Xác định hoạt lực thuốc kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật

XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC THUỐC KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ VI SINH VẬT Hoạt lực kháng sinh được thể hiện bằng khả năng ức chế một loại chủng chỉ thị nào đó, ở điều kiện thích hợp. Sự giảm hoạt tính sinh học của kháng sinh được thể hiện trên chủng chỉ thị, rất khó phát hiện bằng phương pháp phân tích hoá học, vì vậy phương pháp vi sinh vật thường giữ một vai trò quan trọng trong việc đánh giá khả năng mất hoạt lực của kháng sinh, nhất là những loại kháng sinh có cấu trúc phức tạp, hoặc thành phần gồm một hỗn hợp kháng sinh cùng họ mà mức độ hoạt lực chênh lệch nhau không lớn lắm. Phương pháp vi sinh vật xác định hoạt lực của một kháng sinh bằng cách so sánh tác động ức chế sự phát triển của một loại vi sinh vật (được gọi là chủng chỉ thị) bởi những độ pha loãng đã biết của kháng sinh mang thử (chưa biết rõ hoạt lực) với tác động ức chế bởi nồng độ đã biết của kháng sinh đối chiếu (chất chuẩn đã biết rõ hoạt lực). Thử nghiệm phải dùng phương pháp phân tích thống kê để đánh giá những số liệu thu được. Nếu áp dụng mô hình đường thẳng song song, hai đường log liều - đáp ứng của chất chuẩn và chế phẩm thử phải song song với nhau và phải tuyến tính trong khoảng liều đã dùng. Hai phương pháp thường được sử dụng trong kiểm nghiệm là phương pháp khuếch tán dùng môi trường thạch và phương pháp đo độ đục dùng môi trường lỏng. Phương pháp thứ nhất dựa vào sự khuếch tán của kháng sinh từ chỗ chứa qua lớp thạch đặc ở hộp Petri hoặc khay vào khoảng phát triển của vi sinh vật tạo ra một vòng ức chế hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống trụ, lỗ thạch) dung dịch kháng sinh. Phương pháp ống nghiệm dựa vào độ đục của canh khuẩn, biết được sự ức chế phát triển của vi khuẩn gây ra bởi một loạt dung dịch kháng sinh trong môi trường lỏng là môi trường thích hợp đối với sự phát triển của vi sinh vật khi không có kháng sinh. Phương tiện và dụng cụ Tất cả các dụng cụ phải được làm sạch hoàn toàn trước và sau mỗi lần thí nghiệm. Những dụng cụ thuỷ tinh và những đồ đựng khác dùng trong thí nghiệm phải được loại hết vi khuẩn và chất ảnh hưởng. Các dụng cụ dùng để giữ và chuyển chủng chỉ thị cần làm sạch cẩn thận và tiệt khuẩn bằng sức nóng khô hoặc hơi nước ở điều kiện thích hợp. Điều kiện nhiệt độ: Khi nuôi cấy chủng chỉ thị và chế tạo nhũ dịch cấy truyền, cần thực hiện trong môi trường đảm bảo nhiệt độ qui định. Đối với phương pháp đo độ đục, cần kiểm tra chặt chẽ buồng điều khiển nhiệt độ sao cho nhiệt độ quanh các ống nghiệm phải đồng đều và phải đạt được nhiệt độ cần thiết trong ống nghiệm. Nên dùng điều nhiệt bằng nước luân chuyển sẽ tốt hơn điều nhiệt bằng không khí. Máy đo quang phổ: Được dùng để đo sự truyền qua hoặc hấp thụ trong khoảng sóng khá hẹp, do đó cần có máy đo quang thích hợp có thể thay đổi được bước sóng hoặc dùng dùng kính lọc 650 nm hoặc 580 nm để đo nhũ dịch nuôi cấy đã pha chế và dùng kính lọc 530 nm để đo độ hấp thụ ánh sáng ở phương pháp đo độ đục. Dùng canh thang đã tiến hành như mẫu nhưng thêm ngay dung dịch formaldehyd để chỉnh máy cho độ hấp thụ về điểm “ 0 ” Dụng cụ thí nghiệm: - Phương pháp khuếch tán: Dùng các khay hoặc đĩa Petri bằng thuỷ tinh hoặc plastic, đạt tiêu chuẩn bằng phẳng. Đĩa Petri có hai loại, cỡ nhỏ đường kính 100 mm, cỡ lớn đường kính lớn hơn 160 mm. Các khay thí nghiệm đã được tiêu chuẩn hoá, bằng kính hoặc plastic với kích thước 25 x 25 cm (loại vuông) hoặc 28,8 x 19,8 cm (loại chữ nhật). Có thể sử dụng những chất liệu thích hợp đạt tiêu chuẩn bằng phẳng. Ống trụ bằng thép không rỉ, bằng thuỷ tinh, hoặc bằng sứ, có kích thước như sau: Đường kính ngoài 8,0 mm; đường kính trong 6,0 mm; cao 10,0 mm. Vật liệu dùng làm ống trụ phải là loại trơ, riêng đối với kháng sinh nhạy cảm với ánh sáng phải dùng vật liệu có pha màu nâu. Khi dùng phải làm sạch cẩn thận, loại hết cặn, khử khuẩn. Đôi khi phải rửa bằng acid như dung dịch acid nitric 2M, hoặc acid sulfocromic. Dụng cụ dùng cho phương pháp đo độ đục: Dùng các ống nghiệm loại 16 x 125 mm hoặc 18 x 150 mm bằng thuỷ tinh có cùng chiều dài, đường kính và độ dày, bề mặt phải không có vết xước, không dây bẩn. Khi dùng, ống nghiệm phải sạch hoàn toàn, đảm bảo không còn vết kháng sinh hoặc vết các chất tẩy rửa và phải tiệt khuẩn trước khi dùng. Môi trường, dung môi và chất pha loãng Phải dùng các chất đạt từ mức tinh khiết hoá học trở lên để pha chế. Môi trường Dưới đây là công thức môi trường cần thiết dùng cho kiểm nghiệm kháng sinh. Các loại môi trường này có thể được thay thế bằng môi trường khô tương ứng hoặc bằng một loại môi trường thúc đẩy vi sinh vật phát triển tốt hơn mà cùng cho một đường đáp ứng tương tự. Pha môi trường bằng cách hoà tan thành phần trong công thức vào một phần nước, sau đó thêm nước vừa đủ một lít. Dùng dung dịch acid hydrocloric 1N hoặc dung dịch natri hydroxyd 1N để điều chỉnh môi trường sao cho sau khi tiệt khuẩn ở 121oC trong 15 phút có pH như ghi trong công thức. Thời gian cần cho việc tiệt khuẩn có thể kéo dài tới 30 phút đối với những môi trường có thể tích lớn hơn 500 ml. Môi trường số 1 Pepton khô Casein pancreatic Cao men bia Dextrose monohydrat Thạch Nước cất pH: 6,0 đến 7,0 6,0 g 4,0 g 3,0 g 1,0 g 20,0 g 1000 ml Môi trường số 2: Pepton khô Cao men bia Cao thịt Thạch Nước cất 6,0 g 3,0 g 1,5 g 20,0 g 1000 ml pH: 6,0 đến 7,0 Môi trường số 3: Pepton khô Cao men bia Cao thịt Dextrose monohydrat Dikali hydrophosphat (K2HPO4) Kali dihydrophosphat (KH2PO4) Natri clorid Nước cất pH: 6,0 đến 7,0 5,0 g 1,5 g 1,5 g 1,0 g 3,58 g 1.32 g 3,5 g 1000 ml Môi trường số 4: Giống như môi trường số 2 nhưng có pH là 7,0 đến 8,0. Môi trường số 5: Giống như môi trường số 1, nhưng có pH là 7,8 đến 8,0. Môi trường số 6: Casein pancreatic Bột đậu tương papaic Natri clorid Dextrose monohydrat Dikali hydrophosphat (K2HPO4) Thạch Polysorbat 80 Nước cất pH : 7,0 đến 7,3 17,0 g 3,0 g 5,0 g 2,5 g 2,5 g 15,0 g 10,0 ml 1000 ml Chú ý: Polysorbat 80 được thêm vào một lượng dung dịch nóng của các thành phần khác trước khi thêm nước vừa đủ dung tích cần thiết. Môi trường số 7: Pepton khô Cao men bia Cao thịt Dextrose monohydrat Natri clorid Thạch Nước cất pH: 6,0  0,2 9,4 g 4,7 g 2,4 g 10,0 g 10,0 g 20,0 g 1000 ml Dung môi và chất pha loãng Dung