Vai trò của hócmôn leptin trong nuôi cấy phôi trong ống nghiệm

Vai trò của hócmôn leptin trong nuôi cấy phôi trong ống nghiệm I. Đặt vấn đề Leptin là một mạch peptide gồm 167 axit amin và có trọng lượng phân tử 16 kD. Leptin là một hócmôn do mô mỡ tiết ra và do Zhang và cs phát hiện ra năm 1994. Khi mới được phát hiện, hócmôn leptin được coi là có ảnh hưởng đến cân bằng năng lượng bằng cách tác động lên thần kinh trung ương để ức chế lượng thức ăn thu nhận. Receptor của hocmôn leptin được tìm thấy ở não, tuyến yên, buồng trứng, nhau thai cũng như ở mô mỡ. Leptin ảnh hưởng lên trao đổi năng lượng bằng cách tăng mức tiêu thụ ôxy, tăng vận động và tăng nhiệt độ cơ thể. Leptin cũng được chứng minh là có nhiều vai trò trong sinh sản. Điều trị leptin có thể phục hồi sinh sản ở chuột. Leptin được coi là làm tăng chức năng sinh sản, thành thục sinh dục sớm ở chuột. Trong quá trình chửa của người, leptin được chứng minh là có liên quan vào điều khiển sự phát triển của thai, nhau thai và sinh tổng hợp hócmôn. ở lợn, leptin ở nhau thai nhiều thì thai phát triển bình thường còn leptin ít thì lợn chậm phát triển. Dựa trên những phát hiện trên đây, chúng tôi giả thiết rằng leptin có thể có vai trò trong sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ leptin khác nhau lên sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. Ngoài ra chúng tôi cũng nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ thu phôi lên sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 1. Phôi Phôi hai tế bào được thu ở ngày thứ 2 sau khi phối giốngbằng phương pháp phẫu thuật 2. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm Chuẩn bị môi trường dịch ống dẫn trứng tổng hợp (mSOF) có thay đổi theo công thức của Tervit và cs (1972). Đầu tiên phôi được nuôi cấy trong mSOF có bổ xung axit amin không thay thế trong 48 giờ. Sau đó phôi được chuyển sang môi trường mSOF có bổ xung axit amin không thay thế, axit amin thay thế và Albumin huyết thanh bò thêm 3 ngày nữa. Độ pH của môi trường được điều chỉnh để đạt tới 7,4. áp xuất thẩm thấu được duy trì ở 270-300 mOsmol. Thành phần chi tiết của môi trường được trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Thành phần môi trường mSOF Thành phần g/100ml NaCL KCL KH2PO4 MgCL2.H2O Na Lactate Glucose Penicillin Streptomicin 5.830 0.534 0.162 0.100 0.616 0.270 0,060 0.050 NaHCO3 Phenol Red Pyruvate CaCL2.2H2O Gluthamine Axit Amin không thay thế Axit Amin thay thế Albumin huyết thanh bò 2.102 0.010 0.360 2.520 1.460 1.0 ml 2.0 ml 0.8 Sau khi phân loại, hợp tử được rửa 3 lần trong mSOF trước khi đặt vào đĩa nuôi cấy. Mỗi nhóm 5-10 phôi được nuôi cấy trong 50ml ở 4 môi trường khác nhau (mSOF, SOF+1,0ng/ml leptin, mSOF+10,0ng/ml leptin và mSOF+100,0ng/ml leptin) và phủ dầu khoáng. Phôi được nuôi cấy trong tủ nuôi cấy có 5% CO2, 5%O2 và 90%N2 trong 5 ngày ở 38,80C. Tất cả môi trường được để cân bằng trong đĩa nuôi cấy trong 5% CO2, 5%O2 và 90%N2 trong 1 đêm trước khi được đưa ra dùng. 3. Đánh giá chất lượng phôi Sau 5 ngày nuôi cấy, phôi được đánh giá theo hình thái và chất lượng theo phương pháp của Lindner và Wright (1983). Phôi được phân loại theo giai đoạn phát triển gồm 8 tế bào, phôi dâu, phôi nang và phôi nang thoát màng 4. Sử lý số liệu Số liệu được sử lý theo chương trình thống kê REG, Version 90.12 của Gilmour 1990. III. Kết quả ảnh hưởng của mùa vụ thu phôi ảnh hưởng của mùa thu phôi lên sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm được trình bày ở bảng 2 Bảng 2: ảnh hưởng của mùa thu phôi lên sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm Tỷ lệ phôi phát triển đến 4 giai đoạn nuôi cấy(%) Mùa N 8 tế bào Phôi dâu Phôi nang Phôi thoát màng Mùa xuân 47 94,6b 62,2 43,2 8,1 Mùa thu 51 96,2a 47,1 27,5 5,9 ab: Các chữ cái khác nhau chỉ sự khác nhau có nghĩa, p<0,05 