Xây dựng bộ kit phân biệt thịt heo và thịt bò bằng phương pháp sinh học phân tử

Kỷ yếu Hội nghị khoa học 171 XÂY DỰNG BỘ KIT PHÂN BIỆT THỊT HEO VÀ THỊT BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Hồ Viết Thế*, Ngô Thị Kim Anh, Phạm Thị Tuyết Trinh Nguyễn Hiếu Thuyên, Hồ Lê Quỳnh Trinh Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Tác giả liên lạc: thehv@cntp.edu.vn TÓM TẮT Xác định các loại thịt bằng phương pháp sinh học phân tử trở nên phổ biến trong những thập niên qua vì mức độ chính xác cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển bộ KIT phân biệt thịt heo và thịt bò dựa trên kỹ thuật multiplex PCR thông qua việc khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng trên hai gene ty thể là COI và ND5. Kết quả tối ưu hóa của phản ứng multiplex PCR đượ hoàn thiện thành bộ KIT. Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng bộ KIT đạt độ chính xác cao và có thể áp dụng cả ở thịt tươi và các sản phẩm thịt đã qua chế biến. Từ khóa: Thịt bò, thịt heo, multiplex PCR, KIT. DEVELOP MOLECULAR BIOLOGY- BASED KIT TO DISTINGUISH BETWEEN PORK AND BEEF Ho Viet The*, Ngo Thi Kim Anh, Pham Thi Tuyet Trinh Nguyen Hieu Thuyen, Ho Le Quynh Trinh Ho Chi Minh city University of Food Industry *Corresponding Author: thehv@cntp.edu.vn ABSTRACT Identifying meat by molecular markers has become ubiquitous in the past decades. In this study, multiplex PCR –based detectionn KIT was developed to distinguish between pork and beef relying on the presence of specific DNA fragments on two mitochondrial genes consisting of COI and ND5. After optimization, the obtained KIT could differentiate beef from pork with high accuracy and this KIT is also applicable for identifiying both raw meats and meat-proccessed products. Keywords: Beef, pork, multiplex PCR, KIT. MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển về kinh tế, nhu cầu sử dụng thực phẩm chất lượng cao cũng tăng theo, đặc biệt trong đó có thịt bò [1]. Tuy nhiên, hiện nay nhiều trường hợp người buôn bán vì lợi nhuận đã dùng hóa chất để làm giả thịt bò từ nguyên liệu là các loại thịt khác [2]. Điều này gây ảnh hưởng đến việc kinh doanh, sản xuất cũng như sức khỏe người tiêu dùng. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp phân biệt thịt heo và thịt bò một cách nhanh chóng, chính xác phục vụ người tiêu dùng cùng các nhân viên kiểm tra thực phẩm là hết sức cần thiết. Những phương pháp phân biệt thịt heo, thịt bò hiện nay chủ yếu dựa trên màu sắc, mùi vị, độ dai của thịt bò nhưng đối với những loại thịt bò tẩm hóa chất hay các sản phẩm đã qua chế biến thì phương pháp trên cho độ chính xác thấp hoặc không thể thực hiện [2]. Trong những thập niên gần đây, nhờ sự phát triển của sinh học phân tử nên các phương pháp phân biệt thịt dựa vào DNA cho kết quả chính xác hơn. Trong đó, phương pháp PCR dễ thực hiện, cho kết quả chính xác với độ nhạy cao trong thời gian ngắn [3]. Năm 1999, nhóm nghiên cứu của Matsunaga đã phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, cừu, dê, ngựa, gà) từ thịt tươi và thịt chế biến bằng kỹ thuật multiplex PCR [4]. Gần đây, Kitpipit và cộng sự đưa ra những bước tiến mới trong việc phát hiện các loại thịt bằng cách thực hiện PCR trực tiếp mà không cần tách chiết DNA trước với primer được thiết kế từ cytochrome ty thể (cyt b), cytochrome oxidase I (COI), và 12s rRNA [5]. Phương pháp hiện đại và chính xác nhất