môi và chất pha loãng dùng trong thí nghiệm phải không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Chúng được dùng để pha các dung dịch theo yêu cầu trong từng thí nghiệm. Các loại dung môi như nước vô khuẩn, acid hydrocloric, ethanol, dimethylformamid và các dung dịch đệm có dải pH khác nhau hoặc các loại khác tuỳ thuộc vào từng kháng sinh riêng biệt (bảng 2). Các dung dịch đệm phosphat được chế tạo bằng cách hoà tan lượng dikali hydrophosphat và kali dihydrophosphat (theo bảng 1) vào trong nước vừa đủ để được 1000 ml. Sau đó điều chỉnh với acid phosphoric 18 N hoặc natri hydroxyd 18 N đến pH cần thiết. Giá trị pH chỉ ra trong bảng là pH của dung dịch sau khi đã tiệt khuẩn. Bảng 1. Số dung dịch đệm Dikali hydrophospha t K2HPO4 (g) Kali dihydrophospha t KH2PO4 (g) pH điều chỉnh đến 1 2 3 4 5 6 2,0 16,73 0 20,0 35,0 13,6 8,0 0,523 13,61 80,0 0 4,0 6,0  0,1 8,0  0,1 4,5  0,1 6,0  0,1 10,5  0,1 7,0  0,2 Chất đối chiếu và đơn vị Chất đối chiếu được dùng trong thử nghiệm là những chất có hoạt lực được xác định chính xác so với chuẩn quốc tế hoặc chất đối chiếu quốc tế tương ứng. Hoạt lực của một kháng sinh được thể hiện bằng đơn vị quốc tế. Một đơn vị quốc tế là hoạt lực đặc biệt chứa trong một lượng (tính theo cân nặng) của chuẩn sinh học quốc tế tương ứng hoặc chế phẩm đối chiếu sinh học quốc tế. Từng thời kỳ, Hội đồng về chuẩn sinh học của Tổ chức y tế thế giới sẽ có chỉ dẫn và qui định chính xác cho mỗi chuẩn quốc tế . Trong một vài trường hợp, định nghĩa số đơn vị quốc tế có thể bao gồm một tổng lượng của một vài nguyên liệu vì thực tế khó cân một lượng nhỏ dù chính xác của chất chuẩn sinh học quốc tế hoặc chất đối chiếu sinh học quốc tế. Hoạt lực của một vài chất kháng sinh có thể được biểu thị bằng g. g hoạt lực không nhất thiết tương ứng với khối lượng của chất kháng sinh vì nó không thể bao hàm toàn bộ thực thể hoá học tinh khiết riêng của từng kháng sinh đó. Chủng chỉ thị và dịch cấy truyền Các chủng chỉ thị dùng phải nhạy cảm, phù hợp với từng kháng sinh, theo qui định ở bảng 2. Có thể dùng chủng chỉ thị khác với chủng chỉ thị giới thiệu trong chuyên luận này miễn sao chủng phải nhạy cảm với kháng sinh cần định lượng. Chế tạo dịch cấy truyền Chế tạo nhũ dịch vi khuẩn không có nha bào Escherichia coli Klebsiella pneumoniae (không tạo vỏ ) Micrococcus luteus Saccharomyces cerevisiae Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus faecium Dùng chủng chỉ thị mới phát triển trên thạch nghiêng sau 24 giờ, cấy truyền lại lên mặt một ống thạch nghiêng khác hoặc một bề mặt thạch rộng (như trong bình Roux) của môi trường số 1 (Saccharomyces cerevicae dùng môi trường số 8; Streptococcus faecium dùng môi trường số 3) ủ ở 32 - 350C trong 24 giờ (riêng với Klebsiella pneumoniae và Streptococcus faecium ủ ở 370C) với Saccharomyces cerevisiae ủ ở 300C. Thu vi khuẩn đã phát triển trên bề mặt môi trường bằng nước muối sinh lý, rồi hoà loãng với cùng một chất hoà loãng tới độ đục thích hợp để được đáp ứng thích hợp trong phương pháp đo độ đục, hoặc để tạo ra vùng ức chế rõ ràng, sắc nét thuận lợi khi đo trong phương pháp khuếch tán. Thí dụ: Pha loãng hỗn dịch vi khuẩn tới nồng độ sao cho khi đo ở bước sóng 650 nm, cốc đo dày 1cm, độ truyền qua T = 50%, ở bước sóng 580 nm T = 25%, hay cho vòng vo khuẩn rõ, sắc net có đường kính 13 mm. Nhũ dịch vi khuẩn chế tạo như trên đem bảo quản ở nhiệt độ dưới 40C có thể sử dụng trong 2 tuần. Chế tạo nhũ dịch nha bào Bacillus cereus Bacillus pumilus Bacillus subtilis Cho chủng vi khuẩn mọc qua đêm trên ống thạch nghiêng môi trường số 1 ở 370C (riêng với Bacillus cereus nuôi ở 300C). Thu vi khuẩn đã phát triển trên mặt thạch bằng nước muối sinh lý, rồi chuyển sang một bề mặt thạch rộng hơn (như trong bình Roux) của môi trường số 1, trong môi trường này đã thêm vào dung dịch 0,001% (kl/tt) mangan sulfat (MnSO4) để giúp thúc đẩy sự hình thành nha bào. Nhũ dịch vi sinh vật được trải cho phủ kín bề mặt môi trường bằng cách cho vào bề mặt thạch một vài viên bi thuỷ tinh vô khuẩn. Đem ủ ở 370C (riêng với Bacillus cereus ủ ở 300C) trong 7 ngày. Dùng nước cất vô khuẩn rửa vi khuẩn đã mọc (chủ yếu là nha bào) đem hoà loãng tới nồng độ thích hợp, thí dụ khoảng 107 - 108 nha bào trong 1ml, đun cách thủy nhũ dịch nha bào ở nhiệt độ 70oC trong 30 phút. Dùng test phiến kính để kiểm tra khả năng sống của nha bào. Xác định lượng nhũ dịch nha bào để cho vào 100 ml môi trường định lượng có thể tạo được vùng ức chế rõ ràng, sắc nét. Nhũ dịch nha bào có thể giữ lâu ở nhiệt độ 40C. Các loại thử nghiệm Thử nghiệm hai liều và ba liều. Phương pháp khuếch tán Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Dung dịch chuẩn nồng độ đã biết và dung dịch thử được coi như xấp xỉ nồng độ dung dịch chuẩn. Các dung dịch chuẩn và thử này ban đầu được pha vào dung môi thích hợp để được những dung dịch gốc. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng dung môi hoặc dung dịch đệm vô khuẩn đến nồng độ thích hợp, có pH thích hợp cho từng loại kháng sinh ( xem bảng 2). Để xác định hiệu lực của kháng sinh, dùng ba liều khác nhau của chuẩn (S1, S2, S3) mang so sánh với ba liều khác nhau của thử (U1, U2, U3) có hoạt lực được coi như dung dịch chuẩn. Nồng độ được pha theo cấp số nhân, thí dụ pha một loạt độ pha loãng theo tỷ lệ 2 : 1 hoặc 4 : 1. Nếu quan hệ giữa logarit nồng độ kháng sinh và đường kính vùng ức chế đã chỉ ra gần như thẳng với hệ số đã dùng thì có thể dùng định lượng thường xuyên bằng cách chỉ dùng hai nồng độ chuẩn (S1, S2) và hai nồng độ thử (U1, U2) - Thử nghiệm hai liều. Trong trường hợp có tranh chấp bắt buộc phải sử dụng định lượng ba liều. Chuẩn bị cấy truyền Các thử nghiệm có thể tiến hành trên những đĩa Petri hoặc khay bằng phẳng. Đổ vào hộp Petri hoặc khay môi trường thích hợp đã cấy truyền chủng chỉ thị thích hợp cho từng kháng sinh. Lớp môi trường này thường có độ dày 3 - 4 mm (riêng với amphotericin B nystatin độ dày là 1 - 2 mm, đối với bleomycin, mithramycin độ dày 2 - 3 mm). Thạch dinh dưỡng có thể được đổ thành một lớp hoặc hai lớp (gồm lớp nền không có vi khuẩn và lớp gieo cấy), nên chọn nồng độ nhũ dịch cấy vào môi trường sao cho tạo được vùng ức chế sắc nét nhất tương ứng với các liều lượng của kháng sinh. Dùng nhũ dịch chủng chỉ thị đã chế tạo như phần trên, thường cấy vào môi trường với nồng độ 1 ml chủng cho 100 ml môi