Tối ưu hóa quá trình trích ly protein từ bèo tấm (Lemna minor) với sự hỗ trợ của enzyme cellulase

Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TRÍCH LY PROTEIN TỪ BÈO TẤM (LEMNA MINOR) VỚI SỰ HỖ TRỢ CỦA ENZYME CELLULASE Vy Thị Minh*, Phạm Văn Đông, Trần Chí Hải Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh *Email: vyminh018@gmail.com Ngày nhận bài: 07/7/2018 ; Ngày chấp nhận đăng: 12/7/2018 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, quá trình trích ly protein từ bèo tấm đã được tiến hành với sự hỗ trợ của enzyme cellulase. Với hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein, 4 yếu tố ảnh hưởng (tỉ lệ enzyme:cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian) đã được sàng lọc bằng mô hình Plackett Burman. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng khi tiến hành trích ly protein từ bèo tấm bằng enzyme, ba yếu tố khảo sát ảnh hưởng có ý nghĩa đến hiệu suất trích ly protein (p<0,05); trong đó 3 yếu tố lần lượt là; nồng độ enzyme cellulase 30µL/g, pH 5,5; ủ ở nhiệt độ 450C được tiến hành tối ưu theo phương pháp bề mặt Response Surface Method (RSM); hiệu suất trích ly đạt 55,07% tương đương với hàm lượng protein là 133,428 mg/g nguyên liệu. Từ khóa: Enzyme Cellulase, Lemna minor, trích ly protein 1. MỞ ĐẦU Bèo tấm (Lemna minor) có hàm lượng protein dao động khoảng 6,8-45%, với đầy đủ các acid amin thiết yếu cho cơ thể; lipid 1,8–9,2%; xơ từ 5,7–16,2%; đường từ 14,1–43,6 và tro là 12-27,6% (được tính theo trọng lượng chất khô) [1] [2]. Với hàm lượng protein này nếu có thể tận dụng sẽ góp phần giải quyết vấn nạn thiết hụt protein hiện nay trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu liên quan đến bèo tấm, chủ yếu được sử dụng như là nguồn thức ăn cho chăn nuôi, xử lí chất thải hay sử dụng cho chữa bệnh trong đông y. Năm 1990, Amano và Noda đã đề xuất việc sử dụng hỗn hợp enzyme gồm các enzyme tiêu hóa lấy từ ruột bào ngư để phá thành tế bào rong Porphyra yezoensis tạo điều kiện nghiên cứu trích ly protein [3]. Ngoài ra, các enzyme carageenanse và cellulase được sử dụng giúp hiệu quả thu nhận protein tăng lên 10 lần với đối tượng rong đỏ Chondrus Cri spus, Gracilaria verucosa và Palmaria palmate [4]. Như vậy, việc sử dụng enzyme Cellulase vào việc hỗ trợ trích ly protein từ bèo tấm là hướng khả thi. Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này các thông số công nghệ tỉ lệ enzyme:cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian trích ly protein từ bèo tấm có sự hỗ trợ của enzyme được tiến hành đánh giá mức độ tác động bằng mô hình Plackett Burman và tối ưu bằng phương pháp đáp ứng bề mặt Response Surface Method (RSM) để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến quá trình trích ly. Đây là nghiên cứu tiền đề 9 Vy Thị Minh, Phạm Văn Đông, Trần Chí Hải cho các nghiên cứu sâu hơn về trích ly protein từ bèo tấm. Một nguồn nguyên liệu đầy tiềm năng nhưng vẫn chưa được quan tâm đúng mức. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Bèo tấm được thu nhận từ đầm rau nhúc tại xã Tân Hoà Thành, huyện Tân Phước, tỉnh Tiền Giang. Bèo tươi sau khi thu nhận được làm sạch, loại bỏ tạp chất, phân loại, phơi khô, nghiền nhỏ và sàng qua rây 0,3mm; lượng protein trong bèo là 24,23% chất khô, ẩm 5,20%; mẫu này được gói trong túi zip sử dụng trong nghiên cứu. Enzyme cellulase sử dụng là chế phẩm thu nhận từ nấm mốc Trichoderma reesei của hãng Novozymes, tên thương mại là Viscozyme Cassava C; hoạt động tốt trong vùng; pH 