VAI TRÒ CỦA CÔNG NGHỆSINH HỌC TRONG BẢO VỆMÔI TRƯỜNG

VAI TRÒ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG 1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP GEN ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1.1. Công nghệ sinh học cổ điển (hay CNSH đại phân tử) và công nghệ sinh học hiện đại (hay CNSH phân tử) CNSH đại phân tử là lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng sinh vật và vi sinh vật (VSV) ở mức độ nguyên trạng, tức là chưa đi sâu vào tìm hiểu và ứng dụng ở mức độ cấu trúc phân tử mà chỉ tận dụng những đặc tính kiểu gen (genotype) và kiểu hình (phenotype) của chúng để sử dụng và chọn lọc loại tối ưu cho mục đích đặt ra. CNSH phân tử (Molecular Biotechnology) là một lĩnh vực tổng hợp có liên quan rất lớn đến các ngành di truyền phân tử, tế bào học, VSV học, sinh hoá học.... CNSH phân tử có hai lĩnh vực chính là CNSH phân tử cơ bản và CNSH phân tử ứng dụng. • CNSH phân tử cơ bản: bao gồm các thao tác DNA ở mức độ phân tử như cắt, nối, ghép, chuyển nạp, dẫn truyền các loại gen ngoại lai hữu ích vào các dòng tế bào chủ thích hợp để duy trì gen đó. • CNSH phân tử ứng dụng: chọn lọc, nhân lên, sản xuất...những dòng tế bào đã được tái tổ hợp để thu được những sản phẩm có ích cho con người. CNSH phân tử cơ bản và CNSH ứng dụng là hai bước kế tiếp nhau để đưa nguyên lý tái tổ hợp gen thành hiện thực, sản xuất các thành phẩm hữu ích theo công nghệ mới- Công nghệ sinh học. 1.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật tái tổ hợp gen ứng dụng trong CNSH 1.2.1. Mở đầu và khái niệm: Năm 1970, lần đầu tiên, Baltimore và Temin độc lập phát hiện loại enzyme có tác dụng sao chép ngược (reverse transcriptase) có tác dụng tham gia hoạt hoá cho quá trình tổng hợp ngược DNA từ khuôn RNA (reverse transcription). Điều này cho phép một khi đã có một RNA thông tin (mRNA) của một gen ở dạng sợi đơn, chúng ta có thể chuyển đổi thành 1 gen hoàn toàn (ở dạng DNA chuỗi xoắn kép) theo cơ chế bổ sung sao chép ngược, có sự tham gia của enzyme nói trên. Đây chính là nguyên lý tạo DNA bổ sung (complementary DNA-cDNA) từ mRNA. Cũng trong năm 1970, Smith và Wilcon công bố đã tách chiết được một loại enzyme nội bào từ vi khuẩn Haemophills influenzae, có khả năng cắt DNA ở những điểm nhất định, tạo nên nhiều đoạn DNA rời nhau, đã mở hướng cho một kỹ thuật thao tác mới ở mức độ phân tử, đó là có thể cắt và nối các đoạn DNA thích hợp để tạo nên các hỗn hợp lai DNA khác nhau. Về sau một loạt các loại enzyme có hoạt tính như trên đã được phân lập, người ta gọi đó là các enzyme hạn chế (restriction enzyme) Cũng trong những năm 70 tiếp theo, song song với sự phát triển và hoàn thiện những kỹ thuật thao tác vật liệu thông tin di truyền, việc phát hiện và sử dụng một số thực thể vi sinh sống cộng sinh trong các loại tế bào vi sinh vật như nấm men, vi khuẩn...có một ý nghĩa ứng dụng hết sức to lớn. Đó chính là các loại plasmid. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền các gen ngoại lai đã được tái tổ hợp vào tế bào vi sinh vật chủ tương ứng của chúng. Gần đây, trong những năm 80, phản ứng nhân bản gen (Polymerase Chain Raction-PCR) đã được phát hiện trên nguyên lý: deoxyribonucleic acid (DNA) có cấu trúc chuỗi xoắn kép, gồm hai mạch nucleotide bổ sung cho nhau theo quy luật A-T và G-C bằng các mối liên kết hydro. Giữa A-T có 2 và G-C có 3 mối liên kết hydro. Liên kết này không phải là liên kết hoá học bền vững, do đó dưới một tác dụng nào đó (ví dụ nhiệt độ cao trên 90oC, gần đến 100oC) thì hai mạch nucleotide sẽ tách nhau ra, nhưng khi hạ nhiệt thì hai mạch lạ xoắn trở lại. Sự phát hiện này đã nâng cao hơn nữa kỹ thuật tái tổ hợp DNA và ứng dụng thành quả của kỹ thuật đó. Như vậy, bằng enzyme hạn chế, ta có thể cắt một chuỗi DNA nào đó thành nhiều đoạn, rồi ghép một đoạn nào đó vào plasmid cũng đã bị cắt bằng một enzyme tương tự để tạo nên một plasmid mới mang đoạn DNA ngoại lai. Nếu đoạn DNA đó là một gen hoàn chỉnh chúng ta có một plasmid mới mang gen ngoại lai. Kỹ thuật cắt-nối-ghép và tạo nên