng hấp dẫn. Bạch cầu ưa kiềm: chứa các hạt bắt màu thuốc nhuộm kiềm như xanh metylen. Bạch cầu ưa axit: phản ứng với thuốc nhuộm axit như bắt màu ñỏ với thuốc nhuộm eosin. Bạch cầu axit có vai trò cân bằng hoạt ñộng sống của bạch cầu kiềm và gây ñộc ñối với ấu trùng một số ký sinh trùng như giun. * Bạch cầu không hạt: bao gồm các tế bào mono và lympho bào Tế bào lympho: bao gồm hai loại tế bào lympho B và tế bào lympho T là tế bào ñóng vai trò quan trọng trong ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu. Tế bào mono: là tế bào ñơn nhân, tiền thân của ñại thực bào. Khi chui qua mao mạch tới các mô bị nhiễm trùng chúng trở thành ñại thực bào. ðại thực bào: ðại thực bào là tế bào có kích thước lớn, có khả năng bắt giữ xử lý kháng nguyên cũng như cùng với tế bào lympho sản xuất kháng thể ñể dáp ứng miễn dịch. ðTB ñóng vai trò quan trọng trong chống nhiễm virus. Nó tiết ra enzym xytokin khi gặp virus. ðây là tín hiệu ñầu tiên ñáp ứng miễn dịch. Hoặc vi sinh vật ñược dịch lympho ñưa về hạch lympho và tại ñây VSV bị thực bào tiêu diệt. * Hệ thống thực bào ñơn nhân (mononuclear phagocyte system): Là mạng lưới các bạch cầu ñơn nhân có khả năng thực bào. Dịch chứa trong hệ thống có nhiệm vụ bắt giữ và tiêu diệt vi sinh vật ở các mô và tập trung VSV vào các hạch lympho ñể tiêu diệt. Một số các ñại thực bào trong hệ thống này còn có khả năng chui ra khỏi hệ thống ñịnh cư tại các mô, ngược lại một số ñại thực bào ở trạng thái tự do chúng di chuyển vào các mô bị vi sinh vật xâm nhập. Hình 1.1: Các tế bào tham gia ñáp ứng miễn dịch không ñặc hiệu Cơ chế thực bào Cơ chế thực bào gồm các bước sau: - Các vi sinh vật gặp thực bào và dính vào thành tế bào, thông thường là thông qua các thụ thể trên tế bào. - Thông qua thụ thể ñại thực bào thâu vi sinh vật vào bên trong tế bào và sau ñó ñóng kín lại tạo không bào tiêu hóa gọi là phagosom. - Các lysosome tiến ñến dung hợp với phagosome ñể tạo thành các phagolysosome. Vi sinh vật trong phagolysosome bị tiêu hoá bởi các enzyme có nhiều trong lysosome. - Vật chất sinh ra sau khi tiêu hoá vi sinh vật sẽ ñược tống ra ngoài hoặc nội tiêu bên trong tế bào. Cơ chế chuyển hoá tiêu diệt vi sinh vật trong tế bào: Các enzyme có trong lysosome chuyển hoá tiêu diệt tế bào thông qua các cơ chế khác nhau: - Tạo thành H2O2, -OH,...là các tác nhân ñộc ñối với vi sinh vật từ oxy phân tử bởi các enzyme phụ thuộc oxy trong lysosome. - Sản sinh ra các tác nhân ñộc như các gốc nitrat, nitrit, halogen,.. có tác dụng ñộc ñến tế bào ñể tiêu diệt tế bào. - Phân giải tế bào nhờ các enzyme thuỷ phân như phospholipase, lysozyme, ribonuclease, deribonuclease,... - Tế bào bạch cầu trung tính tổng hợp nên defensin tiêu diệt tế bào bằng cách tăng khả năng thấm của màng sinh chất của tế bào vi khuẩn, nấm và ngăn cản sự nhân lên của virus. 1.6.5. Sốt Thông thường thân nhiệt luôn ổn ñịnh và ở nhiệt ñộ 370C. ðể duy trùy nhiệt ñộ này ở não có vùng dưới ñồi (hypothalamus) làm nhiệm vụ ñiều hòa nhiệt ñộ cơ thể. Sốt là sự tăng nhiệt cơ thể, là cơ chế bảo vệ tự nhiên của cơ thể khi cơ thể bị nhiễm khuẩn. Sự gia tăng nhiệt ñộ của cơ thể làm tăng hoạt ñộng của interferon, tăng hoạt tính enzyme và làm giảm nồng ñộ sắt tự do trong máu là nguồn cung cấp sắt cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Cơ chế sốt: ðại thực bào sau khi tiêu hoá vi sinh vật giải phóng ra chất gây sốt kích thích tế bào sinh ra IL-1, chất này có nhiệm vụ kích thích vùng dưới ñồi tiết ra prostaglandin ñiều chỉnh cho nhiệt ñộ cơ thể tăng lên. Khi nồng ñộ IL-1 trong máu giảm cơ thể ñáp ứng bằng cách giãn mạch máu và tiết mồ hôi ñể hạ nhiệt ñến nhiệt ñộ bình thường của cơ thể. Một số chất gây sốt như: Polysaccarit, Peptidoglycan là các nội ñộc tố hoặc các ngoại ñộc tố gây sốt ñặc hiệu ví dụ như ñộc tố phá huỷ hồng cầu của Streptococcus pyogenes. 1.6.6.Viêm cấp không ñặc hiệu Viêm là gì? Viêm ñược tạo thành ñể khu trú vi sinh vật vào một nơi và không cho chúng lan rộng thêm. Bốn triệu chứng của viêm ðỏ: là do bạch cầu kiềm và tế bào mast tiết các chất hoạt mạch chẳng hạn như histamin làm dãn mạch làm cho máu dồn về nơi vết thương nhiều hơn. Nóng: cũng là hậu quả của sự dãn mạch, dòng máu tăng lên ở vị trí nhiễm trùng làm nhiệt ñộ tăng lên. Sưng: là do tính thấm thành mạch tăng, tiết dịch tập trung quanh tế bào và mô. Tính thấm tăng dẫn ñến sự xuyên mạch của tế bào trung tính và ñại thực bào tới ổ dịch làm nhiệm vụ thực bào. ðau: trong trường hợp bị viêm, tế bào máu bị tan, khởi ñộng một số tế bào tiết prostaglandin kích thích thần kinh gây ñau.