Bảng 2 cho thấy tỷ lệ phôi nuôi cấy ở mùa thu phát triển đến giai đoạn 8 tế bào cao hơn so với mùa xuân (96,1% so với 94,6%,p<0,05) nhưng không có sự khác nhau về tỷ lệ phôi phát triển trong 3 giai đoạn còn lại (P>0,05). ảnh hưởng của các nồng độ leptin ảnh hưởng của nồng độ lepin trong môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của phôi được trình bày ở bảng 3 và hình 1. Qua bảng 3 và hình 1 ta thấy có sự giảm nhanh chóng của phôi phát triển ở giai đoạn 8 tế bào đến giai đoạn thoát màng (từ 95,5% đến 0,8%, P<0,05). Tỷ lệ phôi phát triển đến 3 giai đoạn cao nhất (8 tế bào, phôi dâu, phôi nang) là ở môi trường nuôi cấy có bổ xung 10ng/ml leptin. ở giai đoạn 8 tế bào, sự phát triển ở môi trường đối chứng, 1ng/ml và 10ng/ml sai khác không có ý nghĩa (p>0,05).Tuy nhiên có sự sai khác có ý nghĩa về tỷ lệ phôi phát triển của các nhóm này và so với phôi nuôi cấy trong môi trường có bổ xung 100ng/ml leptin (100% so với 77,8%, P<0,05).Tỷ lệ phôi phát triển đến phôi dâu cao nhất ở môi trường có 10ng/ml leptin (77,8%), tiếp theo là nhóm đối chứng và 1ng/ml (54,5 và 55,6%, tương ứng). Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu thấp nhất được quan sát thấy ở môi trường nuôi cấy có bổ xung 100ng/ml leptin(16,7%). Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang cao nhất là ở môi trường có bổ xung 10ng/ml leptin(50,0%), tiếp theo là môi trường có bổ xung 1ng/ml leptin (44,4%). Phôi phát triển đên giai đoạn phôi nang thấp nhất ở trong môi trường có bổ xung 100ng/ml leptin (0,7%). Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn thoát màng không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các môi trường nuôi cấy (p>0,05). Bảng 3: ảnh hưởng của nồng độ leptin trong môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của phôi trong ống nghiệm Tỷ lệ phôi phát triển sau 5 ngày nuôi cấy trong ống nghiệm Xử lý N 8 tế bào Phôi dâu Phôi nang Phôi thoát màng Đối chứng 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 33 19 28 18 100a 100a 100a 77,8b 54,5b 55,6b 71,4b 16,7c 27,3c 44,4b 50,0a 0,7d 15,2a 0b 0,1b 0b IV. Thảo luận Trong nghiên cứu của chúng tôi, một đặc điểm nổi bật là tỷ lệ hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang cao nhất là ở môi trường có bổ xung 10ng/ml leptin. Tuy nhiên khi nuôi cấy trong môi trường có bổ xung 1ng/ml leptin, không có sự khác nhau có ý nghĩa trong sự phát triển của phôi đến giai đoạn 8 tế bào và phôi dâu, nhưng có sự khác nhau ở giai đoạn phôi nang so với môi trường đối chứng. Ngược lai, thêm 100ng/ml leptin vào môi trường nuôi cấy dường như ức chế sự phát triển của phôi. Kết quả này cũng phu hợp với kết quả của Herris và McFarlane báo cáo rằng phôi chuột phát triển đến giai đoạn phôi nang trương nở trong môi trường bổ xung 10ng/ml cao hơn 22% so với môi trường đối chứng và cao hơn 48% so với môi trường có bổ xung 100ng/ml leptin. Trong nghiên cứu của họ mức 100ng/ml leptin trong môi trường cũng ức chế sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. Một điều rất rõ là trong hệ thống chăn nuôi gia súc những con vật gầy (thể trạng cơ thể kếm) sinh sản kém hơn so với gia súc có thể trạng trung bình (Selk và cs, 1988). Vì nồng độ leptin trong huyết tương tỷ lệ thuận với lượng mỡ của cơ thể, người ta giả thuyết rằng leptin có thể hoạt động như một dấu hiệu đối với hệ thống sinh sản, nếu cơ thể có đủ một lượng mỡ cần thiết thì sẽ giúp cho gia súc chửa và có thai thành công (Hossner,1998). Tuy nhiên, đa số phụ nữ có u nang buồng trứng đều là những người béo phì và không rụng trứng (Holte và cs, 1994) đã gợi ý rằng leptin cũng có thể có ảnh hưởng âm tính lên hệ thống sinh sản. Spicer và Franciso (1997) nhận thấy rằng leptin ở mức độ sinh lý (2-10ng/ml) đã ảnh hưởng trực tiếp lên tế bào hạt tiết hócmôn Steroid. Các tác giả này gợi