một thực thể vi sinh mới, mang một hay nhiều đoạn DNA ngoại lai, được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA (recombinant DNA technology). Plasmid mang DNA ngoại lai đó được gọi là plasmid tái tổ hợp (recombinant plasmid). Khi pla smid đó được đưa vào tế bào vi sinh vật chủ, quá trình đó được gọi là quá trình chuyển nạp (transformation). Plasmid mang DNA ngoại lai đóng vai trò chuyển DNA vào trong tế bào chủ được gọi là vector dẫn truyền (cloning vector). Vector dẫn truyền có thể là plasmid hay bất kỳ một loại thực thể vi sinh khác, như virus chẳng hạn. Khi một vi sinh vật chủ (nấm men hay vi khuẩn...) đã tiếp nhận vector dẫn truyền để thực hiện những quá trình sinh học tiếp theo với DNA ngoại lai đã được chuyển nạp, thì dòng VSV đó được gọi là VSV tái tổ hợp (recombinant microorganism). Khi nuôi cấy VSV tái tổ hợp, nếu DNA ngoại lai là một gen hoàn chỉnh, được bố trí trong điều kiện có cấu trúc vector dẫn truyền thích hợp, thì gen đó có thể tổng hợp được protein ở trong tế bào vật chủ. Vector dẫn truyền có cấu trúc đặc biệt này được gọi là vector biểu thị gen (expression vector). 1.2.2. Các thành phần tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen Kỹ thuật tái tổ hợp gen bao gồm nhiều công đoạn khác nhau,có thể được tóm tắt như sau: • Cắt DNA bằng enzyme hạn chế (RE) • Phân lập đoạn DNA đã được cắt • Cắt plasmid tương ứng bằng enzyme hạn chế thích hợp • Nối ghép đoạn DNA ngoại lai vào plasmid • Chuyển nạp vào tế bào VSV chủ thích ứng • Chọn lọc dòng đã được tái tổ hợp theo nguyên tắc kháng kháng sinh • Nhân dòng đã chọn lọc • Kiểm tra xác định kết quả Vì vậy, các thành phần tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen rõ ràng có liên quan đến: a) Nguồn cung cấp DNA Nguồn cung cấp DNA bao gồm tất cả các loại hình có chứa DNA của vi sinh vật, nấm men, thực vật, động vật bậc cao. Các loại DNA này cần phải được làm sạch khỏi các thành phần khác của tế bào và bảo quản ở nhiệt độ -20oC. Cũng có thể là mRNA nhưng phải được chuyển sang dạng cDNA. Ngoài ra, nguồn cung cấp DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen có thể là sản phẩm PCR tinh khiết. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hoá học (phân tử bị thuỷ giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease-DNase và ribonuclease-RNase) - Phương pháp tách chiết DNA: gồm 3 bước cơ bản sau: § Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào eucaryote). Thông thường, tế bào, mô được nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (detergent như SDS, sarcosyl) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân huỷ các protein liên kết với DNA. § Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform. Dung dịch phenol và chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hoà tan nucleic acid. Protein khi biến tính sẽ không còn hoà tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform. Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại. § Bước 3: Tủa các nucleic acid. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân huỷ của các enzyme, mặt khác để có thể hoà tan chúng trở lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Phương pháp thông dụng là tủa trong isopropanol với tỉ lệ thể tích isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA có TLPT thấp không bị tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa trong isopropanol. Sau đó, nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm. Tiếp theo, cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Bảo quản ở nhiệt độ -20oC. - Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi các enzyme ribonuclease (RNase). Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm các bước cơ bản như đối với DNA:
 Tế bào, mô được nghiền trong một dung dịch gồm một chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính protein biến tính mạnh (guanidinium thiocyanate), một chất khử (2- mercaptoethanol). Hai loại chất sau có tác dụng ức chế hoạt động của các Rnase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA.
 Các protein được loại bỏ khỏi mẫu qua xử lý phenol:chloroform và li tâm.
 RNA hoà tan trong pha nước được kết tủa bằng ethanol và được thu nhận lại qua li tâm. RNA có thể được bảo quản trên một năm dưới dạng tủa trong dung dịch ethanol hoặc đông lạnh ở -70oC trong nước có chứa RNasine (một chất ức chế RNase) Sau khi một mRNA được phân lập khỏi tế bào, để có thể đưa chúng tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen, trước hết chúng phải được chuyển sang dạng cDNA bằng kỹ thuật DNA bổ sung. Chỉ ở dạng DNA mới có thể cắt nối bằng enzyme hạn chế và ghép vào plasmid được. - Phản ứng nhân bản gen PCR (Polymerase Chain Reation) Như đã nói ở trên, nguồn cung cấp DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen còn có thể là sản phẩm PCR tinh khiết. Phản ứng PCR là một phản ứng nhân tạo thực hiện trong PTN với sự tham gia của các thành phần sau:
 DNA làm khuôn
 Oligonucleotide (hay còn gọi là primer): là hai chuỗi nucleotide ngắn, được tổng hợp nhân tạo, có thể bám vào những vùng đặc hiệu trên sợi DNA làm khuôn và trượt theo chiều tiến lại gần nhau.
 Taq DNA polymerase: là loại enzyme rất bền và hoạt động tốt đến nhiệt độ 96oC, được chiết xuất từ Thermus aquaticus (Taq)- một loại vi khuẩn sống trong suối nước nóng.
 Hỗn hợp deoxyribo-nucleotide triphosphate (dNTP): bao gồm các thành phần deoxyribo-adenine triphosphate (dATP), deoxyribo- thymine triphosphate (dTTP), deoxyribo-guanine nucleotide triphosphate (dGTP), deoxyribo-cytosine triphosphate (dCTP) được hỗn hợp theo một tỷ lệ thích hợp. Hỗn hợp này có nhiệm vụ cung cấp nguồn nucleotide cho quá trình tổng hợp DNA xảy ra trong PCR.
 Môi trường đệm (buffer): đảm bảo độ pH cần thiết.
 Mg2+ với hợp chất cung cấp là MgCl2 với nồng độ 1.5-2.0 mM trong phản ứng PCR. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
 Bước 1: trong một dung dịch phản ứng bao gồm tất cả các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94-95oC trong vòng 30 giây đến 1-2 phút. Chuỗi DNA bị bung mối liên kết hydro và tạo nên hai sợi DNA làm khuôn. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation)
 Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp xuống khoảng 37-65oC (thấp hơn Tm của các primer), thông thường là 45-55oC (mà cho phép các primer bắt cặp với các sợi DNA làm khuôn ở những vị trí thích hợp của chúng ), trong khoảng từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization) hay gắn (annealing)
 Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt hoá các primer để chúng trượt trên các sợi khuôn, lấy các dNTP trong môi trường bổ sung vào sợi mới và tạo nên DNA mới. Thời gian của bước này tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kép dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation) Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, thường sau 25- 35 chu kỳ là tốt nhất. Sản phẩm PCR là một đoạn DNA có độ dài từ vài chục đến vài chục nghìn nucleotide, thông thường đến 3000. Vì lẫn tạp nhiều thành phần khác tham gia phản ứng PCR, nên sau khi được sản phẩm PCR, trước hết cần kiểm tra độ dài của đoạn DNA trong sản phẩm có đúng với đoạn ước định cần có không bằng phương pháp điện di khuếch tán trên thạch (agarose gel electrophoresis). Sau đó, cần thiết phải được tinh khiết trước khi sử dụng làm vật liệu DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen. - Phương pháp điện di: Sau quá trình tách chiết, các nucleic acid có thể được tinh sạch nhờ một số kỹ thuật như siêu ly tâm, sắc ký, hay điện di. Phương pháp điện di được sử dụng cả trong phân tích định tính và thu nhận mẫu nucleic acid. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, nên khi chịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử trong bản thạch (gel) dưới tác động của điện trường được tính theo công thức: Log u = Log uo- KrC Trong đó: Log uo là tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng, Kr là hằng số làm chậm do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lượng của phân tử nucleic acid, C là nồng độ của gel. Vì vậy, tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai yếu tố: khối lượng phân tử tức là số lượng nucleotide hay cặp nucleotide (DNA mạch đôi) và nồng độ các chất cấu thành gel. Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu nucleic acid là gel polyacrylamide và gel agarose. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tuỳ thuộc kích thước trung bình của các đoạn nucleic acid cần phân tách. Bảng 1. Tương quan giữa nồng độ gel và kích thước các đoạn cần phân tách % acrylamide 4 5 8 11 Kích thước các đoạn cần phân tách (cặp nucleotide) 200-800 80-200 40-100 10-50 % agarose 0.6-0.8 0.9-1.2 1.2-1.5 Kích thước các đoạn cần phân tách (kb) 1-20 0.5-7 0.2-5 § Gel agarose: Là loại gel thông dụng nhất bởi thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước 0.5-20 kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện thep phương nằm ngang. Sau điện di, các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình ở dạng những vạch màu đỏ cam dưới tia tử ngoại (UV có λ=300 nm) nhờ sự có mặt của ethidium bromide (được cho vào gel trước khi đổ)-có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Bên cạnh đó, để ước lượng kích thước của các trình tự nucleic acid trong gel agarose, thường dùng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker). Đây là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết trước được gọi là thang DNA (DNA ladder), thông thường sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể λ được thuỷ giải bởi enzyme giới hạn Hind III. § Gel acrylamide: Được dùng để tách các đoạn kích thước nhỏ (dưới 1000 cặp base. Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose, nên chỉ được sử dụng cho những mục đích đặc hiệu như: - Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA - Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base. Gel được đổ giữa 2 tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng đứng. Nguyên tắc của loại điện di này là dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di. Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải tự định hướng lại. Phân tử có kích thước càng lớn thì thời gian tự đinh hướng càng lớn khiến cho nó di chuyển chậm hơn một phân tử kích thước nhỏ. Một DNA đơn giản có thể tạo ra chỉ một ít băng. Nếu DNA ban đầu là rất lớn và phức tạp, việc nhuộm gel sẽ cho thấy một băng đại diện cho sự biến thiên hầu như là liên tục về kích thước của đoạn. Băng hay là phần chứa đoạn mong muốn sẽ được định vị với kỹ thuật Southern blotting và được chuyển ra. Bởi vì một một băng có thể đại diện cho một hỗn hợp vài đoạn, nó được điện di trên một gel với một nồng độ khác nhau để tách các đoạn có kích thước tương tự. - Thu nhận acid nucleic: Điện di trên gel agarose còn được sử dụng để thu nhận mẫu. Sau khi điện di, các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại theo một trong các phương pháp sau:
 Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA được thu nhận sau khi đã khuếch tán từ gel agarose vào một dung dịch đệm thích hợp.
 Phương pháp 2: Một giếng nhỏ được khoét trong agarose ngay trước vạch DNA. Giếng này được bơm dầy dung dịch đệm và điện trường được tái lập. DNA di chuyển vào giếng chứa đầy dung dịch đệm và được thu nhận lại.
 Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc biệt có điểm nóng chảy rất thấp (65oC). Sau điện di, vạch DNA được cắt ra, ủ ở trong một dung dịch đệm ở nhiệt độ 65oC. Khi agarose đã hoàn toàn tan chảy, DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và tủa. b) Các enzyme thông dụng trong kỹ thuật di truyền
 Các enzyme giới hạn (Restriction enzyme-RE) Các thực khuẩn thể (phage) xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số luợng phage tăng lên đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên trong một số trường hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiên tượng này có thể là do DNA của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập. Hệ thống bảo vệ này là các RE. DNA vi khuẩn không bị chính các RE của chúng cắt là nhờ cơ chế gắn nhóm methyl vào A hay C ở các vị trí cắt của các RE bởi enzyme methylase . Khi đó RE không còn nhận biết được các vị trí cắt. Đây chính là hiện tượng giới hạn và các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote. Các RE là các endonuclease có khả năng nhận biết và cắt DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định, và được ứng dụng chủ yếu trong phương pháp tạo dòng. •....... Ví dụ về RE: EcoRI là enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E.coli ↓ EcoRI 5’G A ATT C3’ 3’C TTA A G5’ ↑ (Dấu mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí cắt)
 Các enzyme thông dụng khác: - Các polymerase: gồm 2 nhóm: Các DNA polymerase xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. Phần lớn các DNA polymerase dùng DNA làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp DNA (DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA polymerase đặc biệt là enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase) laị sử dụng khuôn là RNA để tổng hợp DNA. Cuối cùng là Terminal transferase)- một DNA polymerase không tổng hợp mạch mới từ khuôn mà chỉ thêm các nucleotide vào đầu của một phân tử DNA đã có sẵn. Các DNA polymerase, để hoạt động, phải cần một mồi (primer). Mồi là một đoạn oligonucleotide bắt cặp bổ sung với phần đầu của khuôn, để từ đó các polymerase mới nối dài tạo cặp bổ sung. Các RNA polymerase tham gia tổng hợp RNA, thông dụng nhất là SP6, T7 và T3 RNA polymerase. Cả hai nhóm này được sử dụng khi cần tạo một số lượng lớn bản sao của nucleic acid (tạo mẫu dò, xác định trình tự nucleotide,...). - Các ligase Đây là các enzyme xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) và thường được sử dụng trong lĩnh vực tạo dòng. - Các nuclease Đây là nhóm các enzyme phân cắt DNA (DNase) và RNA (RNase)n một cách không chuyên biệt. Trong khi các RE đã được đề cập ở phần trên cũng là những nuclease nhưng mang tính chuyên biệt trình tự cao hơn. c) Plasmid vector: Plasmid là một thực thể vi sinh đơn giản nhất, có cấu trúc DNA khép kín tạo thành vòng tròn, độ dài của plasmid có thể thay đổi từ vài nghìn nucleotide đến vài trăm nghìn nucleotide, nằm ngoài hệ gen của một vi khuẩn hay VSV, nhưng có liên hệ chặt chẽ với tế bào vật chủ theo lối cộng sinh, nhân lên cùng với sự nhân lên của NST. Plasmid được sử dụng để làm vector (vật có khả năng tải và truyền những sản phẩm sinh học từ cá thể này sang cá thể khác) trong kỹ thuật tái tổ hợp gen nhờ trong cấu trúc của chúng có một vùng đặc biệt gọi là vùng ori. Vùng này là một chuỗi ngắn nucleotide, nằm ở một nơi nào đó trong vòng tròn DNA của plasmid, có chức năng quan trọng trong quá trình tự nhân lên tạo nhiều plasmid mới. Đây là nơi mà DNA polymerase và các loại protein bám vào, mở đầu cho chu kỳ nhân lên. Ngoài ra, nhờ vào đặc tính của một số plasmid mang gen kháng kháng sinh (antibiotics) quy định khả năng sản xuất enzyme kháng kháng sinh. Đó cũng là nguyên lý chọn lọc dựa trên khả năng kháng kháng sinh trong kỹ thuật tái tổ hợp gen. Để tạo được một plasmid vừa có khả năng dẫn truyền (cloning plasmid vector), từ plasmid tổ tiên, trước tiên người ta tiếp tục đưa vào những vùng mới, đặc biệt là vùng chứa tổ hợp gen chỉ thị nào đó (chẳng hạn gen chỉ thị là gen kháng tetracyclin hay tổ hợp gen sản xuất các loại protein nhất định), mà thông thường trong gen đó lại có một dãy các vị trí cắt của RE (dãy này được gọi là polylinker hay multiple cutting site-MCS). Đó là nơi để thực hiện các thao tác cắt, nối, ghép DNA, hay còn gọi là tái tổ hợp DNA. Nguyên lý chọn lọc được dòng tế bào chủ tiếp nhận plasmid tái tổ hợp được dựa trên nguyên lý kháng kháng sinh hay đặc tính hình thành màu khuẩn lạc do không có sự tổng hợp loại protein chỉ thị trên... d) Tế bào chủ thích ứng cho plasmid (host cell) Trong kỹ thuật tái tổ hợp gen, tế bào chủ phải là loại có khả năng thu nhận plasmid dễ dàng, lưu giữ bền vững và tạo điều kiện cho plasmid nhân lên nhiều và sản xuất tốt các sản phẩm tái tổ hợp. Hiện nay có nhiều dòng tế bào E. coli như JM 101, JM 102, JM 109...được sử dụng làm tế bào chủ trong kỹ thuật tái tổ hợp gen (còn gọi là tế bào thuần dưỡng-competent cell). Quá trình xâm nhập vào tế bào E. coli thuần dưỡng được gọi là quá trình biến nạp (transformation). Nếu sản xuất theo lối công nghệ vi sinh, plasmid trong vi khuẩn sẽ tổng hợp ra một hay nhiều sản phẩm được mong muốn. Lai phân tử- Lai trên pha rắn 1. Nguyên tắc Hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích- trình tự cần tìm) được cố định trên một giá thể rắn. 2. Các yếu tố kỹ thuật Giá thể rắn dùng để cố định nucleic acid là các màng lai. Có hai loại màng lai: - Màng lai bằng nỉtro-cellulose: là loại giá thể được sử dụng đầu tiên- hiện nay không còn thông dụng do hai nhược điểm là độ bền cơ học kém nên thao thác khó khăn, không thể tách rời các phân tử lai trên màng lai để lai trở lại với một mẫu dò (probe) khác. - Màng lai bằng nylon, có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau (cần loại bỏ mẫu dò cũ trước khi lai với mẫu dò mới) 3. Phương pháp Southern blot Phương pháp này được sử dụng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid... Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật chuyển (transfer) DNA từ gel lên màng lai do Southern mô tả năm 1975. - Các đoạn DNA được phân tách và được làm biến tính (biến thành hai mạch đơn ) ngay trên gel rồi được chuyển lên màng lai và theo các bước sau: Từ bồn chứa, dung dịch đệm được hút bởi giấy thấm dày, di chuyển theo lực mao dẫn lên phía trên. Khi đi qua gel, dung dịch đệm sẽ kéo theo các acid nucleic và chuyển chúng lên màng lai. Ngoài kỹ thuật chuyển nhờ lực mao dẫn, hiện nay người ta còn sử dụng kỹ thuật chuyển nhờ dòng điện và chuyển trong chân không cho hiệu quả cao hơn tuy đòi hỏi một số điều kiện kỹ thuật đặc biệt. - DNA được cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. Vật nặng đặt trên cùng giúp nén sát các thành phần tham gia vào quá trình này. Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng. - Cuối cùng, dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) hay sử dụng một film nhạy cảm với tia xạ áp sát màng lai để định vị các phân tử lai (DNA bộ gen: mẫu dò) Sanger Dideoxy Sequencing Sản phẩm kéo dài được phát triển bởi sự hình thành một cầu nối phosphodiester giữa nhóm 3´-hydroxyl tại đầu cuối đang kéo dài của primer và nhóm 5´- phosphate của deoxynucleotide sắp gắn. Sự kéo dài được tiến hành theo hướng 5´-3´. Điều đáng lưu ý là DNA polymerases cũng có thể gắn những chất tương tự với các nucleotide bases. Phương pháp dideoxy trong sequencing DNA đã được phát hiện bởi Sanger (1977) đã lợi dụng khả năng này bằng việc sử dụng 2´,3´-dideoxynucleotides như là cơ chất. Khi một dideoxynucleotide được gắn vào vị trí 3´ tận cùng của chuỗi đang kéo dài, sự kéo dài chuỗi được kết thúc một cách chọn lọc tại A, C, G, hay T bởi chuỗi thiếu một nhóm 3´-OH tận cùng của chuỗi đang kéo dài. Fluorescent Sequencing Các nhãn được gắn vào các sản phẩm DNA kéo dài bằng cách sử dụng dideoxynucleotide triphosphates được dán nhãn thuốc nhuộm ở đầu 3´. Applied Biosystems DNA sequencers phát hiện các hùynh quang từ 4 loại thuốc nhuộm khác nhau mà được sử dụng để xác định các phản ứng kéo dài A, C, G, and T. Mỗi thuốc nhuộm sẽ phát sáng tại một bước sóng khác nhau khi chiếu bởi một argon ion laser. Vì vậy, tất cả 4 màu và 4 bases có thể được phát hiện và phân biệt. trong một bản gel đơn hay được truyền mao dẫn. 2.1. PHỤC HỒI SINH HỌC (BIOREMEDIATION) Bioremediation được sử dụng cho các hệ thống s