Tối ưu hóa và xây dựng động học quá trình trích ly protein từ bèo tấm Lemna minor

Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018 TỐI ƯU HÓA VÀ XÂY DỰNG ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH TRÍCH LY PROTEIN TỪ BÈO TẤM LEMNA MINOR Lương Trí Phong*, Lê Ngọc Quỳnh Nhi, Trần Chí Hải Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh *Email: triphong163@gmail.com Ngày nhận bài: 07/7/2018 ; Ngày chấp nhận đăng: 12/7/2018 TÓM TẮT Nguyên liệu bèo tấm (Lemna minor) với hàm lượng protein là 242,3 mg/g đã được thu nhận từ đầm rau nhút ở tỉnh Tiền Giang, sau đó được rửa sạch, phơi khô, xay và rây để tiến hành trích ly protein. Trong nghiên cứu này, bốn yếu tố: nồng độ NaOH, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly được sàng lọc theo mô hình Plackett Burman. Kết quả cho thấy 2 yếu tố nồng độ NaOH và nhiệt độ trích ly có ảnh hưởng đến hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein. Mô hình bề mặt đáp ứng được sử dụng để tối ưu hóa cho hiệu suất trích ly protein đạt cực đại 42,02% tại điều kiện NaOH 1,13%, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20, nhiệt độ trích ly 54,3oC và thời gian trích ly 75 phút. Ngoài ra, động học quá trình trích ly tuân theo mô hình bậc hai với khả năng trích Ce là 117,647 mg/g, vận tốc trích ly ban đầu v0 là 11,325 (mg.g-1.phút-1), hằng số tốc độ trích ly k là 8,1823.10-4 (g.mg-1.phút-1) và R2 = 0,9876. Từ khóa: Bèo tấm, động học, Plackett – Burman, protein, tối ưu hóa. 1. GIỚI THIỆU Bèo tấm (Lemna minor L) là loại thực vật thủy sinh một lá mầm và có tốc độ sinh trưởng mạnh, chúng có thể gấp đôi so với khối lượng ban đầu trong 16 giờ đến 2 ngày nếu được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng, ánh sáng mặt trời, nhiệt độ nước tối ưu [1]. Bèo tấm có hàm lượng protein cao (20-35%) với đầy đủ các acid amin thiết yếu, chất béo 4-7% [2].Ở nhiều nước Nam Á như Ấn Độ, Bangladesh và Pakistan, thực phẩm giàu carbohydrates nhưng lại chứa ít protein. Do đó, protein từ bèo tấm sẽ là một chất bổ sung hoàn hảo cho thực phẩm ở những nước này. Hơn nữa, bèo tấm còn có thể cung cấp protein cho các chế độ ăn kiêng, ăn chay – kiểu sống rất phổ biến ở các nước phát triển hiện nay [2]. Theo khuyến nghị nhu cầu dinh dưỡng của Bộ Y tế dành cho người Việt Nam, mỗi ngày trung bình một người trưởng thành cần cung cấp 1,25g protein trên 1kg thể trọng. So với protein động vật, protein thực vật chiếm tỉ trọng thấp hơn nhưng rất hiệu quả trong việc phòng ngừa các bệnh về tim mạch, béo phì và giảm lượng cholesterol trong máu [3]. Do vậy, protein từ bèo tấm là nguồn cung cấp rất hữu ích cho con người. Trong nghiên cứu này, các thông số như nồng độ dung môi NaOH, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ, thời gian đã được sàng lọc bằng mô hình Placket Burman và tối ưu hóa quá trình trích ly với hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly của quá trình và độ tinh sạch của protein trong dịch trích. 33 Lương Trí Phong, Lê Ngọc Quỳnh Nhi, Trần Chí Hải 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu chính trong nghiên cứu này là bèo tấm (Lemna minor L) được thu nhận từ các đầm rau nhút ở tỉnh Tiền Giang. Sau đó, bèo tấm sẽ được rửa sạch, phơi khô rồi chuyển lên Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh để tiến hành xay, rây với kích thước 0,3mm. Sản phẩm bèo tấm khô có độ ẩm 5,15±0,07%, hàm lượng béo chiếm 2,04±0,10%, hàm lượng tro chiếm 12,15±0,07%, hàm lượng carbohydrat tổng chiếm 47,57±2,38% và hàm lượng protein trong bèo tấm là 24,23±1,21% Thuốc thử Nessler được cung cấp bởi Công ty Merck KgaA, các hóa chất phân tích khác đạt yêu cầu của hóa chất ở phòng thí nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Đánh giá sự tác động của các yếu tố bằng mô hình Plackett Burman Các yếu tố sẽ được sàng lọc có ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly protein từ bèo tấm thông qua mô hình Plackett Burman với 16 thí nghiệm cho bốn yếu tố (nồng độ NaOH, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly) với các giá trị ở 2 biên của các yếu tố lần lượt là 0,5% và 1,5%; 1/15 và 1/25; 50oC và 60oC; 60 phút và 90 phút. 2.2.2. Tối ưu hóa quá trình trích ly protein từ bèo tấm Các yếu tố đã được sàng lọc có ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly protein sẽ được chọn để tiến hành tối ưu hóa theo mô hình ma trận trực giao cấp hai (3 thí nghiệm ở tâm). 2.2.3. Xây dựng động học quá trình trích ly protein từ bèo tấm Các thông số động học của quá trình trích ly protein được xác định bao gồm: khả năng trích ly Ce (mg/g), tốc độ trích ly ban đầu vo (mg.g-1.phút-1), và hằng số tốc độ trích ly k (g.mg-1phút-1) [4]. Điều kiện trích ly là kết quả tối ưu tìm được từ phương pháp quy hoạch thực nghiệm 2.2.2. Quá trình trích ly protein có thể được biểu diễn dưới dạng phương trình bậc hai tổng quát (1). Tốc độ trích ly ban đầu vo (mg.g-1.phút-1) là Ct/t khi t tiến đến 0 và được xác định bởi phương trình (2) [5]. t Ct = 1 Ce × t + 1 k.Ce 2 (1) v0 = k.Ce 2 (2) 2.2.4. Phương pháp phân tích Cân chính xác 1g bèo tấm khô vào ống ly tâm và sử dụng dung môi để trích ly protein bằng bể ổn nhiệt và ly tâm với vận tốc 5500 vòng/phút trong 15 phút và lọc để thu nhận dịch trích protein. Hàm lượng protein được xác định thông qua hàm lượng Nitơ có trong mẫu. Hàm lượng Nitơ này được xác định bằng phương pháp Kjeldahl kết hợp với phương pháp đo quang bằng thuốc thử Nessler (với một số thay đổi): lấy 0,5ml dịch trích protein từ bèo tấm khô, 5ml H2SO4đđ, 1ml H2O2 và 2ml HClO4 để thực hiện phá mẫu trong 2 giờ. Chỉnh pH mẫu phá về pH trung tính trong bình định mức 100ml và định mức tới vạch, tiếp tục hút 5ml mẫu vào bình định mức 25ml, có sử dụng đệm kali natri tartrate 10% và định mức tới vạch. Thực hiện đo quang với thuốc thử Nessler ở bước sóng 400nm. 34 Tối ưu hóa và xây dựng động học quá trình trích ly protein từ bèo tấm Lemna minor Hiệu suất trích ly protein được tính theo các công thức (4), trong đó C là hàm lượng protein trong dịch trích, V là thể tích dịch trích, m là khối lượng mẫu, f là độ pha loãng, 6,25 là hệ số chuyển từ Nitơ sang protein, h là hàm lượng protein trích ly được trong 1g mẫu, H là hiệu suất trích ly protein từ bèo tấm, h0 là hàm lượng protein tổng trong bèo tấm: h(mg/g) = C × V m × f × 6,25 1000 (3) H (%) = h ho × 100 (4) 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và kết quả được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình. Thiết kế thí nghiệm và xử lý kết quả sàng lọc, tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 5.0. 