ý rằng nồng độ dao động bình thường của leptin trong máu có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự liên hệ của trình trạng trao đổi chất và hệ thống sinh sản. Nhũng gợi ý đó đã được khẳng định bằng kết quả nghiên cứu của chúng tôi rằng nồng độ leptin ở múc sinh lý bình thường (10ng/ml) thúc đẩy sự phát triển của phôi trong ống nghiệm, nhưng ở mức cao (100ng/ml) ức chế sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. Cơ chế thúc đẩy hay ức chế sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm cần phải được nghiên cứu thêm. Những thông tin về sự phát triển của phôi trong ống nghiệm không sãn có. Một điều rõ ràng rằng những thay đổi lớn nhất mà phôi trước khi làm tổ phải trải qua là năng lượng của chúng. Nghiên cứu in-vivo cho thấy leptin có thể điều hoà tiết insulin dẫn đến thu nhận glucose tăng, đó là một yếu tố điều hoà sự có mặt của glucose (Foster và Nagatani, 1999) và tăng trao đổi đường dẫn đến tăng sự phát triển của phôi. Dựa trên phát hiện này, chúng tôi giả thuyết rằng nồng độ leptin ở mức sinh lý trong môi trường nuôi cấy phôi trong ống nghiệm đã thúc đẩy sự phát triển của phôi bằng cách tăng trao đổi đường của phôi. Cần phải nghiên cứu thêm về trao đổi đường của phôi trong ống nghiệm để khẳng định giả thuyết này. ở môi trường nuôi cấy không có leptin, 54,5% hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu, 27,3%phát triển đến phôi nang và 15,2% phát triển đến giai đoạn thoát màng. Kết quả này thấp hơn nhiều so với kết quả đã báo cáo của Walker và cs (1989). Kết quả của họ là 85,2% hợp tử phát triển thành phôi nang và 74,1% phát triển đến giai đoạn thoát màng. Gardner và cs (1994) cũng báo cáo một tỷ lệ phôi phát triển thành phôi nang và phôi thoát màng cao hơn (71% và 60%, tương ứng); nhưng tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn 16 tế bào và phôi dâu trong kết quả của họ thấp (11% và 18% tương ứng). Tuy nhiên, những tác giả này nuôi cấy phôi trong ống nghiệm 6 ngày chứ không phải 5 ngày như trong thí nghẹm của chúng tôi, và đây cũng có thể là một lý do về tỷ lệ phôi nang thấp trong thí nghiệm của chúng tôi. Đã có báo cáo cho rằng thay mới môi trường 48giờ một lần trong khi nuôi cấy phôi trong ống nghiệm là cần thiết để tránh độc hại của amoniac khi môi trường nuôi cấy được bổ xung axit amin (Gardner, 1994). Tuy nhiên, thay mới môi trường nuôi cấy có thể rất ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi do lấy đi từ môi truường nuôi cấy các yếu tố sinh trưởng, thay đổi pH và áp suất (Fukui, 1996). Có thể đây cũng là một yếu tố làm thấp tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang sau khi thay mới môi trường trong thí nghiệm của chúng tôi. Đến bây giờ, chưa có báo cáo nào nói về ảnh hưởng của mùa vụ lên sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. ở kết quả của chúng tôi, mùa vụ nuôi cấy có ảnh hưởng lên sự phát triển của phôi đến giai đoạn 8 tế bào, nhưng không có ảnh hưởng ở các giai sau (phôi dâu, phôi nang và phôi thoát màng). Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi trong cơ thể và trong ống nghiệm có thể là do dinh dưỡng và yếu tố con đực. ở thí nghiệm của chúng tôi, tất cả con cho phôi đều được nuôi dưỡng cùng điều kiện dinh dưỡng. Hơn nữa, phôi thu được được nuôi cấy trong ống nghiệm cùng điều kiện. Đây là những lý do chính để vượt qua sự khác biệt về mùa vụ trong sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm. V. Kết luận -Mùa vụ thu phôi không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi trong ống nghiệm -Bổ xung 10ng/ml leptin vào môi trường nuôi cấy (mSOF) làm tăng tỷ lệ phát triển của phôi trong ống nghiệm. Ngược lai, bổ xung 100ng/ml leptin ức chế sự phát triển của phôi trong ống nghiệm, còn bổ xung 1ng/ml leptin ít ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi.