Tiểu luận Real time PCR

A-PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE(PCR): ĐẠI CƯƠNG: Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại về số lượng vật chất di truyền .Các phương pháp tạo dòng in vivo tuy giải quyết được vấn đề về số lượng nhưng đòi hỏi thao tác phức tạp và thời gian dài .Sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại in vitro có chọn lọc,trong đó nổi tiếng nhất phải kể đến phương pháp PCR,đã đảo lộn nguyên tắc của việc tạo dòng cổ điển ,mở ra những triển vọng ứng dụng to lớn . Bằng cách sử dụng enzyme DNA polymerase và Oligonucleotid tổng hợp nhân tạo các mồi primer, một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn. Đó là kết quả tuyệt vời của PCR. PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng dây chuyền tổng hợp nhờ polymerase do Karry Mullis và các cộng sự phát minh vào năm 1985. Từ một vi khuẩn có tính chịu nhiệt Thermus Aquaticus (được tìm thấy tại YelloustonePark), sống ở vùng nước nóng, người ta đã phân lập được Taq polymerase cho phép ta khuếch đại một đoạn DNA ở một vùng bất kì trong hệ gen khi trình tự hai đầu đoạn DNA đã biết có tính lập đi lập lại và số lượng tăng lên theo hàm số mũ. Dựa vào trình tự Nu ở hai đầu đoạn, các cặp oligonucleotic được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sọi đơn.Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp in vitro nhờ enzyme DNA polymerase. Như vậy, PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cách phát triển một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA. Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu các dây đơn DNA này. Kế đến là sự phát triển của các primer nhờ DNA polymerase. Thông qua phương pháp PCR hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm: RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Đây là công cụ khá mới của sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến cực kì quan trọng và hiện đang được sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng như trong nghiên cứu. Vì sao phải dùng kĩ thuật PCR ? Kiểm tra nhanh Áp dụng cho cả nguyên liệu và kiểm soát quá trình Trong số các phương pháp kiểm tra nhanh thì PCR là phương pháp đáp ứng cao các chỉ tiêu quan trọng : Thời gian cho kết quả Độ nhạy Độ đặc hiệu Ngay cả giá thành Đơn giản II.NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR
PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA, dựa trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 trình tự sau: Biến thành dây đơn (denature) Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template (gọi là tiến trình annealing) để có phân tử DNA mới. Kéo dài dây mới nhờ primer (extension) Những phản ứng này được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase và sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho denature và nhiệt độ cho annealing 1.DNA polymerase: DNA polymerase là một enzyme có chức năng tổng hợp các dây đơn DNA. trong điều kiện cho phép nào đó, tiến trình tổng hợp DNA này có thể được sao chép in vitro Polymerase được phân lập từThermus aquaticus có khả năng là vật thể ổn định về nhiệt độ, đó là Taq polymerase với hai thuận lợi chính: Hồi phục sau khi phục hồi nhiệt không cần kéo dài. Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ cao, lúc đó việc tác động của các primer ở đầu dây đơn và sinh tổng hợp DNA sẽ nhanh hơn Cần chú ý Polymerase được sử dụng là những enzyme sống, nhạy cảm về nhiệt độ, phải được thêm vào trong mỗi chu kỳ. Phải có một quy trình hướng dẫn cụ thể trong khi thực hiện từng giai đoạn của chu kỳ PCR. (Phản ứng chuỗi polymerase(PCR) với 3 kỹ thuật:PCR chuẩn,PCR neo,PCRđảo PCR chuẩn: DNA mục tiêu mở dây đôi,sau đó 2 primer tác động ở hai đầu dây đơn,rồi DNA mới tổng hợp nhờ Taq với 4 deoxiribonucleotide PCR neo:chỉ cần một primer,một đuôi dG nhân tạo được gắn vào đầu 3’ của DNA mục tiêu,DNA được khuếch đại nhiều lần nhờ một primer có chuỗi mã đã biết trước,và một primer thứ hai có oligo dC PCR đảo, người ta dùng nó để khuếch đại đoạn phân tử kế cận chuỗi mã DNA đã biết trước,phân tử DNA này được phân cắt và nối lại bởi enzyme để tạo thành một vòng tròn có tính chất monomer, sau đó DNA được khuếch đại nhờ một primer tương đồng với đầu của chuỗi mã đựơc biết trước 2.Thiết kế chu kỳ với nhiệt độ tương thích Nhiệt độ sử dụng trong phản ứng PCR phải được xác định chính xác. Mỗi chu kỳ của PCR có ba nhiẽt độ cần được xác định như sau: (Thời kỳ biến tính DNA, tách dây đôi thành dây đơn, nhiệt độ được thiết kế là 940C, với nhiệt độ này DNA sẽ tạo ra sợi đơn DNA, hoạt động như dây nền (template) cho quá trình tổng hợp DNA mới. ( Thời kỳ lai giữa primer và DNA (annealing), nhiệt độ thay đổi 50-600C. Nhiệt độ này tuỳ thuộc vào loại marker mà chúng ta đang sử dụng, với chiều dài cụ thể của oligonucleotide. Chúng ta phải thử từng bước để biết chắc nhiệt độ cần được thiết kế là bao nhiêu. ( Thời kỳ kéo dài dây DNA mới được tổng hợp nhờ Taq polymerase (extension),nhiệt độ được thiết kế là 720C. Giai đoạn annealing là quan trọng nhất, bởi vì trong giai đoạn này, sự kiện sự lai DNA-DNA xảy ra. Nếu nhiệt độ quá cao, không lai được DNA; nếu nhiệt độ quá thấp, việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Chính vì thế để thiết lập nhiệt độ cho chu kỳ PCR, người ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer riêng biệt. 3.Chu kỳ khuếch đại a Số chu kỳ Thường dùng là 30 chu kỳ cho quá trình khuếch đại PCR. Nếu thêm nhiều chu kỳ thì phản ứng rất chậm và năng suất thu hoạch cho các băng không cao. Nhìn chung số chu kỳ tuỳ thuộc vào phương pháp và đối tượng sử dụng. b.Nhiệt độ cho thời kỳ lai với primer (annealing): tuỳ thuộc vào primer mà chúng ta điều chỉnh nhiệt độ (56-600C) c.Taq polymerase: Taq polymerase có thể 2-4Kb (trên phút), tức 35-70 base trong một giờ. Vì thế 1 Kb,1 phút nhiệt độ 720C sẽ thành công cho quá trình khuếch đại. d.Chú ý với 20 mer với thành phần GC trên 60% thì phải tính toán nhiệt độ trong quá trình sắp xếp polymer. 4. DNA mục tiêu Người ta cần phải có các đoạn DNA mang mật mã đã biết trước ”DNA mục tiêu”. Trong kĩ thuật PCR, người ta sẽ nhận được những kết quả tốt nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết. DNA của thực vật thường được ly trích từ mô lá. Số lượng DNA cần cho phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần từ 5-10ng DNA thuần khiết, đủ dể cho kết quả theo mong muốn. Người ta cần có ethanol trong lần cuối của qui trình chuẩn bị DNA. Với 10% ethanol, nó vẫn chưa có thể gây ảnh hưởng đến hoạt động của Taq polimerase. Điều ghi nhận quan trọng là: phải có một mM EDTA trong chất đệm TE, trong khi sử dụng để hoà tan DNA.EDTA sẽ gắn với Mg++, để thể tích của DNA mục tiêu không vượt quá 1/15 của thể tích PCR 5.Primer và DNA Trong PCR tiêu chuẩn, người ta cần có một căp mồi. Sự khuếch đại chuyên biệt nào đối với một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc vào các cặp mồi tương xứng.C ả hai yếu tố: chiều dài primer và thành phần C-G đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn. Nhiệt độ này là: 2x (A+T)+4x (G+C) +5oC. Nếu có 50%G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18-20 Nu. Người ta mua các nucleotide ở các công ty hoá chất, có chất lượng tốt, nếu có được bảo quản ở dạng bột đông khô (freeze-dried powder). Sau đó nguời ta phải điểu chỉnh lại độ pH truớc khi sử dụng. III KỸ THUẬT PCR
Một qui trình PCR cần thiết để khuếch đại một số lượng lớn chuỗi DNA chuyên biệt gồm 3 giai đoạn, mỗi giai đoạn có 3 bước nhảy liên tiếp. 1.Biến tính (denaturation): Bước đầu tiên trong hệ thống khuếch đại PCR là sự biến tính do nhiệt của DNA khuôn mẫu do sự tăng nhiệt độ trong ống nghiệm đến 95oC. Thêm vào đó, trong ống nghiệm phải chứa một số lượng lớn hai oligonucleotide mồi, một DNA polymerase chịu nhiệt (e.g. Taq DNA polymerase chịu nhiệt được tách biệt từ vi khuẩn Thermus aqaticus), và bốn loại deoxyribonucleotide. Nhiệt độ là nhu cầu tối thiểu trong giai đoạn này. 2.Hồi tính (annealing): Đối với bước thứ hai này, nhiệt độ của hỗn hợp giảm từ từ xuống 550C. Trong suốt giai đoạn này, những base mồi sẽ bắt cặp với mạch gốc theo nguyên tắc bổ sung. 3.Kéo dài (extension) Nhiệt độ tăng đến 75oC, ở nhiệt độ này thuận lợi cho chức năng xúc tác của Taq DNA polymerase. DNA được kích thích tổng hợp theo chiều 3’-OH.