trường là thích hợp. Khi nhũ dịch chủng là loại không có nha bào, thường phải cấy vào môi trường thạch đã đun chảy hoàn toàn và để nguội đến 45 - 500C. Trường hợp nhũ dịch chủng là nha bào, nhiệt độ cho phép khi cấy tối đa là 65 - 700C. Dùng một lượng thích hợp môi trường đã cấy chủng chỉ thị, rót một cách vô khuẩn vào đĩa petri hoặc khay kính (trên đĩa thạch hoặc khay đã có thạch nền hoặc không tuỳ theo yêu cầu) để được một lớp môi trường có độ dày thích hợp, dàn trải nhanh và đậy nắp ngay. Trong khi đợi thạch đông đặc, đặt khay kính hoặc hộp petri trên một tấm kính để tạo một mặt phẳng giúp cho môi trường trên khay hoặc hộp có độ dày đồng nhất. Những môi trường đã chuẩn bị được để khô ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi sử dụng (riêng đối với colistin và colistin sulfomethat natri, đĩa petri hoặc khay kính đã cấy truyền phải để ở tủ lạnh 40C trong vài giờ). Tiến hành thử: Đối với thử nghiệm 3 liều, dùng 6 ống trụ vô khuẩn đặt lên mặt thạch đã cấy truyền trong một hộp petri (với thử nghiệm 2 liều dùng 4 ống trụ cho mỗi hộp). Có thể thay các ống trụ bằng cách dùng dụng cụ đục lỗ đã tiệt khuẩn, đục vào môi trường thạch để tạo ra những lỗ thạch đường kính 6 - 8 mm (hoặc thay bằng những khoanh giấy tẩm kháng sinh). Phân phối các dung dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử trên mỗi hộp Petri hay khay vuông sao cho phù hợp với kiểu bố trí thí nghiệm đã chọn (xem phụ lục 13.10). Việc bố trí ống trụ, lỗ khoan, hoặc khoanh giấy trên mặt thạch phải sao cho các vùng ức chế không bị trùm lên nhau. Dùng pipet nhỏ vào ống trụ, hoặc lỗ thạch một lượng bằng nhau các dung dịch kháng sinh. Nếu dùng các khoanh giấy phải tiêu chuẩn hoá trước thể tích chính xác chất lỏng cho mỗi khoanh giấy. Giữ hộp petri hoặc khay ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 - 4 giờ tuỳ theo đặc tính của mỗi kháng sinh. Đối với những kháng sinh nhạy cảm với nhiệt độ, phải được giữ ở nhiệt độ 40C để sự khuếch tán của kháng sinh vào môi trường xẩy ra chậm và làm giảm đến mức tối thiểu hiệu quả của sự biến đổi theo thời gian giữa các dung dịch khác nhau. Đối với colistin và colistin sulfomethat natri nên để 2 - 4 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi ủ. Các hộp Petri hoặc khay sau thời gian để khuếch tán, mang ủ ở nhiệt độ thích hợp cho từng kháng sinh riêng (bảng 2). Nhiệt độ ủ phải được kiểm tra để khoảng nhiệt độ chênh lệch so với quy định chỉ trong khoảng  0,50C. Thời gian ủ thường kéo dài 16 - 18 giờ. Dùng dụng cụ đo có độ chính xác tối thiểu 0,1mm, đo đường kính vùng ức chế tạo bởi các nồng độ khác nhau của chuẩn và thử. Kiểm tra tính có giá trị của định lượng, tính hoạt lực và giới hạn tin cậy của hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 13.10 Phương pháp đo độ đục Pha các dung dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử Dung dịch dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử được pha trong dung môi thích hợp và được pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat có pH thích hợp cho từng kháng sinh theo chỉ dẫn ở bảng 2. Để đảm bảo giá trị hiệu lực của phép thử, làm thử nghiệm 3 liều là thích hợp. Pha song