4.5 – 5.5, nhiệt độ từ 40oC – 50oC; có hoạt lực 100 FBG/g. Hóa chất sử dụng; Albumin huyết thanh bò (BSA, Việt Nam), thuốc thử Folin (Meck) và các hóa chất đạt yêu cầu phòng thí nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Trích ly protein với sự hỗ trợ của enzyme Bột bèo được pha loãng với nước cất theo tỉ lệ (2g:40ml), sau đó điều chỉnh pH bằng acid HCL 2N, để ổn nhiệt ở 450C khoảng 5 phút rồi bắt đầu bổ sung 30µL/g enzyme, bắt đầu tính thời gian trích ly. Kết thúc thời gian trích ly mẫu được đem ly tâm tách cặn ở chế độ 5500 vòng trong 15 phút, thu phần dịch bằng cách lọc qua vải sạch và chuẩn bị xác định hàm lượng protein bằng phương pháp quang phổ, đo ở bước sóng 660nm. 2.2.2. Thiết kế mô hình Plackett Burman sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng Để đánh giá mức độ tác động của bốn yếu tố (tỉ lệ enzyme:cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian) đến quá trình trích ly protein từ bèo tấm với sự hỗ trợ của enzyme cellulase, thí nghiệm được thiết kế theo mô hình Plackett Burman, sàng lọc với 4 yếu tố trong 16 thí nghiệm (Bảng 1). Mức thấp (-1) và mức cao (+1) của yếu tố, kết quả tại tâm các phương án đã có từ một nghiên khác. Mẫu sau khi trích ly được pha loãng 10 lần, hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm sạch; bổ sung 4ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,5 ml thuốc thử Folin – Ciocalteu; để yên 30 phút rồi đem đo độ hấp thu quang ở bước sóng 660nm [5]. 2.2.3. Mô hình tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt RSM Trong nghiên cứu này, mỗi thí nghiệm đơn và tại tâm sẽ được tiến hành lặp lại ba lần, kết quả được trình bày ở dạng giá trị trung bình ± giá trị sai số. Kết quả được tính toán trên phần mền Microft Office Excel 2010 và phân tích bằng phần mền Modde 5.0. 2.2.4. Xử lí số liệu 10 Tối ưu hóa quá trình trích ly protein từ bèo tấm (Lemna Minor) với sự hỗ trợ của enzyme cellulase Số liệu thực nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình, kết quả được trình bày ở dạng giá trị trung bình ± sai số. Sau đó, dùng phần mềm Statgraphics Centurion XV và Modde 5.0 để phân tích số liệu. 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Thiết kế Plackett Burman sàng lọc thí nghiệm Kết quả sàng lọc trên mô hình Plackett Burman cho thấy mức độ tác động của bốn yếu tố (tỉ lệ enzyme:cơ chất, pH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất trích ly protein trong dịch trích ly (Bảng 1). Kết quả thí nghiệm tâm các phương án đã có từ một nghiên cứu khác. Bảng 1. Ma trận bố trí thí nghiệm Plackett- Burman Số thí nghiệm lập lại Yếu tố tác động Hàm mục tiêu X1 X2 X3 X4 Y 3 1 -1 -1 -1 30,40 ±0.21 3 1 1 -1 -1 36.00 ±1.46 3 1 1 1 -1 43,72 ±0.01 3 1 1 1 1 42.66 ±1.88 3 -1 1 1 1 41.00 ±0.04 3 1 -1 1 1 39.22 ±0.14 3 -1 1 -1 1 36.26 ±0.17 3 1 -1 1 -1 40.07 ±0.15 3 1 1 -1 1 35.93 ±0.26 3 -1 1 1 -1 38.61 ±0.08 3 -1 -1 1 1 37.62 ±0.06 3 1 -1 -1 1 30.35 ±0.12 3 -1 1 -1 -1 33.02 ±0.03 3 -1 -1 1 -1 36.10 ±0.07 3 -1 -1 -1 +1 29,56 ±0,14 3 -1 -1 -1 -1 29,61 ±0,14 Với bốn yếu tố được khảo sát trong một khoảng giá trị nhất định, sự thay đổi nhiệt độ có tác động lớn nhất đối với hiệu suất protein trong dịch trích li, với mức tác động là 3,65515 (P=7.57e-24); kế 11 Vy Thị Minh, Phạm Văn Đông, Trần Chí Hải tiêp là sự ảnh hưởng của pH và tỉ lệ enzyme:cơ chất (P<0,05); các yếu tố đều có tác động tích cực tới hàm mục tiêu khi có giá trị ảnh hưởng dương (Coeff. SC >0). Riêng đối với yếu tố thời gian, trong khoảng thời gian 60-120 phút, có tác động không đáng kể đến giá trị hàm lượng protein, mức tác động không có ý nghĩa khi P = 0.080182 (P>0,05). Do đó, thí nghiệm tối ưu hoá chỉ được tiến hành với ba yếu tố (tỉ lệ enzyme:cơ chất, pH, nhiệt độ), còn thời gian được cố định trong 90 phút. Bảng 2. Mức ảnh hưởng của các yếu tố Yếu tố Mức ảnh hưởng (Coeff. SC) Prob > F X1 1,04701 5.43e-07 X2 2,1637 1.68e-15 X3 3,65515 7.57e-24 X4 0,318965 0.080182 3.2. Tối ưu hóa quá trình trích ly protein từ bèo tấm Lemna minor với sự hỗ trợ của enzyme cellulase Mô hình dạng toàn phương bậc 2 được xác định bằng phương pháp hồi quy đa biến, sau khi phân tích dữ liệu, phương trình hồi quy hàm mục tiêu Y (hiệu suất trích ly protein) theo các biến tỉ lệ enzyme:cơ chất (X1), pH (X2) và nhiệt độ (X3) được biểu diễn ở dạng: Y = 54,6141+ 1,50015X2 + 2,4677X3 – 2,00493X12 – 4,79388X22 – 4,05159 X32 –1,09713X2X3 a) b) Hình 1. Đồ thị đáp ứng bề mặt hiệu suất trích ly protein theo phương trình hồi quy trên không gian 2 chiều (a) và 3 chiều (b) giữa yếu tố nhiệt độ và pH 12 Tối ưu hóa quá trình trích ly protein từ bèo tấm (Lemna Minor) với sự hỗ trợ của enzyme cellulase Dựa vào phương trình hồi quy nhận thấy X2 và X3 có ảnh hưởng dương đến hiệu suất trích ly protein (theo hàm bậc nhất); X2 ảnh hưởng mạnh nhất đến hiệu suất trích ly protein (p= 1,31e-18 đối với hệ số bậc 2, p=8,77e-09, đối với hệ số bậc 1); X12, X22, X32 có ảnh hưởng tiêu cực, có sự tương tác X2 X3 giữa pH và nhiệt độ (Bảng 4), còn tất cả ảnh hưởng đồng thời của 2 yếu tố khác đều không có ý nghĩa. Hệ số hồi quy R2 tính được là 0.974 và hệ số biến thiên ảo Q2 là 0.959. Giá trị R2 và Q2 càng tiến đến 1 thì mức độ tin cậy của mô hình hồi quy càng cao. Bảng 3. Kết quả hiệu suất trích ly protein từ hàm tương tác của nhiệt độ và pH STT X1 X2 X3 Hiệu suất trích ly 1 - - - 30,793±0,639 2 - 0 0 50,757±1,334 3 - + + 39,874±0,504 Nhiệt độ và pH ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly protein theo phương trình hàm bậc 2, hiệu suất trích ly protein đạt cực đại tại khoảng nhiệt độ từ 45-470C và khoảng pH từ 5,4-5,6 là 54,9% (Hình1). Từ hình 1, kết quả tối ưu cho nhiệt độ là 46oC, pH là 5,55 tại tâm mặt phẳng không gian đạt hiệu suất trích ly 54,9%. Hình 2. Đồ thị đáp ứng bề mặt biểu diễn ảnh hưởng của hai biến tỉ lệ enzyme:cơ chất và pH theo phương trình hồi quy trên không gian 2 chiều và 3 chiều Tỉ lệ enzyme:cơ chất và pH ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly protein theo phương trình hàm bậc 2, hiệu suất trích ly protein đạt cực đại tại khoảng tỉ lệ từ 27-34 µL/g và khoảng pH từ 5,45-5,65 là 54,3% (Hình 2). Nếu tiếp tục tăng tỉ lệ enzyme:cơ chất và pH thì hiệu suất bắt đầu giảm. 13 Vy Thị Minh, Phạm Văn Đông, Trần Chí Hải Tỉ lệ enzyme:cơ chất và nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly protein theo phương trình hàm bậc 2, hiệu suất trích ly protein đạt cực đại tại khoảng tỉ lệ từ 25-36 µL/g và khoảng nhiệt độ từ 44- 480C là 55% (Hình 3). Nếu tiếp tục tăng tỉ lệ enzyme:cơ chất và nhiệt độ thì hiệu suất bắt đầu giảm. Hình 3. Đồ thị đáp ứng bề mặt biểu diễn ảnh hưởng của hai biến tỉ lệ enzyme:cơ chất và nhiệt độ theo phương trình hồi quy trên không gian 2 chiều và 3 chiều Các thông số tối ưu: tỉ lệ enzyme:cơ chất với nồng độ 30,5µL/g, pH 5,6, nhiệt độ 46,10C. Khi đó, hiệu suất trích ly protein đạt giá trị cực đại: 55,07%, hàm lượng protein trích ly tương đương 133,434 mg/g nguyên liệu. Để kiểm tra ý nghĩa của mô hình, một thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại với các thông số tối ưu như trên. Kết quả kiểm tra thực nghiệm thu được hiệu suất trích ly protein là 55,04% (tương đương hàm lượng protein trích ly là 133,362 mg/g nguyên liệu, chênh lệch 0,05% so với giá trị dự đoán của phương trình hồi quy, kết qủa này chấp nhận được. Enzyme hỗ trợ xử lí trích ly protein làm tăng khả năng trích ly, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về vai trò của enzyme trong việc tăng cường khả năng trích protein từ hạt kiều mạch hay cám yến mạch [6]. Ngoài ra, các nghiên cứu chiết xuất protein từ cám gạo sử dụng enzyme chiết xuất hơn 50% protein trong điều kiện tối ưu. 4. KẾT LUẬN Phương pháp sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng theo mô hình thí nghiệm Plackett- Burman đưa ra ba yếu tố ảnh hưởng lớn nhất là tỉ lệ enzyme:cơ chất, pH, nhiệt độ (p<0,05); thời gian không gây ảnh hưởng đáng kể (p>0,05). Phương pháp tối ưu hóa đáp ứng bề mặt RSM đã cho thấy hiệu quả trong nghiên cứu này. Điều kiện tỉ lệ enzyme:cơ chất (X1) với nồng độ 30,5µL/g, pH (X2) 5,55, nhiệt độ (X3) 46,10C; ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly theo phuơng trình hồi quy hàm bậc 2, theo đó hiệu suất trích ly thu được là 55,07%, hàm lượng tương đương là 133,434mg/g nguyên liệu. Enzyme Cellulase được sử dụng làm tăng hiệu quả trích ly protein từ bèo tấm. 14 Tối ưu hóa quá trình trích ly protein từ bèo tấm (Lemna Minor) với sự hỗ trợ của enzyme cellulase TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Landolt E & Kandeler R, "The family of lemnaceae – A monographic study,Biosystematic Investigations in the family of duckweeds (Lemnaceae) ," vol. 2, 1987. [2] M,van der Spiegel et al, "Safety of Novel Protein Sources (Insects, Microalgae, Seaweed, Duckweed, and Rapeseed) and Legislative Aspects for Their Application in Food and Feed Production". [3] H. Amano et al, "Proteins of protoplasts from red alga Porphyra yezoensis," Nippon Suisan Gakkaishi, vol. 56, pp. 1859-1864, 1990. [4] J. Fleurence et al, "Use of enzymatic cell wall degradation for improvement of protein extraction from Chondrus crispus, Gracilaria verrucosa and Palmaria palmata," Journal of applied phycology, vol. 7, pp. 393-397, 1995. [5] Lowry et al, "Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent," Biol. Chem, pp. 193, 265-275, 1951. [6] Xiao Guan, Huiyuan Yao, "Optimization of Viscozyme L-assisted extraction of oat bran protein using response surface methodology". 15 Vy Thị Minh, Phạm Văn Đông, Trần Chí Hải ABSTRACT OPTIMIZATION OF ENZYME CELLULASE ASSISTED PROTEIN EXTRACTION PROCESS FROM DUCKWEEDS (LEMNA MINOR) Vy Thi Minh*, Pham Van Dong, Tran Chi Hai Ho Chi Minh city University of Food Industry *Email: vyminh018@gmail.com In this study, protein extract from Lemna minor was conducted with the support of cellulase enzyme. With the objective function is the extraction of proteins, four factors including enzyme promotion, pH, temperature and time were screened using the Burman Plackett model, In the fact that from the result of this research, if the protein extraction process with Cellulase Enzyme met some certain conditions particularly pH is 5,5, the sample was incubated at 45 degree celsius in 90 minutes, enzyme concentration was 30 µL/g, the extraction productivity would be 55,07 % and the protein concentration was obtained to be up to 133,428 mg/g material. Key words: Enzyme Cellulase, Lemna minor, protein extraction 16