(Đối với một qui trình chuẩn thì chu kỳ 25-35 phải thực hiên trong điều kiện:
“Denature” 94-960C 15 giây (hoặc lâu hơn) “annealing” 550C(50-560C) 30giây “extention” 720C 1,5 phút Chu kỳ được kết thúc bằng một “extension”ở 720C trong 1,5 phút. Sau đó người ta cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở 40C. Phức tạp nhất là nhiệt độ trong giai đoạn “annealing”. Chúng ta phải điều chỉnh để có khuếch đại tốt nhất và ghi nhận được đa hình tốt nhất khi điện di trên gel. Tóm lại trong qui trình chuẩn này, chúng ta cần tuân thủ các qui định sau: Phuơng tiện và hóa chất: Máy Thermal cycler (PE 9600 Perkin-Elmer) Mẩu DNA ly trích 100ng/µl Dung dịch stock của dNTP(mỗi dNTP là 5 mM) Taq polymerase (5U/µl Perkin-Elmer) Dung dịch stock của 10xPCR buffer (buffer cuả Perkin-Elmercó 15mM MgCl2, 500mM kCl. 100mM Tris-HCl, pH 8,4, 0,1% gelatin,1% Triston X- 100 Primer Fvà R:10µM Chuẩn bị 25µl dung dịch có thuật ngữ là “cocktail” bao gồm DNA 1µl 10xdung dịch buffer 2,5µ Mỗi primer 1µl Dung dịch stock dNTP 1µl Taq polymerase 0,1µl Thêm nước cất hai lần, sao cho đủ 25µl Chu kỳ nhiệt trong thermal cycler thí dụ tìm đa hình của Sacl, clon BS3, 4kb trong nguời) 940C trong 5 phút, theo sau là 30 chu kỳ 94 0C trong 30 giây 60 0Ctrong 30 giây 72 0C trong 1 phút Giữ mẫu trong 40C Hạn chế: 1. Kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên: PCR cho kết quả tốt với những đoạn DNA có độ dài nhỏ hơn 1,5 Kb. Trong vài trường hợp PCR không hoạt động với những đoạn lớn hơn 3Kb. Với những độ dài lớn hơn điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. 2. Mức độ ngoại nhiễm cao: nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước: việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm khiến các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí sẽ bám vào tường, dụng cụ, thiết bị. ..dễ dàng nhiễm vào phản ứng tiến hành sau đó. Biện pháp khắc phục: - Các công đoạn thao tác khác nhau: thiết lập phản ứng PCR, phân tích sản phẩm khuếch đại …phải tiến hành ở những địa điểm khác nhau. - Dụng cụ của từng công đoạn, thao tác phải sử dụng riêng biệt khi hút dung dịch phản ứng - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phẩn tử còn lại từ các lần khuếch đại trước. - Mọi thành phần của phản ứng phải chia thành nhiều lượng nhỏ (đủ với 1,2 lần thao tác) Trước lần phản ứng kế tiếp, thêm vào dung dịch phản ứng enzyme uracylglycosylase, có tác dụng phân huỷ tất cả các DNA mang dUTP nhiễm từ lần trước đồng thời enzyme sẽ bị phân huỷ bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên. 3. Sự kém trung thực của quá trình tổng hợp bởi Taq polymerase: việc tổng hợp DNA in vitro nhờ Taq polymerase có độ chính xác không cao: 2.10-4.Trong một phản ứng với 30 chu kì, tần suất sai số tổng thể 0,25%. Do đó bất kì một trình tự nào có được từ phương pháp PCR đều cần được xác nhận lại bằng cách xác định trình tự của nó. Taq polymerase biểu hiện tính chính xác khá thấp in vitro, làm xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên bên trong vùng khuếch đại, vì thế đoạn được khuếch đại phải được xác định trình tự càng khó nếu kích thước lớn. Ngày nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ có thể làm đơn giản hoá phản ứng PCR cho phép nó được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử như là một routine procedure. IV. THIẾT KẾ CÁC PRIMER Việc chọn lọc primer nào đó là một thử thách cực kỳ quan trọng khi chúng ta muốn sử dụng PCR có hiệu quả và độ trung thực cao. Nhằm đạt được thành công trong việc khuếch đại của PCR, chúng ta phải có một thiết kế chính xác về oligonucleotide primer. Sequence của primer được chọn chính xác kích thước, vị trí của sản phẩm PCR, cũng