Ứng dụng enzyme và siêu âm phá vách bào tử nấm linh chi (Ganoderma lucidum)

; BHT. Giá trị IC50 của polysaccharide, Vc và BHT lần lượt là 0,36 mg/mL, 0,25 mg/mL và 0,43 mg/mL. Bảng 3.8: Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide trong hai pha khi trích ly lỏng lỏng dịch phá v� bào tử bằng diethyl ether từ 100 g bào tử không siêu âm và siêu âm PHC (%) PN (%) KSA 0,25c ± 0,02 11,77b ± 0,99 SA 0,30c ± 0,01 16,50a ± 1,15 Ghi chú: Hàm lượng (%) được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Từ bảng 3.8, phân tích định lượng cho thấy pha nước thu hồi sau trích ly lỏng lỏng chứa phần lớn polysaccharide, sai khác giữa siêu âm và không siêu âm là có ý nghĩa thống kê. Đối với dung môi Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 400 diethyl ether pha hữu cơ chỉ chứa 2,1% khi không siêu âm và 1,81% khi siêu âm so với pha nước, sai khác không có ý nghĩa thống kê. Từ đó cho thấy thu hồi các hoạt chất từ dịch ly tâm sau khi phá v� bào tử bằng cách trích ly lỏng lỏng bằng dung môi diethyl ether (hay các dung môi không phân cực khác) thu pha hữu cơ thì phần lớn polysaccharide bị loại bỏ trong pha nước. Định lượng lipid tổng số Thành phần lipid trong bào tử gồm triterpenoid và acid béo. Tuy nhiên do không có chất chuẩn nên triterpenoid không được phân tích. Bảng 3.9: Hàm lượng lipid có trong dịch phá v� bào tử và vỏ bào tử từ 100 g bào tử phá v� vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm (hiệu suất thu hồi lipid tổng) Mẫu Hiệu suất thu hồi lipid (%) Dịch KSA 50,50b ± 1,32 BT KSA 1,08c ± 0,63 Dịch SA 86,17a ± 10,41 BT KSA 6,75c ± 1,75 Ghi chú: Hàm lượng (%) được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Dựa vào bảng 3.9 hàm lượng lipid tổng số thu được đạt giá trị cao nhất là 86,17% đối với mẫu dịch có siêu âm, cao hơn mẫu không siêu âm (50,50%). Có thể nói, nhờ kết hợp enzyme và siêu âm đã nâng hàm lượng lipid thu được lên 1,7 lần so với không siêu âm. Bên cạnh đó, ở dịch trích ly bào tử siêu âm đã thu được hàm lượng lipid là 6,75%, cao hơn mẫu bào tử không siêu âm (1,08%) tuy nhiên không có ý nghĩa về mặt thống kê. So sánh với phần lớn lipid thu hồi trong pha dịch sau ly tâm, việc dùng dung môi hữu cơ chủ yếu để thu hồi lipid trong đó có triterpenoid, thành phần này có phần khác biệt với thể quả. Theo Li JJ và cộng sự (2014), hàm lượng triterpenoid trong thể quả nấm chiếm 0,44% - 1,42%, trong khi đó ở bào tử phá v� chiếm 1,89% - 3,15%. Từ đó kết luận rằng phương pháp siêu âm làm tăng tỉ lệ phá v� và vì vậy tăng hàm lượng polysaccharide cũng như lipid thu hồi trong phần dịch phá v� bào tử cao hơn là trong vỏ bào tử. Đề nghị quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh chi thu hoạt chất Như vậy, quy trình phá vách và thu hồi dịch chiết bào tử nấm Linh chi được đề nghị bao gồm các quá trình chính sau: – Tiền xử lý lạnh đông -40C 12 giờ, rã đông. – Ủ bào tử với hỗn hợp enzyme dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 (3,93 U/ml chitinase) và chế phẩm cellulase C20032 (6,40 U/ml chitinase), 500C, pH = 5,0 đệm acetate trong 10 ngày. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 401 – Siêu âm 5 phút, 500C, độ khuếch đại 100%. – Ly tâm 4000 vòng phút, 15 phút tách pha. – Trích ly pha rắn bằng ethanol. – Phối trộn dịch trích bằng ethanol và pha dịch sau ly tâm. – Cô quay chân không loại bỏ phần lớn dung môi. – Sấy phun hoặc đông khô. KẾT LUẬN Các kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy có thể phá v� khoảng 70% bào tử nấm Linh Chi bằng phương pháp rẻ tiền là sử dụng enzyme và kết hợp siêu âm. Tỉ lệ phá v� bào tử không cao so với phương pháp nghiền, vì vậy enzyme phá v� vách bào tử hiệu quả hơn cần được tiếp tục nghiên cứu, cũng như thành phần và các hoạt tính sinh học các chất thu được sau khi phá v� vách bằng enzyme và siêu âm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Boh B, Berovic M, Zhang J, Zhi-Bin L. Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds. Biotechnol Annu Rev. 2007;13:265–301 [2] Brennan, C.S., Yuliarti, O., Goh, K., Matia-Merino, L., Mawson, J. & Drummond, L. (2008). Effect of extraction techniques and conditions on the physicochemical properties of the water soluble polysaccharides from gold kiwifruit (Actinidia chinensis). International Journal of Food Science and Technology, 43, 2268–2277 [3] Cheng CR, YueQX, WuZY, et al. Cytotoxic triterpenoids from Ganoderma Lucidum. Phytochemistry 2010; 71: 1579-1585 [4] Elson, LA. and Morgan, W. (1933) A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine, Biochem. J. 27, 1824-1828 [5] Heim, Y. R. Li, Q. Chen, Z. Lin, D. Xia, L. Ma, 1992. Chemical studies on immunologically active polysaccharides of Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst. Chung – Kuo – Chung – Yao – Tsa – Chih. 17 (4):266 – 8. 256 (1992) [6] Jungjing MA, Zhengyi FU, Peiyan MA, Yanli SU, Qingjie Z (2007) Breaking and characteristics of Ganoderma lucidum spores by high speed centrifugal shearing pulverizer. J. Wuhan Univ. Tech-Mater. Sci. Ed. 22: 617-621 [7] Krings, U. & Berger, R.G. (2001). Antioxidant activity of some roasted foods. Food Chemistry, 72, 223–229 [8] Li J.J., Hu X.Q., Zhang X.F., Liu J.J., Cao L.S. (2014). Study on variation of main ingredients from spores and fruiting bodies of Ganoderma lucidum, Article in Chinese. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 402 [9] Pattent CN 101596220 A (2009). Wall-breaking method of Ganoderma lucidum spore [10] Pearson’s Composition and Analysis of Foods, 9th Edn, 1991 page 538 [11] Saha, S., Subrahmanyam, E. V. S., Kodangala, C., & Shastry, S. C. (2011). Isolation and characterization of triterpenoids and fatty acid ester of triterpenoid from leaves of Bauhinia variegata. Der Pharma Chemica, 3, 28-37 [12] Zhu X., Chen X., Xie J., Wang P., Su W. (2012). Mechanochemical-assisted extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum spores. Int J Food Technol, 47 (5), 927 – 32 COMBINATION OF ENZYMATIC AND ULTRASONIC METHODS FOR THE BREAKAGE OF GANODERMA LUCIDUM SPORE WALLS ABSTRACT The purpose of this study was to determine the method for Ganoderma lucidum spore wall breakage. Chitinase activity in the Trichoderma harzianum T2 extract and commercial enzyme C20032 displayed their optimal temperature of 500C and their optimal pH of 5.0. Spore wall breakage efficiency was found to be 53.5% when using simmultanneously Trichoderma harzianum T2 enzyme chitinase and commercial enzyme C20032 at 500C, pH 5 during 10 days. After enzymatic treatment, applying 500W ultrasound in 5 minutes with 100% amplification increased the spore breakage efficiency to 71.7%. Freezing Ganoderma lucidum spores as a pretreatment step seemed to be a prerequisite for spore wall breakage. However, there was no significant difference between freezing methods such as storage under -40C, -200C, -700C (in dry ice) and -1960C (in liquid nitrogen). For spore wall breakage by enzyme only, the centrifugal supernatant contained 12.03% total polysaccharide and 50.5% total lipid, while from the spore walls in pellet only 0.04% total polysaccharide and 1.08% total lipid were extracted. By combining enzymatic and ultrasonic methods for the breakage spore walls, the centrifugal supernatant contained up to 16.80% total polysaccharide and 86.17% total lipid, while the spore walls in pellet as in the previous case kept only a small part of spore substances, namely 0.03% total polysaccharide and 6.75% total lipid. A flow chart of breaking spore wall by combining enzymatic and ultrasonic methods and active substance recovery was designed. Keywords: chitinase, Ganoderma lucidum spore wall breakage, polysaccharide, lipid, ultrasound.