Thực hành Pipet Tốt

Thực Hành Pipet Tốt Biotechnology Centre of Ho Chi Minh City. 02 June / Athena Pham Những lỗi dùng pipets dẫn đến các thí nghiệm không thành công!
Mục tiêu: lây nhiễm sang chuột bằng virus Cytomegalovirus ở LD50 của 1.5 x 106 PFU - Vấn đề quan trọng là lây nhiễm với nồng độ không được quá thấp, hoặc quá cao 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 1.5 2 L e t h a l i t y % Viral Dose (x106 PFU) Lethal Dose Curve
Trước khi thí nghiệm, virus gốc sẽ phải được pha loãng lần lượt 10 lần để xác định nồng độ virus. - Đây là qúa trình chịu ảnh hưởng rất nhiều của kĩ thuật pipet - Các lỗi dùng pipet sẽ được tích lũy 10ul 10ul 10ul 10ul 10ul 100 ul 90ul 90ul 90ul 90ul 90ul Thử nghiệm với nồng độ vừaNồng độ quá cao: loại bỏ 3 Những lỗi dùng pipets dẫn đến các thí nghiệm không thành công!
Những lỗi tích lũy khi dùng Pipet sẽ dẫn đến nồng độ của dung dịch gốc quá thấp hoặc quá cao so với mong đợi
Điều này dẫn đến không đúng liều tiêm, làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm Lỗi đã tích lũy % +5% Hệ số lỗi của pipet Hệ số chuẩn -5% Hệ số lỗi của pipet Lỗi đã tích lũy % 5 105000 100000 95000 -5 10.25 11025 10000 9025 -9.75 15.76 1157.62 1000 857.37 -14.26 21.55 121.55 100 81.45 -18.55 27.63 12.76 10 7.73 -22.62 34.01 1.34 1 0.73 -26.49 Overestimated titer leads to under-inoculation Underestimated titer leads to over-inoculation BOTH lead to FAILURE Ảnh hưởng của các lỗi dùng pipet theo ước tính 4 Evaluation and Selection
Hướng dẫn thực hành tốt pipets giúp cải thiện tính chính xác và độ lặp lại của nhiều ứng dụng khoa học và đời sống. - Đánh giá và lựa chọn - Kỹ thuật thao tác pipet - Hiệu chỉnh và vận hành. 5 Kế hoạch và quy trình làm việc Ứng dụng hay thí nghiệm Quy trình làm việc —từ mẫu ban đầu kết dữ liệu cuối cùng Số lượng mẫu yêu cầu cho việc thiết lập dữ liệu Định dạng cần thiết để đáp ứng nhu cầu với hiệu quả cao Công cụ cần thiết để đáp ứng nhu cầu công việc Xem xét hiệu quả/ thời gian 7 Đánh giá và lựa chọn 1. Đánh giá tính chất của chất lỏng : • Chất lỏng có tính chất tương tự như nước • Chất lỏng đặc biệt: đặc, nhớt, dễ bay hơi. Air Displacement Pipet thông thường Piston với Gioăng đệm Điểm cuối của dung dịch lỏng Khoảng trống không khíĐầu tip Mẫu Positive Displacement Pipet piston Dung dịch lỏng Ống mao quản Dùng một lần Piston seal Piston dùng một lần Mẫu Không có khoảng trống không khí 8 Lựa chọn Air Displacement Positive Displacement ( Pos-D) 9 Khuyến cáo từ Rainin 10 Đánh giá và lựa chọn 2. Đánh giá phương pháp xử lý chất lỏng : Pipet điện tử đa chức năng: pipet cơ bản, xả lặp lại, trộn, chuẩn độ, pha loãng Pipet lặp lại – AutoRep E Electronic dispense Pipet lặp lại – AutoRep S Manual dispense 11 Lựa chọn cho phương pháp ELISA + Pipet đơn kênh Adjustable spacer Pipet đa kênh, có thể thay đổi khoảng cách giữa các kênh Pipet đa kênh 13 Tối ưu hóa các quy trình làm việc • Thời gian chờ giữa các giếng như nhau • Hoàn thành 96 giếng chỉ trong vòng 6s Liquidator 96 15 Đánh giá và lựa chọn 3. Đánh giá lượng chất lỏng cần xử lý : Macropipet: 5,10,20 mlMicropipet : 0.1- 2000ul Pipet X Controller: xử lý được lượng lớn mẫu lên đến 100ml 17 Đánh giá và lựa chọn 1. Đánh giá tính chất của chất lỏng. 2. Đánh giá phương pháp xử lý chất lỏng. 3. Đánh giá lượng thể tích chất lỏng 18 Type of Sample solution 19 For internal use - Confidential Lựa chọn đầu tip Lựa chọn đúng đầu tip tăng độ chính xác và độ lặp lại