như nhiệt độ Tm vùng được khuếch đại. Primer được thiết kế đúng có thể giúp chúng ta tránh tạo ra những sản phẩm PCR không chuyên biệt, giống như hiện tượng phân biệt giữa cDNA và DNA của genome trong RNA-PCR. 4.1.Thông số cơ bản để thiết kế primer Mục đích của thiết kế primer là có được một cân bằng giữa hai kết quả: sự chuyên tính và sự hiệu quả của PCR: Sự chuyên tính được xem xét trên cơ sở xuất hiện bao nhiêu lần hiện tượng priming nhầm trên tổng số lần priming (sự lai giữa primer và dây template tại vị trí mục tiêu của nó). Tính hiệu quả của một primer là làm thế nào tiếp cận với lý thuyết về kết quả sản phẩm, trong mỗi chu kỳ PCR, một cặp primer có thể khuếch đại ra một sản phẩm. Mỗi chuỗi mã DNA nào đó đã được cung cấp,người ta có thể phân tích primer trên phần mềm máy tính,để có thể cân bằng giữa hai mục tiêu nói trên. 4.1.1 Chiều dài primer Sự chuyên tính thường được điều khiển bởi chiều dài của primer và nhiệt độ trong quá trình annealing. Oligonucleotid có kích thước 18-25 base có xu thế trở thành squence rất chuyên tính, nếu nhiệt độ annealing của PCR được thiết kế xê xích vài độ so với Tm của primer (nhiệt độ lý thuyết ). Primer có chiều dài càng lớn, sự chia các template để được quấn đôi với primer càng nhỏ. Trong khi khuếch đại theo hàm số mũ, một sự cố nhỏ của quá trình annealing cũng sẽ làm suy giảm kết quả của sản phẩm PCR. (Để tối ưu hoá PCR, người ta sử dụng primer có chiều dài tối thiểu sao cho đảm bảo nhiệt độ melting khoảng 540C, hoặc hơn chút ít, điều này sẽ cung cấp những cơ hội tốt nhất để duy trì sự chuyên tính và mức độ hiệu quả cao. Những oligonucleotide ngắn (15 base hoặc ngắn hơn) được dùng một cách hạn chế trong nhiều qui trình PCR, thí dụ như primer ngẫu nhiên trong mapping các genome đơn giản (Liang và Pardee 1992, Wiliam 1990). Tuỳ thuộc vào kích thước genome của sinh vật, chúng ta sẽ có một độ dài tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide. Nếu cDNA thuần khiết được sử dụng, hoặc nếu DNA của genome không có, thì chiều dài có thể giảm xuống, để mức độ rủi ro do hiên tượng tương tác không chuyên tính giữa primer và dây template sẽ giảm. Người ta thường thiết kế primer có độ dài 18-24 mer. Mặt khác, primer càng ngắn, quá trình quấn đôi giữa primer và dây DNA càng nhanh, tạo thành dây đôi ổn định trong tổng hợp DNA. Thông thường, primer có 28-35 mer cần cho việc khuếch đại các sequence có mức độ dị hợp cao (Có hai khả năng áp dụng trong thiết kế chiều dài của primer: Khuếch đại nhhững phần tử có tính đồng dạng (isoform)của protein hoặc một họ protein trong cùng một loài sinh vật, cũng như cloning một gen của loài khác mà sequence của nó rất cần thiết cho nhà nghiên cứu (dveksler và ctv.1993) Khuếch đại những sequence của virut như HIV-1, mà sự biến thiên của sequence, sự có mặt của sequence, sẽ xác nhận sự có mặt của bệnh do virut gây ra. Trong cả hai trường hợp, người ta đều nhờ phần mềm của máy tính để thiết kế primer, nhằm so sánh tất cả các sequence có liên quan và mô tả vùng của DNA mục tiêu với số lượng thấp nhất sự biến thiên của chuỗi mã. Khi chọn lựa primer để khuếch đại DNA từ những loài sinh vật khác nhau, chúng ta nên tránh chuỗi mã ở vùng không giải mã được 5’-3’ của mRNA. Bởi vì nó có thể không có bất cứ một mức độ tương đồng nào (homology) (Vị trí đầu 3’ của primer nên được xác định cẩn thận, vì nó có tính chất quyết định cho sự thành công của PCR. Khi chúng ta xác định được một amino acid, hai base đầu tiên trong codon của nó, hoặc base trong trường hợp nó được mã hoá bằng codon đơn (methionine và tryptophan), thì 2 hoặc 3 base đầu tiên này được dùng như đầu 3’. Những cặp base hoàn chỉnh giữa những đầu 3’ của primer và template cho phép chúng ta có được kết quả mong muốn và giảm thiểu tối đa hiện tượng không tương xứng (mismatches) trong khoảng 5-6 nucleotide tại đầu 3’ của primer Thông thường, sự thêm vào sequence không có liên quan tại đầu 5’ của primer vẫn không làm thay đổi quá trình annealing. Trong một vài trường hợp, khi số lượng base nhiều lên có ý nghĩa, những base này không tương xứng với sequence của dây template, được thêm vào primer. Sự khuếch đại 4-5 chu kỳ sẽ có thể hoàn tất, trong điều kiện nhiệt độ annealing thấp. Đối với những primer ngắn hơn 20 mer, Sugg và ctv (1981) đã đề xuất một công thức tính Tm liên hệ với các base: Td=4(G+C)+2(A+T) Trong khi primer dài hơn, tính toán này chỉ có giá trị gần đúng. Sau này nhờ phương tiện computer, Breslauer và ctv (1986),Freier và ctv(1986)đã thiết kế PCR primer theo chương trình cài đặt sẵn, khá tiện lợi. 4.1.2.N ucleotide cuối cùng của primer Nhiệm vụ của đầu 3’ trong primer là kiểm soát hiện tượng priming nhầm (Kwok và ctv. 1990).nhiệm vụ khác của nó là ngăn ngừa hiện tượng tương đồng (homology) trong cùng một cặp primer, chúng ta phải thận trọng vì primer không phải là sự kiện cái này bổ sung cho cái kia, đặc biệt tại đầu 3’ của nó. nếu không thận trọng trong việc xác định đầu 3’,hiện tượng primer –dimers sẽ xẩy ra,với tính chất bổ sung cho nhau, sản phẩm PCR lúc bấy giờ sẽ là một sự khuếch đại của chính primer, chớ không phải DNA template mà ta mong muốn. trong trường hợp có nhiều cặp primer đưa vào trong cùng một phản ứng (multiplex PCR), Chúng ta cần phải kiểm tra gấp đôi hiện tượng bổ sung cho nhau của tất cả primer. thông thường trong chương trình cài đặt sẵn của computer, không cho phép cặp primer có sự tương đồng về đầu 3’,nhằm giảm cơ hội xuất hiện hiện tượng primer-dimers(Chouvà ctv.1992). 4.1.3. Hàm lương GC và Tm Primer của PCR phải duy trì được hàm lượng GC đến mức có thể được. Những oligonucleotide có 20 base, với 50% G+C,thường có giá trị Tm trong khoảng 56-620C,tạo ra điều kiện để quá trình annealing đạt kết quả tốt. Hàm lượng GC và Tm phải khớp với một cặp primer sẽ được thiết kế. nếu giá trị Tm càng lớn, cơ hội cho priming nhầm càng cao. Do đó khi thiết kế primer, chúng ta phải chú ý đến hàm lượng GC, đôi khi do làm nhiều mẫu, chúng ta sẽ có những kinh nghiệm riêng trong thiết kế primer, nhất là việc chuyển đổi sequence của RFLP sang STS marker. 4.1.4. Chon loc không dưa trên computer Primer phải được chọn lọc từ những vùng được cô tả rất kỹ ở đầu 3’và đầu 5’của một sequence rất chuyên tính nào đó. Phương pháp thiết kế primer đơn giản ở đây là: chọn những vùng có thiếu một nucleotide đơn nào đó.Phương pháp chọn lọc primer như vậy là cách làm giảm cơ hội xẩy ra hiện tượng tương đồng primer-primer.một lần nữa, chúng ta phải thận trọng cân nhắc về chiều dài cặp primer, hàm lượng base,để giá trị Tm của primer xê xích trong vòng 2-30C 4.2. Sử dụng phần mềm để thiết kế primer Công thức đầu tiên của Suggs và ctv(1981)là:20Cx(A+T)+40Cx(G+C)đã trở nên phổ biến nhờ tính đơn giản và tính chính xác của nó. Hai chương trình sử dụng hơi khác nhau một chút về cách tính toán, nhưng cùng cho ra một primer được chọn, nếu chúng ta nhập vào những thông số cơ bản giốnh nhau. . Những sai biệt do phép tính khác nhau dẫn đến thứ tự ưu tiên trong tiêu chuẩn chọn lọc đã và đang được áp dụng. Người ta thực hiện các phương án để dự đoán giá trị Tm trên cơ sở các thông số nhiệt động học. Trong chương trình khác, người ta mô hình hoá nhiệt độ annealing dựa trên công thức được phát triển từ các đoạn phân tử DNA có độ dài hơn 100 nucleotide (MeConaughy và ctv.1969).Công trình nghiên cứu của Rychlik và ctv(1990)cho phép chúng ta mô hình