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đánh giá sự tác động của các yếu tố bằng mô hình Plackett Burman Kết quả đánh giá sự tác động của các yếu tố được thể hiện ở bảng 1 và bảng 2. Các khoảng giá trị biên và tại tâm của bốn yếu tố được chọn dựa vào kết quả thí nghiệm khảo sát đơn yếu tố đã được tiến hành trước đó. Bảng 1. Bảng bố trí thí nghiệm theo mô hình Plackett Burman STT Biến mã hóa Biến thực Hiệu suất trích ly (%) Nồng độ NaOH (X1) Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (X2) Nhiệt độ trích ly (X3) Thời gian trích ly (X4) Nồng độ NaOH (%) Tỉ lệ nguyên liệu/du ng môi (w/v) Nhiệt độ trích ly (oC) Thời gian trích ly (phút) 1 1 -1 -1 -1 1,5 15 50 60 38,13 2 1 1 -1 -1 1,5 25 50 60 38,28 3 1 1 1 -1 1,5 25 60 60 35,64 4 1 1 1 1 1,5 25 60 90 32,64 5 -1 1 1 1 0,5 25 60 90 27,25 6 1 -1 1 1 1,5 15 60 90 29,26 7 -1 1 -1 1 0,5 25 50 90 30,51 8 1 -1 1 -1 1,5 15 60 60 35,14 9 1 1 -1 1 1,5 25 50 90 38,33 10 -1 1 1 -1 0,5 25 60 60 27,69 11 -1 -1 1 1 0,5 15 60 90 27,09 12 1 -1 -1 1 1,5 15 50 90 38,54 13 -1 1 -1 -1 0,5 25 50 60 29,77 14 -1 -1 1 -1 0,5 15 60 60 27,16 15 -1 -1 -1 1 0,5 15 50 90 29,14 16 -1 -1 -1 -1 0,5 15 50 60 28,25 35 Lương Trí Phong, Lê Ngọc Quỳnh Nhi, Trần Chí Hải Bảng 2. Kết quả xử lý thống kê của bố trí thí nghiệm theo mô hình Plackett Burman Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly Hệ số ảnh hưởng p value với mức ý nghĩa 5% Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly Hệ số ảnh hưởng P value với mức ý nghĩa 5% Nồng độ NaOH (%) 3,69468 3,37536.10 -19 Nhiệt độ trích ly (oC) -1,81871 1,62956.10-9 Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi (v/w) 0,462072 0,059355 Thời gian trích ly (phút) -0,457742 0,0616791 Kết quả thu được cho thấy trong khoảng giá trị khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian trích ly ảnh hưởng không có ý nghĩa đến hàm mục tiêu hiệu suất trích ly, còn nồng độ NaOH (p = 3,37536.10- 19) và nhiệt độ trích ly (p = 1,62956.10-9) có ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất trích ly protein từ bèo tấm. Theo lý thuyết, khi tăng nồng độ dung môi sử dụng thì hiệu suất trích ly tăng do sự chênh lệch gradient nồng độ của cấu tử cần trích ly giữa nguyên liệu và dung môi càng lớn. Ngoài ra, khi tăng nhiệt độ dễ làm protein biến tính, làm giảm hàm lượng protein tan trong dung môi [6]. R.J. Kain cũng có báo cáo tương tự khi khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến quá trình trích ly protein từ đậu phộng, kết quả cho thấy hiệu suất trích ly giảm 15 – 17,6% khi nhiệt độ tăng từ 40oC lên 60oC [7]. 3.2. Tối ưu hóa quá trình trích ly protein từ bèo tấm Từ kết quả của thí nghiệm sàng lọc, có hai yếu tố nồng độ NaOH và nhiệt độ trích ly ảnh hưởng đến hàm mục tiêu hiệu suất trích ly được lựa chọn để tiến hành tối ưu hóa với giá trị trung tâm lần lượt là 1% và 55oC. Khi đó, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 và thời gian trích ly 75 phút được cố định cho toàn bộ thí nghiệm tối ưu hóa theo hàm mục tiêu hiệu suất trích ly. Bảng 3. Kết quả bố trí thí nghiệm tối ưu hóa theo hiệu suất trích ly STT Biến mã hóa Biến thực Hiệu suất trích ly (%) Nồng độ NaOH (X1) Nhiệt độ trích ly (X3) Nồng độ NaOH (%) Nhiệt độ trích ly (oC) 1 -1 -1 0,5 50 31,93 2 1 -1 1,5 50 36,30 3 -1 1 0,5 60 28,04 4 1 1 1,5 60 32,67 5 -1 0 0,5 55 35,90 6 1 0 1,5 55 40,37 7 0 -1 1 50 37,94 8 0 1 1 60 37,01 9 0 0 1 55 41,21 10 0 0 1 55 41,09 11 0 0 1 55 41,12 36 Tối ưu hóa và xây dựng động học quá trình trích ly protein từ bèo tấm Lemna minor Bảng 4. Kết quả hồi quy đa biến hiệu suất trích ly Hieu suat Coeff. SC Std. Err. p value Conf. int(±) Constant 41,6137 0,390849 5,71519.10-37 0,801963 X1 2,24578 0,311046 9,14626.10-8 0,63822 X3 -1,40986 0,311046 0,00011 0,63822 X1*X1 -4,18418 0,47869 2,34425.10-9 0,9822 X3*X3 -4,84173 0,47869 1,11141.10-10 0,9822 X1*X3 0,0636833 0,380952 0,868482 0,781657 N = 33 Q2 = 0,875 Cond. no. = 3,0822 DF = 27 R2 = 0,921 Y-miss = 0 R2 Adj. = 0,907 RSD = 1,3197 Conf. lev. = 0,95 Y = 41,6137 + 2,24578.X1 – 1,40986.X3 – 4,18418.X12 – 4,84173.X32 (5) Phương trình (5) cho thấy cả 2 yếu tố nồng độ dung môi NaOH và nhiệt độ trích ly đều tác động theo quy luật hàm bậc 2 (có đỉnh lên hàm mục tiêu hiệu suất thu hồi), tuy nhiên không có sự tương tác giữa 2 yếu tố. Hình 1. Đồ thị đáp ứng bề mặt hiệu suất trích ly protein theo phương trình hồi quy trên không gian hai chiều (a) và ba chiều (b) Hiệu suất trích ly đạt cực đại là 42,02% tại nồng độ dung môi NaOH 1,1328% và nhiệt độ trích ly 54,3oC (Hình 1). Chúng tôi tiến hành kiểm tra thực nghiệm với sự lặp lại 3 lần tại giá trị nồng độ dung môi NaOH và nhiệt độ trích ly tối ưu, kết quả thu được là hiệu suất trích ly đạt 42,17±0,72%. Kết quả kiểm tra có sự chênh lệch giữa kết quả thực tế và kết quả từ phương trình hồi quy nhưng có thể chấp nhận được. Ngoài ra, giá trị R2 = 0,921 thể hiện 92% biến thiên của biến phụ thuộc được giải thích bởi các biến độc lập và R2adj = 0,907 cho thấy mức độ giải thích của các biến độc lập trong mô hình không bị ảnh hưởng nhiều bởi các bậc tự do. Giá trị R2 > 0,85 và Q2 = 0,875 cho thấy mức độ tin cậy của mô hình hồi quy cao, và cho thấy ảnh hưởng của mỗi biến số trong hàm hồi quy ở mức ý nghĩa 95%. 3.3. Xây dựng động học quá trình trích ly protein từ bèo tấm 37 Lương Trí Phong, Lê Ngọc Quỳnh Nhi, Trần Chí Hải Từ kết quả tối ưu hóa quá trình trích ly protein từ bèo tấm, hai yếu tố nồng độ dung môi NaOH và nhiệt độ trích ly là 1,1328% và 54,3oC được chọn để tiến hành xây dựng động học quá trình trích ly protein từ bèo tấm với hàm mục tiêu là hàm lượng protein trích ly từ bèo tấm (mg/g). Ngoài ra, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi được cố định là 1/20, thời gian trích ly được thay đổi từ 0 đến 120 phút với bước nhảy là 10 phút. Bảng 5. Hàm lượng protein trích ly theo thời gian Thời gian (phút) Hàm lượng protein (mg/g chất khô nguyên liệu) Thời gian (phút) Hàm lượng protein (mg/g chất khô nguyên liệu) 0 46,337 ± 1,091 70 98,401 ± 0,779 10 63,386 ± 0,801 80 102,646 ± 1,199 20 72,185 ± 1,170 90 104,304 ± 0,851 30 83,982 ± 0,755 100 107,120 ± 1,067 40 86,236 ± 0,750 110 110,320 ± 1,002 50 89,599 ± 1,654 120 112,482 ± 1,252 60 94,376 ± 1,126 Hình 2. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa thời gian và giá trị nghịch đảo của tốc độ trích ly protein từ bèo tấm Hình 2 mô tả phương trình dạng đường thẳng của mô hình động học bậc 2 của quá trình trích ly protein từ bèo tấm: t Ct = 1 Ce × t + 1 k.Ce 2 (1) Từ đồ thị trên, ta xác định được các thông số: khả năng trích ly Ce là 117,647 mg/g, tốc độ trích ly ban đầu vo là 11,325 mg.g-1.phút-1 và hằng số tốc độ trích ly k là 8,1823.10-4 g.mg-1.phút-1 Hệ số R2 khá cao (0,9876) cho thấy mô hình bậc hai là phù hợp với các kết quả thí nghiệm. Như vậy, mô hình động học bậc hai sử dụng trong bài nghiên cứu mô tả tốt cho những kết quả thực nghiệm thu được khi trích ly protein từ bèo tấm. y = 0.0085x + 0.0883 R² = 0.9876 0.0 0.5 1.0 1.5 0 20 40 60 80 100 120 G IÁ T R Ị N G H IC H Đ Ả O C Ủ A T Ố C Đ Ộ T R ÍC H L Y P R O TE IN (P H Ú T* G /M G ) THỜI GIAN 38 Tối ưu hóa và xây dựng động học quá trình trích ly protein từ bèo tấm Lemna minor 4. KẾT LUẬN Từ bốn yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein (nồng độ dung môi NaOH, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly), phương pháp sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein từ bèo tấm theo mô hình thí nghiệm Plackett Burman được sử dụng để xác định hai yếu tố ảnh hưởng là nồng độ dung môi NaOH và nhiệt độ trích ly. Tại điều kiện tối ưu nồng độ dung môi NaOH 1,13% , tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20, nhiệt độ trích ly 54,3oC, thời gian trích ly 75 phút, hiệu suất trích ly protein đạt 42,02%. Động học quá trình trích ly protein đã được xác định với các thông số khả năng trích ly Ce là 117,647 mg/g, vận tốc trích ly ban đầu v0 là 11,325 (mg.g-1.phút-1), hằng số tốc độ trích ly k (g.mg-1.phút-1) với R2 = 0,9876. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] J H Stambolie and R Bell R A Leng, "Duckweed - a potential high-protein feed resource for domestic animals and fish". [Online]. [2] Klaus-J.Appenroth, "Nutritional value of duckweeds (Lemnaceae) as human food," 15, Feb 2017. [3] Nguồn Doanh nhân sài gòn cuối tuần. (2014) [Online]. dam-thuc-vat/ [4] R. Yusoff, G.-C.Ngoh, and C.-H.Chan, "Modeling and kinetics study of conventional and assisted batch solvent extration," Chemical engineering research and design, vol. 92, pp. 1169-1186, 2014. [5] A. M. Goula, "Ultrasound-assisted extration of pomegranate seed oil-Kinetic modeling," Journal of Food Engineering, vol. 117, pp. 492-498, 2013. [6] John F. Brandts, Robert J. Oliveira, and Chester Westort, "Thermodynamics of protein denaturation. Effect of pressure on the denaturation on ribonuclease A," pp. 1038–1047, 1970. [7] R.J. Kain, Z. Chen, T.S. Sonda, and J.C. Abu-Kpawoh, "Study on the Effect of Control Variables on the Extraction of Peanut Protein Isolates from Peanut Meal (Arachis hypogaea L.)," American Journal of Food Technology, vol. 4, pp. 47-55, 2009. 39 Lương Trí Phong, Lê Ngọc Quỳnh Nhi, Trần Chí Hải ABSTRACT OPTIMIZATION AND KINETICS OF PROTEIN EXTRACTION FROM LEMNA MINOR Luong Tri Phong*, Le Ngoc Quynh Nhi, Tran Chi Hai Ho Chi Minh city University of Food Industry *Email: triphong163@gmail.com Lemna minor from the water mimosa pond in Tien Giang province with protein content of 242.3 mg/g were collected, washed, dried, grounded and sieved for protein extraction. In this research, four factors: concentration of NaOH solution, material/solvent ratio, extraction temperature, extraction time were screened by using the model of Plackett Burman. The results showed that concentration of NaOH solution and extraction temperature affect the target function of protein extraction. Responsive surface modeling was used for optimizing the protein extraction efficiency reaching maximum 42.02% at 1.13% NaOH, 1/20 material / solvent ratio, 54.3oC extraction temperature, 75 min extraction time. In addition, kinetics of extraction process followed the second-order models with the extract capacity Ce , the initial extraction velocity v0, the k extraction rate constant and R2 were 117.647 mg/g, 11.325 (mg*g- 1*min-1), 8.1823*10-4 (g*mg-1*min1), and 0.9876 respectively. Keywords: duckweed, kinetics, optimization, Plackett – burman, protein. 40