hiện nay để phát hiện và phân biệt các loại thịt là PCR định lượng [6], tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền nên chưa được sử dụng phổ biến. Một bước cải tiến mới của phương pháp PCR là Kỷ yếu Hội nghị khoa học 172 multiplex PCR, đây là kỹ thuật giúp nhanh chóng phát hiện nhiều gen mục tiêu trong cùng một phản ứng từ đó rút ngắn được thời gian đưa ra kết quả cũng như tận dụng được các thiết bị PCR truyền thống có mặt phổ biến ở các phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này chúng tôi xây xây dựng bộ KIT để phân biệt thịt heo và thịt bò dựa vào kỹ thuật multiplex PCR để giúp quá trình phân biệt các loại thịt này trở nên đơn giản hơn. Kết quả này hi vọng góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại đối với sản phẩm thịt tươi cũng như các sản phẩm chế biến từ thịt. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Mẫu được thu thập từ lò mổ, siêu thị và các chợ ở trên địa bàn quận Tân Phú, thành phố Hồ Chí Minh. Các sản phẩm chế biến từ hai loại thịt này được thu thập tại các chợ và siêu thị. Sau khi thu thập, mẫu được mã hóa bảo quản ở -80 oC đến khi sử dụng. Phương pháp Mẫu được rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, tiến hành tách chiết DNA theo dẫn liệu của Lương Quý Phương [7]. Tuy nhiên, chúng tôi thay đổi thời gian ly giải thịt từ 30 phút lên 1 giờ và tủa DNA bằng isopropan thay vì sử dụng ethanol tuyệt đối. DNA sau khi tách chiết được định tính bằng phương pháp điện di 110V trong 20 phút và định lượng bằng phương pháp đo quang phổ. Sau đó, tiến hành phản ứng PCR với các cặp primer được thiết kế dựa trên đoạn gene COI đối với heo và đoạn gene ND5 đối với bò (Bảng 1). Các cặp primer đã được sử dụng trong nghiên cứu của các nhóm Spychaj [8] và Motalib [9]. Bảng 1. Trình tự các primer xuôi và ngược Thịt Trình tự (5’ – 3’) Gene Độ dài sản phẩm (bp) Tài liệu tham khảo Heo 5’- GGAGCAGTGTTCGCCATTAT-3’ 5’- TTCTCGTTTTGATGCGAATG-3’ COI 294 [8] Bò 5’- GGTTTCATTTTAGCAATAGCATGG-3’ 5’- GTCCAATCAAGGGTATGTTTGAG-3’ ND5 106 [9] Phản ứng PCR được thực hiện theo từng cặp primer với từng loại DNA mẫu thịt khác nhau của heo và bò. Sau đó chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng PCR, bao gồm các nồng độ 50 ng/µl, 100 ng/µl, 150 ng/µl và nồng độ primer tối ưu bao gồm các nồng độ 5 µM, 10 µM, 15 µM cho mỗi phản ứng. Sau khi tối ưu hóa các nồng độ DNA và nồng độ primer ở thí nghiệm trước, chúng tôi thử nghiệm tính chuyên biệt của các cặp primer trong phản ứng multiplex PCR. Tiếp theo, chúng tôi tối ưu hóa nồng độ các cặp primer cho phản ứng multiplex PCR và tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp ở các nhiệt độ 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC. Tổng thể tích phản ứng PCR là 20 µl, bao gồm: MyTaqTM HS Mix White 2X 8 µl, primer 1 µl, DNA mỗi loại thịt 1 µl và nước. Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau: biến tín ban đầu 94oC - 1 phút; 35 chu kỳ: 94oC - 1 phút, 54oC - 45 giây, 72oC - 1 phút; kéo dài kết thúc 72oC - 5 phút . Sau đó, quy trình multiplex PCR hoàn thiện được sử dụng để phát hiện thịt heo và thịt bò trong các mẫu thực phẩm chế biến từ thịt. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả tách chiết DNA Kết quả tách chiết DNA từ thịt tươi được thể hiện ở Hình 1. Các band DNA thu được sau khi ly trích rõ ràng, nồng độ khá cao. Đối với các mẫu DNA tách chiết từ thực phẩm được trình bày ở Hình 2. Kết quả điện di cho thấy DNA bị đứt gãy và nhiễm tạp nhiều nên các band mờ, kéo các vạch dài. Nguyên nhân có thể là do trong các sản phẩm này chứa nhiều bột, các chất phụ gia, ít thịt và đã qua chế biến nên gây cản trở cho việc tách chiết. Tuy nhiên, nồng độ DNA thu được khá cao, chứng tỏ quy trình có thể tách chiết được DNA trong các sản phẩm từ thịt. DNA được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR và multiplex PCR (Hình 7 và Hình 8). Kỷ yếu Hội nghị khoa học 173 Hình 1a. Kết quả tách chiết DNA từ thịt tươi (H1, H2: mẫu thịt heo tươi; B1, B2: mẫu thịt bò tươi) Hình 1b. Kết quả tách chiết DNA từ các sản phẩm thịt đã qua chế biến (XH, XB: xúc xích heo, bò; CH: chả heo; BV: bò viên) Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer và nồng độ DNA cho mỗi loại thịt Nồng độ DNA và nồng độ primer có ảnh hưởng quan trọng đến tính chính xác, độ nhạy của phản ứng PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Bên cạnh đó, vào năm 2013 Marin và cộng sự cũng đã tiến hành tối ưu hóa nồng độ primer để thu được kết quả PCR tốt nhất [10]. Nghiên cứu của Jonker và cs (2008) chỉ ra rằng nồng độ DNA trong khoảng 50 đến 250 ng không gây ra các phản ứng chéo giữa các DNA động vật. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các nồng độ primer và nồng độ DNA cho phản ứng PCR phát hiện DNA thịt heo và thịt bò. Kết quả được trình bày ở Hình 2 và Hình 3. Hình 2. Kết quả tối ưu hóa nồng độ DNA và nồng độ primer cho phản ứng PCR phát hiện DNA heo. (M: thang chuẩn DNA) Kỷ yếu Hội nghị khoa học 174 Hình 3. Kết quả tối ưu hóa nồng độ DNA và nồng độ primer cho phản ứng PCR phát hiện DNA bò (M: thang chuẩn DNA) Từ kết quả quan sát được ở Hình 2 và Hình 3 cho thấy các sản phẩm khuếch đại chuyên biệt cho heo và bò có kích thước phù hợp với các nghiên cứu trước [8,9]. Chúng tôi nhận thấy nồng độ primer có ảnh hưởng lớn tới kết quả phản ứng PCR vì ở cùng 1 nồng độ DNA nhưng cho những sản phẩm khuếch đại có độ sáng khác nhau tăng dần theo nồng độ primer. Đối với phản ứng phát hiện thịt heo, nồng độ DNA ở 5 µM cho kết quả tốt nhất, trong khi đó nồng độ 10 µM phù hợp với việc phát hiện thịt bò hơn. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn nồng độ tối ưu cho phản ứng như sau: nồng độ DNA 50 ng/µl cho hai loại thịt và nồng độ primer heo, bò lần lượt là 5 µM, 10 µM để thực hiện phản ứng multiplex PCR cho thịt heo và thịt bò ở thí nghiệm tiếp theo. Kết quả thử nghiệm tính chuyên biệt các cặp primer trong phản ứng multiplex PCR Trong phản ứng multiplex PCR việc kết hợp nhiều primer và nhiều DNA sẽ dễ dẫn đến trường hợp nhiễm chéo hay còn gây ra hiện tượng dương tính giả nên việc tìm ra được cặp primer chuyên biệt cho mỗi loại DNA là rất quan trọng. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ chuyên biệt trong phản ứng multiplex của hai cặp primer đã chọn. Kết quả được trình bày ở Hình 4. Hình 4. Kết quả multiplex PCR chuyên biệt (N: mẫu đối chứng âm; 1: primer heo, primer bò và DNA heo; 2: primer heo, primer bò và DNA bò; 3: primer heo, primer bò, DNA heo và DNA bò; M: thang chuẩn DNA) Kết quả cho thấy các mẫu không bị nhiễm chéo, các band sản phẩm khuếch đại rõ ràng, kích thước tương ứng với các nghiên cứu trước [8,9]. Các cặp primer có tính chuyên biệt cao có thể đáp ứng cho các phản ứng multiplex PCR phân biệt thịt heo và thịt bò. Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR Do khi kết hợp nhiều primer với các nồng độ không phù hợp trong một phản ứng multiplex PCR sẽ xảy ra sự khuếch đại không đồng đều giữa các locus, một số sản phẩm khuếch đại có thể khó quan sát được sau phản ứng [11]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ primer cho phản ứng này, kết quả được trình bày ở Hình 5. Kỷ yếu Hội nghị khoa học 175 Hình 5. Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex PCR phát hiện DNA heo và DNA bò (M: thang chuẩn DNA) Quan sát Hình 5, chúng tôi thấy có sự khác biệt khi kết hợp các nồng độ primer khác nhau trong một phản ứng multiplex PCR. Kết quả này cho thấy cần có nồng độ primer tương ứng khi kết hợp các primer trong một phản ứng multiplex PCR. Trước đó, nhóm nghiên cứu của Markoulatos cũng đã sử dụng các nồng độ primer khác nhau trong một phản ứng multiplex PCR [12]. Ở Hình 5, các mẫu ở giếng số 5, 6, 8, 9 cho hai sản phẩm khuếch đại heo và bò đều sáng rõ và dễ quan sát. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn nồng độ primer heo 5 µM, nồng độ primer bò 10 µM (giếng số 5) để thực hiện phản ứng multiplex PCR heo, bò và viết hướng dẫn sử dụng cho bộ KIT. Bên cạnh đó, nhiệt độ bắt cặp cũng là một yếu tố quan trọng trong multiplex PCR vì mỗi cặp primer có nhiệt độ bắt cặp khác nhau nên khi kết hợp trong một phản ứng cần tìm được một nhiệt độ phù hợp để kết quả của phản ứng là tốt nhất [11]. Nên chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR heo và bò. Kết quả được trình bày ở Hình 6. Hình 6. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR heo, bò (M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC) Tại Hình 6, kết quả thu ở tất cả các nhiệt độ bắt cặp khảo sát đều cho sản phẩm khuếch đại rõ, sáng đều như nhau. Nên ở các nhiệt độ đã khảo sát không gây ra sự thay đổi cho sản phẩm multiplex PCR heo và bò. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ bắt cặp là 57oC làm nhiệt độ thích hợp nhất cho phản ứng multiplex PCR heo và bò. Vì ở nhiệt độ bắt cặp cao, khả năng xảy ra bắt cặp nhầm sẽ thấp hơn, ngoài ra quy trình PCR cũng sẽ tiến hành nhanh hơn do mức dao động giữa nhiệt độ biến tính và nhiệt độ bắt cặp thấp hơn. Thử nghiệm trên một số sản phẩm thực phẩm Chúng tôi thử nghiệm với các mẫu thực phẩm được lấy từ các khu chợ và siêu thị khu vực quận Tân Phú, thành phố Hồ Chí Minh. Các mẫu được thử: xúc xích heo, chả quế, xúc xích bò và bò viên. Kết quả tách DNA được thể hiện ở Hình 1b. Qua đây cho thấy rằng DNA của sản phẩm từ thịt bị đứt gãy làm chất lượng giảm đi rõ rệt so với DNA ly trích từ thịt tươi (Hình 1a), tuy nhiên kết quả ly trích DNA ly trích từ sản phẩm từ thịt qua chế biến vẫn phù hợp để thực hiện phản ứng PCR phát hiện riêng biệt từng loại thì (Hình 7) hoặc phản ứng muliplex PCR để phát hiện cùng lúc 2 loại thịt (Hình 8). Kỷ yếu Hội nghị khoa học 176 Hình 7. Kết quả PCR đơn của DNA từ mẫu thực phẩm đã qua chế biến (M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, XB: xúc xích bò, BV: bò viên, XH: xúc xích heo, CH: chả heo) Hình 8. Kết quả multiplex PCR của DNA từ mẫu thực phẩm đã qua chế biến (M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, XB: xúc xích bò, BV: bò viên, XH: xúc xích heo, CH: chả heo) Qua kết quả ở Hình 8, chúng tôi nhận thấy trong các sản phẩm xúc xích heo, bò viên và xúc xich heo có sự hiện diện của DNA cả bò và heo, chứng tỏ có sự lẫn tạp trong thành phần nguyên liệu hoặc sự pha trộn của các loại thịt này. Đối với mẫu xúc xích bò và bò viên là hành vi gian dối trong kinh doanh sản xuất vì có sự sai khác với các nguyên liệu được in trên bao bì, đây là điều cần phải thanh kiểm tra kỹ hơn, nhất là ở các mặt hàng xuất khẩu sang các nước không sử dụng thịt heo như các nước đạo Hồi. Duy nhất mẫu chả heo là không phát hiện diện DNA từ bò, chứng tỏ quy trình sản xuất sản phẩm này đạt tiêu chuẩn chất, và điều này cũng có thể dễ hiểu vì đây là sản phẩm của một công ty thực phẩm lớn trên thị trường. Từ quy trình trên, chúng tôi phát triển thành bộ KIT phân biệt thịt heo và thịt bò (Hình 9). Hình 9. Bộ kít phát hiện và phân biệt thịt heo và thịt bò dựa trên kỹ thuật multiplex- PCR. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình multiplex PCR để phân biệt thịt heo và thịt bò. Quy trình này cũng có khả năng phát hiện Kỷ yếu Hội nghị khoa học 177 sự có mặt của thịt heo, thịt bò trong một số sản phẩm thực phẩm đã qua chế biến. Qua nghiên cứu này cho thấy tiềm năng rất lớn trong việc sử dụng sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật multiplex PCR để phát hiện thịt heo và thịt bò trong các nguyên liệu thực phẩm và sản phẩm chế biến từ thịt. Với bộ KIT này, chúng tôi cũng đang tiếp tục hoàn thiện để sản phẩm này có thể sớm triển khai vào thực tế. TÀI LIỆU THAM KHẢO Phòng thương mại và công nghiệp Việt Nam, 2016, wesite: truong/nganh-thit-viet-nam-%E2%80%93-co-hoi-va-thach-thuc-tt6357.html. Martín I, García T, Fajardo V, López-Calleja I, Rojas M, Pavón MA, Hernández PE, González I, Martín R. (2007). Technical note: detection of chicken, turkey, duck, and goose tissues in feedstuffs using species-specific polymerase chain reaction. Meat Science 76: 721-729. Matsunaga, T., Chikuni K., Tanabe R. et al. (1999). A quick and simple method for the identification of meat species and meat product by PCR assay. Meat science 51 (2): 143-148. Kitpipit, T., Thanakiatkrai, P., & Chotigeat, W. (2013). Direct PCR-FINS: Wildlife species identification without DNA extraction. Forensic Science International, Genetics Supplement Series. Iwobi, A., Sebah, D., Kraemer, I. et al. (2015). "A multiplex real-time PCR method for the quantification of beef and pork fractions in minced meat". Food Chemistry 169: 305-313. Lương Quý Phương (2006), Sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR phát hiện gene halothan trên heo, Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Spychaj A, Marlena Szalata, Ryszard Słomski and Edward Pospiech (2015). Identifi cation of Bovine, Pig and Duck Meat Species in Mixtures and in Meat Products on the Basis of the mtDNA Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Gene Sequence, Pol. J. Food Nutr. Sci., 66(1): 31–36. Motalib Hossain M. A., Eaqub Ali, Sharmin Sultana, Asing, Sharmin Quazi Bonny, Md. Abdul Kader and M. Aminur Rahman (2017). Quantitative Tetraplex Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay with TaqMan Probes Discriminates Cattle, Buffalo, and Porcine Materials in Food Chain, Journal of Agricultural and Food Chemistry 65(19):3975-3985. Marín A, Takafumi Fujimoto, Katsutoshi Arai (2013). Rapid species identification of fresh and processed scallops by multiplex PCR, Food Control, 32: 472-476. Henegarui .O, Heerema .N.A, Dlouhy.S.R, Vance .G.H và Vogt .P.H (1997). Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques Journal, 23: 504-511.