hoá về nhiệt độ annealing tối hảo của một cặp primer. Sau đó, Wu và ctv (1991)đã dựa trên chiều dài primer, hàm lượng GC,để mô hình hoá nhiệt độ tối hảo này. Hầu hết các chương trình đều nhằm tìm một nhiệt độ annealing thích hợp cho PCR. Ngày càng có nhiều chương trình cải tiến với độ chính xác càng cao, đã được nhiều phòng thí nghiệm ứng dụng. Để thiết kế tốt các primer cấn chú ý những điểm sau: Oligo nucleotide không có quá nhiều A hoặc T Tuỳ vào phần mền của chương trình thiết kế trong máy tính Có kinh nghiệm trong việc thiết kế primer Chuỗi mã primer (mã di truyền không quá ngắn) Nhiệt độ trong khi tách và tổng hợp primer phải hợp lý Nếu mã di truyền phải thiết kế là 20 base thì nhiệt độ phải là: Tm=4x(G+C)+2x(A+T) Ví dụ với primer:5’-AGACTCAGAGAGAACCC-3’ Như vậy, chúng ta có 4G,5C,7A và 1T Nhiệt độ Tm=(4*9)+(2*8)=36+16=520C Và kết quả thiết kế là đoạn primer như sau:5’……3’F(viết tắt của chữ forward)và 5’……3’R(viết tắt của chữ reverse) V.CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PCR DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100 ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc, giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế được khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn. Một ưu điểm khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân huỷ từng phần như trong các vết máu lâu ngày, tinh dịch đã khô, hoá thạch, tóc, móng tay,của người đã chết …. Enzyme Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. vì đây là không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp ( phải thêm enzyme mới vào phần phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị phân huỷ do nhiệt, nhiệt độ lai thấp khiến sự khuếch đại ký sinh rất cao, …). Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus. En zym này – Taq polymerase không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme chiết tách từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn++; nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg++, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại bản mẫu là RNA khuôn thông qua sự hình thành cDNA Mồi và nhiệt độ lai Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc: Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi . Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotid của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. Các mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn ; phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb Các phần khác của phản ứng PCR Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase Nồng độ ion Mg ++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình PCR. Tuy nhiên không có quy luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Số lượng chu kỳ phản ứng PCR : Trong thực tế, người ta không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân với tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm dần vì những nguyên nhân sau: Sự phân huỷ cạn và kiệt các thành phần của phản ứng. sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng. Các bản sao vừa được tổng hợp không két hợp với mồi mà bắt cặp với nhau…. Số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu. Ví dụ, nếu số lượng bản mẫu là 105 thì cần 25-30 chu kì, nếu số lượng bản mẫu là 102 – 103 thì số chu kì phải là 35-40,… Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: Thực chất một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã được cải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng, hay cho phép tiến hành PCR ngay trên mô tế bào, …Tuy nhiên, mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nen mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị.