Xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để nhận biết ngô biến đổi gene

Kỷ yếu Hội nghị khoa học 178 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP ĐỂ NHẬN BIẾT NGÔ BIẾN ĐỔI GENE Nguyễn Trọng Nghĩa*, Hồ Viết Thế Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Tác giả liên lạc: nghiant0503@gmail.com TÓM TẮT Hiện nay, nước ta đã trồng ngô biến đổi gene một cách rộng rãi tuy nhiên vẫn còn nhiều ý kiến tranh cãi về mức độ an toàn của sản phẩm này. Vì vậy việc kiểm soát thực phẩm có chứa thành phần ngô biến đổi gene nhanh chóng, chính xác là cần thiết. Nhiều phương pháp sinh học phân tử đã được áp dụng trong đó có kỹ thuật LAMP đáp ứng được các yêu cầu về độ chính xác, thử nghiệm nhanh chóng, có tính linh động cao với khả năng phân tích mẫu ngay tại hiện trường. Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình phát hiện ngô biến đổi gene bằng kỹ thuật LAMP. Kết quả cho thấy thông số tối ưu cho phản ứng này gồm nồng độ primer FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM, hàm lượng DNA 12,5 ng/µL, nhiệt độ tối ưu 62oC đến 67oC. Kết quả này chứng minh phản ứng LAMP có độ nhạy cao hơn phản ứng PCR và có thể áp dụng rộng rãi ngoài thực tế. Từ khóa: Promoter 35S, LAMP, ngô, PCR. DEVELOP LAMP METHOD TO DETECT GENETICALLY MODIFIED MAIZE Nguyen Trong Nghia*, Ho Viet The Ho Chi Minh city University of Food Industry *Corresponding Author: nghiant0503@gmail.com ABSTRACT At present, Vietnam has grown genetically modified (GM) maize widely. However there are still several controversies about the safety of this product, so that investigating new method to detect GM maize in food product fast and exactly is neccessary. In this study, we develop new method to detect GM maize by using LAMP technique. In this study, we identify the optimal condition for LAMP reaction as followings: the best concentration of primers FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM, the threshold DNA detection: 6,25 ng/µL, the optimal reaction temperature: 62oC to 67oC. This result demonstrates that the LAMP reaction suitable for identifying GM maize and it can be further developed to apply in pratices. Keywords: Promoter 35S, LAMP, maize , PCR. MỞ ĐẦU Hiện nay, thực phẩm được làm từ nguyên liệu có nguồn gốc sinh vật biến đổi gene (GMO) ngày càng được sử dụng rộng rãi. Các cây lương thực như lúa, ngô biến đổi gene hay các cây công nghiệp như đỗ tương, bông biến đổi gene được trồng với diện tích rộng lớn trên toàn thế giới [1]. Từ năm 2015, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn đã cho phép trồng đại trà các giống ngô NK66 Bt (giống chuyển gene Bt11), NK66 Gt (giống chuyển gene GA21) và NK66 Bt/Gt (giống chuyển gene Bt11 và GA21) có khả năng kháng sâu đục thân và thuốc diệt cỏ ở các vùng trên cả nước. Mặc dù các giống ngô chuyển gene đem lại hiệu quả lớn về năng suất và chất lượng sản phẩm, nhưng trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng vẫn có những ý kiến trái chiều về giống ngô này. Một vài thử nghiệm về tác động của GMO dối với động vật như ở chuột và lợn ghi nhận được GMO tạo ra các protein không mong muốn có thể gây dị ứng, gây phản ứng miễn dịch hay tạo ra các khối u nhưng những kết quả này không đáng kể và thấp hơn mức ngưỡng cho phép nên thực phẩm GMO vẫn được phân phối trên thị trường [2-4]. Vì vậy, việc quản lý sinh vật biến đổi gene, thực hiện dán nhãn đối với thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gene giúp tạo thêm sự lựa chọn cho người tiêu dùng, thêm sự lựa chọn cho nhà sản xuất. Hiện tại có nhiều phương pháp phát hiện nguyên liệu thực phẩm có chứa thành phần biến đổi gene như PCR, Realtime PCR, ELISA [5, 6]. Hầu hết các phương pháp xác định cây chuyển gene đều chú trọng đến sự hiện diện của promoter 35S, vì đây là promoter hoạt đông mạnh và được sử dụng phổ biến nhất hiện nay khi chuyển gene vào cây trồng, trong đó có cây ngô chuyển gene [7-9]. Tuy nhiên các phương pháp này có nhược điểm phụ thuộc quá nhiều vào các thiết bị hiện đại đắt tiền và chỉ phân Kỷ yếu Hội nghị khoa học 179 tích được ở trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu thực tế cần phát triển một phương pháp phát hiện nguyên liệu thực phẩm biển đổi gene có tính di động cao để có thể xác định ở trên cánh đồng hoặc từ chợ, siêu thị Từ năm 2000, Notomi và cộng sự đã nghiên cứu thành công kỹ thuật LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification), có thể phát hiện đoạn DNA đặc hiệu chính xác, nhanh chóng, đơn giản có thể thu nhận kết quả ngay tại hiện trường [10]. Kỹ thuật này đã được sử dụng thành công để phát hiện các loại sinh vật gây bệnh ở nhiều nơi trên thế giới và ở Việt Nam [11-13]. Trong nghiên cứu này chúng tôi xây dựng quy trình phát hiện nguyên liệu thực phẩm biến đổi gene bằng kỹ thuật LAMP thông qua sự hiện của promoter 35S trong ngô biến đổi gene. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Mẫu ngô NK66 BT/GT (giống ngô lai đơn F1 mang gene kháng sâu bộ cánh vảy: Bt11 và chống chịu thuốc trừ cỏ Glyphosate) có nguồn gốc từ công ty TNHH Syngenta Việt Nam Phương pháp nghiên cứu Mẫu ngô NK66 BT/GT được tách chiết bằng quy trình ly trích DNA của Bùi Minh Trí, 2002 [14]. Trong quy trình ly trích, chúng tôi đã thay đổi thời gian ủ mẫu với đệm ly trích DNA và SDS 10% từ 1 giờ thành 24 giờ. DNA được định tính bằng phương pháp điện di với điện thế 110V trong 20 phút sau đó phân tích hình ảnh với máy chụp gel Quantum - ST4 3000 (Montreal – Biotech, Canada) và định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang với máy (OD) UV-Vis 6600. Phản ứng PCR được thực hiện với cặp primer 35S- 1/35S-2 trên thiết bị SureCycler 8800 Thermal Cycler (Agilent, Mỹ) để khẳng định sự hiện diện của promoter 35S trong sản phẩm ngô và cũng được sử dụng để so sánh độ nhạy, làm mẫu đối chứng kết quả khi thực hiện phản ứng LAMP. Tổng thể tích của phản ứng PCR là 12 µL bao gồm: primer xuôi 20 µM 1 µL, primer ngược 20 µM 1 µL, DNA (50ng/µL) 1 µL, MyTaqTM HS White Mix (Bioline, Mỹ) 2x 6 µL và nước cất khử ion 3 µL. Bảng 1. Trình tự cặp primer 35S-1/35S-2 Tên primer Trình tự primer xuôi và ngược (5’-3’) Kích thước đoạn khuếch đại 35S-1 GCTCCTACAAATGCCATCA 195 (bp) 35S-2 GCTCCTACAAATGCCATCA Phản ứng LAMP được tối ưu hóa bằng việc khảo sát nồng độ primer cho phản ứng, chúng tôi thay đổi nồng độ primer theo nghiệm thức F3/B3 và FIP/BIP (0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 µM); sau đó chúng tôi khảo sát hàm lượng DNA với các hàm lượng thay đổi theo nghiệm thức: 12,5; 25; 50; 100 và 200 ng/µL, cuối cùng là khảo sát nhiệt độ tối ưu cho phản ứng LAMP với nhiệt độ thay đổi từ 62oC đến 67oC. Tổng thể tích của phản ứng LAMP là 25 µL bao gồm: primer F3/B3, FIP/BIP 0,2-0,8 µM; 15 µL Isothermal Master Mix 1X (Optigene, Anh); 1 µL DNA (40 ng/µL). Hỗn hợp được ủ ở 65oC trong 60 phút. Cuối cùng, kết quả phản ứng LAMP được nhận biết bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% và nhận biết trực tiếp bằng thuốc nhuộm GelRedTM.. Bảng 2. Trình tự cặp primer F3/B3 và FIP/BIP của phản ứng LAMP Tên primer Trình tự primer (5’ – 3’) F3 AAGATGCCTCTGCCGACA B3 CAGCGTGTCCTCTCCAAAT FIP ACGTGGTTGGAACGTCTTCTT-CCCAAAGATGGACCCCCA BIP ATCTCCACTGACGTAAGGGATG-ATAGAGGAAGGGTCTTGCGA KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR với cặp primer 35S-1/35S-2 Sau khi thực hiện ly trích DNA thành công, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR truyền thống để khẳng định mẫu ngô của công ty Syngenta là giống biến đổi gene. Kết quả thu được các băng vạch khuếch đại đặc hiệu ở vị trí 195 bp, kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu trước đó của Zhou và cộng sự, 2009, Rabieia và cộng sự, 2013 [17, 18], bên cạnh đó việc tăng nồng độ mẫu DNA ban đầu từ 6,25 ng/µL lên mức 200 ng/µL đã làm cho các băng vạch xuất hiện rõ hơn chứng tỏ nồng độ DNA cao hơn và hiệu quả của phản ứng PCR tốt hơn. Vậy nồng độ mẫu DNA ban đầu tối ưu cho phản ứng này là 200 ng/µL. Kết quả điện di sản phẩm PCR Kỷ yếu Hội nghị khoa học 180 được thể hiện ở Hình 1. Kết quả này khẳng định giống ngô từ công ty Syngenta là giống biến đổi gene và có sử dụng trình tự 35S làm promoter trong cấu trúc của gene chuyển. Vì vậy chúng tôi sử dụng giống ngô này để phát triển phương pháp LAMP cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 1. Kết quả phản ứng PCR khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR với cặp primer 35S-1/35S-2 (M: Ladder 100 bp, 1: Mẫu đối chứng âm, 2: Mẫu DNA 6,25 ng/µL, 3: Mẫu DNA 12,5 ng/µL, 4: Mẫu DNA 25 ng/µL, 5: Mẫu DNA 50 ng/µL, 6: Mẫu DNA 100 ng/µL, 7: Mẫu DNA 200 ng/µL) Khảo sát và tối ưu nồng độ primer phản ứng LAMP Để xác định nồng độ tối ưu của 2 cặp primer sử dụng cho phản ứng LAMP, chúng tôi tiến hành các nghiệm thức có sự phối hợp giữa hai yếu tố này với các nồng độ khác nhau, kết quả được thể hiện như ở Hình 2. Từ kết quả này chúng tôi nhận thấy tất cả các nghiệm thức đều xuất hiện sản phẩm khuếch đại trừ nghiệm thức 13 (FIP/BIP: 0,2 µM, F3/B3: 0,8 µM). Các nghiệm thức xuất hiện băng vạch rõ nhất là các nghiệm thức 3 (FIP/BIP: 0,6 µM, F3/B3: 0,2 µM), nghiệm thức 4 (FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM ) và nghiệm thức 10 (FIP/BIP: 0,4 µM, F3/B3: 0,6 µM). Vì vậy, chúng tôi chọn nghiệm thức nồng độ hai cặp primer tối ưu nhất là: FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu về nồng độ của các primer trong kỹ thuật LAMP được công bố trước đây của Zhou và cộng sự, 2014 [19]. Tỉ lệ hai cặp primer này được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Hình 2. Kết quả phản ứng LAMP khảo sát nồng độ hai cặp primer F3/B3 và FIP/BIP Khảo sát và tối ưu lượng DNA mẫu của phản ứng LAMP Kết quả điện di sản phẩm phản ứng LAMP với mẫu DNA của giống ngô chuyển gene có nồng độ thay đổi từ 12,5 ng/µL đến 200 ng/µL, kết quả cho thấy các nghiệm thức phản ứng LAMP với nồng độ DNA khác nhau đều xuất hiện các các băng vạch khi điện di và kết quả này tương tự với nghiên cứu của Zahradnik và cộng sự, 2014 [16] Kết quả được trình bày ở Hình 3. Kỷ yếu Hội nghị khoa học 181 Hình 3. Kết quả phản ứng LAMP khảo sát nồng độ DNA (M: Ladder 1000 bp, 1: Mẫu đối chứng âm, 2: Mẫu DNA 12,5 ng/µL, 3: Mẫu DNA 25 ng/µL, 4: Mẫu DNA 50 ng/µL, 5: Mẫu DNA 100 ng/µL, 6: Mẫu DNA 200 ng/µL) Vậy đối với phản ứng LAMP, chỉ cần lượng DNA mẫu là 1 µL với nồng độ 12,5 ng/µL là có thể thực hiện được phản ứng. Khi so sánh độ nhạy của phản ứng LAMP và phản ứng PCR ở thí nghiệm 3.1, có thể thấy sản phẩm của phản ứng LAMP và của phản ứng PCR đều thu được các băng vạch sáng, rõ ràng. Chúng ta có thể kết luận, đối với cùng lượng DNA mẫu, phản ứng LAMP có độ nhạy trong việc khuếch đại đoạn DNA đặc trưng tương đương phản ứng PCR và kết quả này tương tự nghiên cứu trước đó của Nkouawa và cộng sự, 2009 [13]. Khảo sát và tối ưu nhiệt độ cung cấp cho phản ứng LAMP Với mục đích thử nghiệm sử dụng thiết bị gia nhiệt đơn giản để thay thế cho máy PCR, chúng tôi sử dụng bể ổn nhiệt để thực hiện phản ứng LAMP. Kết quả điện di các mẫu khảo sát được thể hiện ở Hình 4. Hình 4. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng LAMP (1: Ladder 1000 bp, 2: nhiệt độ 62oC, 3: nhiệt độ 63oC, 4: nhiệt độ 64oC, 5: nhiệt độ 65oC, 6: nhiệt độ 66oC, 7: nhiệt độ 67oC) Kết quả điện di sản phẩm LAMP cho thấy khi nhiệt độ giao động từ 62oC đến 67oC các mẫu thử nghiệm đều xuất hiện các băng vạch đặc trưng và không có sự khác nhau quá lớn giữa các nhiệt độ phản ứng. Chúng ta có thể kết luận rằng nhiệt độ tối ưu để thực hiện phản ứng LAMP là khoảng nhiệt độ từ 62oC đến 67oC. Kết quả chúng tôi thu được có sự tương đồng khi so sánh kết quả với nghiên cứu trước của Zhen và cộng sự, 2016 [20], khảo sát phản ứng LAMP với nhiệt độ tối ưu (61, 63, 65oC). So sánh hiệu quả của phản ứng LAMP trong bể ổn nhiệt và bình giữ nhiệt Với mong muốn phương pháp LAMP có thể được áp dụng rộng rãi và linh động, chúng tôi phát triển phương pháp thông qua việc thực hiện phản ứng LAMP trong bình ổn nhiệt cầm tay và so sánh hiệu quả với phản ứng sử dụng bể ổn nhiệt, kết quả được thể hiện như Hình 5. Kỷ yếu Hội nghị khoa học 182 Hình 5. Kết quả phản ứng LAMP thực hiện trong bể ổn nhiệt hai ngăn (A) và trong bình giữ nhiệt (B) (1: Mẫu DNA 12,5 ng/µL, 2: Mẫu DNA 25 ng/µL, 3: Mẫu DNA 50 ng/µL, 4: Mẫu DNA 100 ng/µL, 5: Mẫu DNA 200 ng/µL) Kết quả điện di sản phẩm phản ứng LAMP trong bể ổn nhiệt được đặt ở nhiệt độ 65oC cho thấy các mẫu khảo sát đều xuất hiện các băng vạch. Đối với kết quả điện di sản phẩm phản ứng LAMP khi thực hiện trong bình giữ nhiệt, chỉ có các mẫu ở giếng 3, 4, 5 tương ứng hàm lượng DNA là 50, 100 và 200 ng/µL xuất hiện băng vạch còn các mẫu còn lại phản ứng LAMP không xảy ra nên không xuất hiện băng vạch. Kết quả cho thấy việc thực hiện phản ứng LAMP trong bình giữ nhiệt có ngưỡng phát hiện cao hơn so với bể ổn nhiệt. Điều này có thể giải thích nhiệt độ trong bình ủ nhiệt thông thường không có khả năng giữ nhiệt ổn định trong thời gian dài đủ để phản ứng xảy ra. Vì vậy, chúng tôi nên chọn sử dụng hàm lượng DNA là mức 50, 100 và 200 ng/µL. Tuy bình giữ nhiệt có khả năng thực hiện phản ứng LAMP nhưng do sự ổn định nhiệt độ trong suốt thời gian phản ứng không cao nên tỉ lệ thực hiện được khá thấp (3/5 mẫu xảy ra phản ứng – chiếm 60%). Vì vậy, để có thể sử dụng bình giữ nhiệt thực hiện phản ứng LAMP nhận biết nông sản chuyển gene đại trà, cần áp dụng thêm các biện pháp giúp giữ nhiệt độ ổn định hơn để tăng tỉ lệ thành công khi thực hiện. Kiểm tra kết quả phản ứng LAMP bằng thuốc nhuộm GelRedTM Để nhận biết kết quả phản ứng LAMP một cách nhanh chóng, chúng tôi đã sử dụng thuốc nhuộm GelRedTM. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua Hình 6. Hình 6. Kết quả thí nghiệm nhận biết sản phẩm phản ứng LAMP bằng thuốc nhuộm GelRedTM (Hàng A: Các mẫu sau khi thực hiện phản ứng LAMP, Hàng B: Các mẫu không thực hiện phản ứng LAMP. 1: Mẫu DNA 12,5 ng/µL, 2: Mẫu DNA 25 ng/µL, 3: Mẫu DNA 50 ng/µL, 4: Mẫu DNA 100 ng/µL, 5: Mẫu DNA 200 ng/µL) Kỷ yếu Hội nghị khoa học 183 Qua kết quả Hình 6 cho thấy, các sản phẩm phản ứng LAMP đã kết hợp hiệu quả với thuốc nhuộm GelRedTM (Hàng A), có khả năng phát sáng dưới ánh đèn UV. Bên cạnh đó, các mẫu ban đầu không được ủ trong máy luân nhiệt (Hàng B) không có hiện tượng phát quang dưới tia UV khi kết hợp với GelRedTM và hai nhóm này có thể phân biệt được bằng mắt thường. Tuy nhiên, kết quả phát quang không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức hàm lượng DNA khác nhau. Như vậy, việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang GelRedTM để phát hiện kết quả sản phẩm của phản ứng LAMP là khả thi, có thể ứng dụng rộng rãi để phát hiện các thực phẩm biến đổi gene nói chung và ngô chuyển gene nói riêng. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này chúng tôi đã hoàn thiện quy trình phát hiện ngô biến đổi gien thông qua xác định sự có mặt của promoter 35S bằng kỹ thuật LAMP. Chúng tôi chứng minh rằng các hệ thống gia nhiệt thông dụng như bể ổn nhiệt và bình nước nóng cầm tay có thể sử dụng cho hệ phản ứng LAMP. Điều này chứng minh khả năng ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật LAMP trong phát hiện nông sản biến đổi gene và chúng tôi đang hoàn thiện bộ Kit để có thể ứng dụng rộng rãi hơn trong thực tế cuộc sống hiện nay. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tạ Bá Hưng, Cao Minh Kiểm, Đặng Bảo Hà, Nguyễn Mạnh Quân, Nguyễn Phương Anh, Phùng Anh Tiến. Quản lý thực phẩm biến đổi gen: Kinh nghiệm của Mỹ, Liên minh Châu Âu và Trung Quốc. CỤC THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA. 2010:9-12. Chowdhury EH, Kuribara H, Hino A, Sultana P, Mikami O, Shimada N và cộng sự. Detection of corn intrinsic and recombinant DNA fragments and Cry1Ab protein in the gastrointestinal contents of pigs fed genetically modified corn Bt11. JOURNAL OF ANIMAL SCIENCE. 2003;81:2546-51. Prescott VE, Campbell PM, Moore A, Mattes J, Rothenberg ME, Foster PS và cộng sự. Transgenic Expression of Bean r-Amylase Inhibitor in Peas Results in Altered Structure and Immunogenicity. Agricultural and Food Chemystry. 2005;53:9023-30. Schubert D. A different perspective on GM food. Nature Biotechnology. 2002;20 (Nature Publishing Group):969. Randhawa GJ, Firke PK. Detection of transgenes in genetically modified soybean and maize using polymerase chain reaction. Indian Journal of Biotechnology 2006;5:510-3. Meric S, Cakir O, Turgut-Kara N, Ari S. Detection of genetically modified maize and soybean in feed samples. Genetics and molecular research : GMR. 2014 Feb 25;13(1):1160-8. PubMed PMID: 24634172. Fernandez S, Delobel CC, Geldreich A, Berthier G, Boyer F, Collonnier C và cộng sự. Quantification of the 35S Promoterin DNAExtracts from Genetically Modified Organisms Using Real-Time Polymerase Chain Reaction and Specificity Assessment on Various Genetically Modified Organisms, Part I: Operating Procedure. AOAC International. 2005;88:547-57. Steinbrecher RA. The CaMV 35S Promoter Government and Corporate Scientific Incompetence: Failure to assess the safety of GM crops. ECONEXUS. 2002. Feinberg M, Fernandez S, Delobel CC, Cassard S, Bertheau Y. Quantitation of 35S Promoterin Maize DNAExtracts from Genetically Modified Organisms Using Real-Time Polymerase Chain Reaction, Part 2: Interlaboratory Study. AOAC International. 2005;88:558-73. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N và cộng sự. Loop- mediated isothermal aplification of DNA. Nucleic Acids Research. 2000;28. AG Biotech. Hệ thống LAMP mới để phát hiện ra cây trồng GM. 2013. Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn. PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) CHO VIỆC PHÁT HIỆN NHANH VÀ CHÍNH XÁC VI KHUẨN Escherichia coli O157: H7. TẠP CHÍ SINH HỌC. 2012;34:343-6. Nkouawa A, Sako Y, Nakao M, Nakaya K, Ito A. Loop-mediated isothermal amplification Kỷ yếu Hội nghị khoa học 184 method for differentiation and rapid detection of Taenia species. Journal of clinical microbiology. 2009 Jan;47(1):168-74. PubMed PMID: 19005142. Pubmed Central PMCID: 2620829. Bùi Minh Trí. Xây dựng quy trình chẩn đoán bắp có chuyển các gene kháng sâu (CryIA [b]) và gene tăng cường chuyển hóa đường (Invertase) bằng kỹ thuật PCR. 2002. (Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh, Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh). Lin H-Y, Chiueh L-C, Shih DY-C. Detection of Genetically Modified Soybeans and Maize by the Polymerase Chain Reaction Method. Journal of Food and Drug Analysis. 2000;8(3):200-7. Zahradnik C, Kolm C, Martzy R, Mach RL, Krska R, Farnleitner AH và cộng sự. Detection of the 35S promoter in transgenic maize via various isothermal amplification techniques: a practical approach. Analytical and bioanalytical chemistry. 2014 Nov;406(27):6835-42. PubMed PMID: 24880871. Rabieia M, Mehdizadehb M, Rastegara H, Vahidic H, Alebouyeha M. Detection of Genetically Modified Maize in Processed Foods Sold Commercially in Iran by Qualitative PCR. Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 2013;12:25-30. Zhou X, Xing D, Tang Y, Chen WR. PCR-free detection of genetically modified organisms using magnetic capture technology and fluorescence cross-correlation spectroscopy. PloS one. 2009 Nov 26;4(11):e8074. PubMed PMID: 19956680. Pubmed Central PMCID: 2778010. Zhou D, Guo J, Xu L, Gao S, Lin Q, Wu Q và cộng sự. Establishment and application of a loop- mediated isothermal amplification (LAMP) system for detection of cry1Ac transgenic sugarcane. Scientific reports. 2014 May 09;4:4912. PubMed PMID: 24810230. Pubmed Central PMCID: 4014978. Zhen Z, Zhang M, Yu Y, Gao X, Zhu Y, Yan Y và cộng sự. Establishment of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) detection method for genetically modified maize MON88017. European Food Research and Technology. 2016;242(10):1787-93.