song những độ hoà loãng gồm 3 liều chuẩn (S1, S2, S3) và 3 liều thử (U1, U2, U3). Chế tạo canh thang để cấy truyền Để có được một độ đục thích hợp dùng được ngay ở dịch cấy truyền, pha dịch cấy truyền như mô tả ở phần chế tạo nhũ dịch cấy truyền rồi dùng ngay. Chủng chỉ thị và điều kiện thử nghiệm của từng kháng sinh sử dụng trong phương pháp này được ghi trong bảng 2. Tiến hành Các ống nghiệm được xếp thành từng nhóm, mỗi nhóm 3 - 5 ống, thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch của từng độ pha loãng của dung dịch chuẩn hoặc mẫu thử. Đặt các ống nghiệm vào giá ống nghiệm theo quy tắc ngẫu nhiên theo khối hoặc theo hình vuông latinh. Trong mỗi giá có 2 ống dùng kiểm tra không thêm kháng sinh, một ống chứa 1 ml dịch pha loãng, còn ống kia chứa 1 ml dịch pha loãng và 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt). Thêm vào mỗi ống 9 ml canh thang đã cấy truyền. Đặt giá đã chuẩn bị xong ngay vào trong tủ ấm hoặc cách thuỷ, giữ ở nhiệt độ thích hợp, khống chế nhiệt độ ở mức sai số  0,50C so với nhiệt độ cần ủ (theo bảng 2) trong 3 - 4 giờ. Sau khi ủ, làm ngừng sự phát triển của vi khuẩn bằng cách thêm vào mỗi ống 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt) trừ ống kiểm tra đã thêm formaldehyd 12% trước hoặc nhúng giá có các ống nghiệm đã ủ vào nước sôi . Lấy từng giá ống nghiệm khỏi nơi ủ, xác định độ truyền qua hoặc độ hấp thụ của mỗi dung dịch bằng máy đo quang ở 530 nm. Kiểm tra tính có giá trị của định lượng, tính hoạt lực và giới hạn tin cậy của hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 13.10 Phương pháp đường chuẩn Hoà tan một lượng cân chính xác chất đối chiếu hoặc chất chuẩn sinh học của một kháng sinh đã cho trong dung môi thích hợp, có thể phải làm khô trước. Pha loãng với dung môi qui định để được dãy chuẩn có 5 nồng độ. Tỷ lệ tăng giữa các nông độ nên là 1: 1,25. (xem hướng dẫn ở bảng 2) Tiến hành Khi tiến hành xây dựng đường chuẩn, khảo sát trên ít nhất 12 hộp Petri. Khi xác định hàm lượng của một kháng sinh dùng ít nhất 3 hộp Petri. Đổ vào mỗi hộp Petri 21 ml môi trường đã đun chảy, đợi thạch đông cứng lại tạo thành lớp có độ dày đồng đều và một bề mặt bằng phẳng để làm nền. (Riêng với amphotericin B, nystatin thì không dùng lớp nền). Đối với bleomycin, cycloserin, mithramycin hoặc mytomycin dùng 10 ml làm lớp nền. Lớp nuôi cấy dùng 4 ml cho mỗi hộp, được đổ và láng đều sau khi lớp nền đã đông cứng, đặt lên mặt thạch trong đĩa 6 ống trụ bằng thép không rỉ hoặc những ống bằng chất liệu khác như đã quy định ở phần dụng cụ. Các ống trụ tạo thành một hình lục giác đều cách tâm khoảng 2,8 cm. Chia 12 hộp Petri để xây dựng đường chuẩn thành 4 nhóm, mỗi nhóm 3 hộp. Dung dịch có nồng độ trung gian được lấy làm nồng độ kiểm tra dùng hiệu chỉnh các giá trị đo được ở mỗi nhóm. Đổ đầy dung dịch kiểm tra vào 3 ống trụ, bố trí xen kẽ trong mỗi hộp Petri. Các ống trụ còn lại được đổ đầy dung dịch có nồng độ của một nhóm. Sau khi ủ các hộp ở nhiệt độ thích hợp 32 - 350C (theo chỉ dẫn bảng 2) khoảng 16 - 18 giờ sẽ đo được 9 giá trị đường kính vòng vô khuẩn của nồng độ kiểm tra theo nhóm. Tổng số cả 4 nhóm sẽ đo được 36 giá trị đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra. Độ chính xác của mỗi kết quả đo là  0,1 mm. Cách tính Giá trị trung bình các đường kính vòng vô khuẩn ở mỗi nồng độ là a, b, d, e; giá trị trung bình các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của mỗi nhóm 3 hộp (9 kết quả) là Ca, Cb, Cd, Ce và giá trị trung bình các đường kính vòng vô khuẩn của nồng độ kiểm tra ở tất cả 12 hộp (ký hiệu là C), gồm 36 kết quả . So sánh giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của mỗi nhóm với giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của 12 hộp(C). Hiệu của chúng (C - Ca; v. v... ) là số hiệu chỉnh dùng để điều chỉnh giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ mỗi nhóm. Cộng đại số giá trị hiệu chỉnh đạt được vào giá trị trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của mỗi nhóm ta được các giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn đã hiệu chỉnh của mỗi nồng độ là a, b, d, e. Thí dụ: Giá trị trung bình của đường kính 36 vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra tính được là 19,2 mm; giá trị trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của nhóm nồng độ a là Ca = 19,0 mm. Số hiệu chỉnh là 19,2 - 19,0 = 0,2 mm. Giá trị trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của nhóm là 17,9 mm. Vậy giá trị trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của nhóm sau khi đã hiệu chỉnh là a = 17,9 + 0,2 = 18,1 mm. Trên hai chu kỳ giấy bán logarit vẽ đường chuẩn qua các điểm giá trị trung bình đã hiệu chỉnh. Trên trục tung (chia theo thang logarit) lấy nồng độ kháng sinh bằng àg hoặc đơn vị hoạt lực trong ml. Trên trục hoành (chia theo thang số học) lấy giá trị đường kính vòng ức chế. Như vậy đường chuẩn được vẽ qua điểm tương ứng với giá trị đường kính vòng ức chế cao nhất và thấp nhất tính được bằng phương trình sau: 3a + 2b + C - e L = 5 3e + 2d + C - a H = 5 L: Đường kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ thấp nhất của đường chuẩn. H: Đường kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ cao nhất của đường chuẩn. C: Đường kính trung bình của 36 kết quả của nồng độ kiểm tra. a, b, d, và e: Những giá trị đường kính trung bình đã hiệu chỉnh cho từng dung dịch còn lại xếp theo thứ tự từ nồng độ thấp nhất tới nồng độ cao nhất. Ba hộp Petri dùng cho mẫu thử nghiệm cũng được tiến hành đồng thời khi xây dựng đường chuẩn. Trong ba hộp này nhỏ xen kẽ giữa nồng độ trung gian của dung dịch chuẩn với nồng độ của mẫu thử đã pha loãng với dung dịch đệm thích hợp để có nồng độ giả định tương đương nồng độ trung gian của chuẩn. Sau khi đo đường kính các vòng vô khuẩn của mẫu thử, tính trung bình hiệu chỉnh theo giá trị đường kính nồng độ trung gian sẽ được đường kính của chế phẩm thử. Trên trục hoành ứng với giá trị đường kính vừa tìm được của mẫu thử, kẻ đường vuông góc với trục hoành cắt đường đường chuẩn vừa vẽ được tại một điểm và từ điểm này trên đường chuẩn hạ vuông góc với trục tung sẽ tìm được giá trị nồng độ ứng với đường kính của mẫu thử. Hoạt lực của chế phẩm được tính ra phần trăm so với chuẩn theo công thức sau: Hoạt lực tìm thấy của chế phẩm  100 R% = Hoạt lực tìm thấy ở nồng độ trung gian