Thiết kế
Chất lượng
Phù hợp 20 For internal use - Confidential Thiết kế Fine Point 21 For internal use - Confidential Specialty Tip Designs Wide Orifice: đầu tip mở rộng bề mặt tiếp xúc Gel-loading (Gel-Well): đầu tip cho các mẫu dạng gel , dùng cho các ứng dụng giải mã AND hay tách phân tử protein Filter tip: đầu tip chống bay hơi Filter Low-Retention: đầu tip chống bám dính Extended Length: đầu tip nối dài Shaft protection (ShaftGard): đầu tip bảo vệ thân 22 Tip Physical Quality Orifice of high-quality tip Orifice with flashCoaxial defect Tear defect Some poor-quality tip problems 23 Tip Biochemical Quality 24 For internal use - Confidential Đầu tip phù hợp
Đầu tip và pipet không khít với nhau có thể làm giảm độ chính xác của kết quả pipet
Khuyến cáo: nên sử dụng pipet và đầu tip của cùng hệ thống 25 For internal use - Confidential 28 Kĩ thuật thao tác 28 Kỹ năng cơ bản để giảm thiểu rủi ro. 1. Tối ưu dải thể tích đo 2. Cài đặt micometer 3. Rửa đầu tips trước khi hút mẫu 4. Góc nhúng đầu tips 5. Độ sâu khi nhúng đầu tips 6. Thời gian nhúng đầu tips 7. Tốc độ hút mẫu 8. Những kỹ thuật xả mẫu 9. Những ảnh hưởng của tay khi thao tác (làm ấm pipet) 29 29
Dải thể tích quy định - 10−100% thể tích pipets
Thể tích khuyên dùng - Thông thường 35−100% thể tích - Dưới 35% thì phụ thuộc vào kỹ thuật cao Sử dụng pipet phù hợp với thể tích 30 % sai số % thể tích 10 50 100 Nếu sử dụng thể tích dưới 10% của pipet có thể ảnh hưởng đến độ chính xác hơn 3% Độ chính xác Độ đúng Thể tích tối đa của Pipette % thể tích µL % µL (±) % µL (≤) 2 µL 100% 2.0 1.5 0.030 0.7 0.014 50% 1.0 2.7 0.027 1.3 0.013 10% 0.2 12 0.024 6 0.012 30
Điều chỉnh quá 1/3 vòng so với thể tích mình mong muốn.
Sau đó điều chỉnh ngược lại về thể tích cần.
Thao tác như thể với các thể tích khác nhau, với các lần khác nhau. Cài đặt Micrometer Correctly setting the micrometer improves accuracy up to 0.5%. 31 Thực hiện thao tác này có thể giảm ảnh hưởng tới 0.5% 31
Hút mẫu vào đầu tips và sau đó xả ngược lại hoặc xả ra cốc thải để tráng rửa đầu típ.
Rửa trước đầu tips đảm bảo cho tất cả các phần phía trong được tiếp xúc với dung dịch. Bên cạnh đó là tráng rửa đầu tips
Rửa trước với mẫu mình cần xả Rửa trước đầu Tips Rửa trước 2 lần giúp tăng độ chính xác tới 0.2% với những mẫu nước. 33 Bấm và nhả pipton hai hoặc ba lần để rửa đầu tips Góc nhúng đầu tips (đầu côn) 35 Aspirating with the pipette perpendicular improves accuracy up to 0.5%, ultramicro up to 2.5%. Góc nhúng sai Góc nhúng đúng Thao tác đúng có thể giảm ảnh hưởng độ chính xác tới 2.5% Độ sâu khi nhúng đầu tips 36 Thao tác đúng có thể tăng độ chính xác tới 1%, còn với ultra-micro tới 5%. 0.1 -10 µL: 1-2 mm 10 -200 µL: 2-3 mm 200-2000 µL: 3-6 mm Over 2000 µL: 6-10 mm Thời gian chờ cho pipets thể tích micro
Vẫn ngâm đầu tips trong dung dịch và đợi ít nhất 1 giây sau khi hút mẫu lên.
Sau đó từ từ rút đầu tips ra khỏi dung dịch
Điều này rất quan trọng đối với mẫu lượng lớn (thể tích mẫu lớn) và những mẫu nhớt cao 39 Kỹ thuật xả mẫu
Có ba kỹ thuật: 1. Xả bên cạnh ống 2. Xả bên trên bề mặt 3. Xả trong dung dịch
Những điểm cần lưu ý: - Tạm dừng trước khi xả với mẫu có độ nhớt. - Nếu xả trong dung dịch, cần giữ piton ở vị trí stop thứ 2 cho đến khi đầu tips được lấy ra khỏi dung dịch. Tránh làm mẫu bị hút ngược vào pipets. 40 1 2 3 Việc xả mẫu đúng cách có thể giảm ảnh hưởng tới 1% 42
Sử dụng tính thống nhất (nhất quán) - Sử dụng pipet nhịp nhàng - Áp lực lên piton phải đồng đều - Tốc độ và êm ái
Để nhất quán tốt nhất: Sử dụng pipet điện tử - Sẽ đem lại tính nhất quán tối ưu - Yêu cầu ít nhất kỹ năng của người dùng Tính nhất quán Hạn chế ảnh hưởng của việc làm ấm pipet khi cầm To avoid hand warming the pipette, use a high-quality instrument and place it on a stand when not in use. 43 Để hạn chế ảnh hưởng làm ấm pipet khi cầm, ta sử dụng pipet có chất lượng cao. Và dùng giá treo khi không sử dụng. Kĩ thuật pipet xuôi 44
Load tip
Touch off
Hold 1s 44 Pipet ngược là gì?
Pipet ngược là quá trình bắt đầu bằng việc ấn plunger xuống vị trí dừng thứ 2, do đó sẽ bao gồm thêm một lượng thể tích dư trong quá trình hút mẫu, mà không bao gồm trong lúc xả cuối.
Pipet ngược thường được sử dụng vào việc liên quan đến mẫu máu, mẫu ngưng tụ và vật liệu có độ nhớt. 46 What is Reverse Pipetting? 47 Tổng quan các lỗi thường gặp trong pipet 48 Lỗi nhỏ là quan trọng hơn đối với những kỹ thuật hiệu chuẩn Với người dùng nên hạn chế những lỗi trung bình và lỗi lớn.. Mức độ nghiêm trọng Kỹ thuật Lỗi nhỏ <1%
Cách cài đặt Micrometer (nếu việc lựa chọn thể tích là tối ưu.)
Góc nhúng đầu tip
Rửa trước đầu tip
Cầm nắm pipet (làm ấm pipet) Lỗi trung bình 1-5%
Dải thể tích tối ưu
Độ sâu nhúng đầu tip.
Tốc độ hút mẫu (không đồng nhất)
Kỹ thuật xả mẫu Lỗi lớn 5-25%
Độ ngập đầu tip / góc nghiêng (đối với ultra-micro)
Tốc độ hút mẫu (splash-up tạo bọt khí..)
Sử dụng pipet air displacement cho những mẫu đặc biệt (nhớt, bay hơi, nóng , lạnh..) Trò chơi nhỏ Ma sát nhỏ Điểm dừng trong đầu tip Lực ma sát lớn LTS tip Traditional tip Đầu Tip LTS giảm lực ấn đầu tip từ 3kg xuống còn 0.6kg 49 Tư thế thao tác Tác động theo thời gian có thể ảnh hưởng cơ, gân và dây thần kinh 50 For internal use - Confidential Khuyến cáo từ Rainin
Đầu tip được thiết kế để sử dụng 1 lần. Không nên làm sạch và tái sử dụng vì đặc tính đo lường của nó sẽ không còn đáng tin cậy.
Tránh lau hoặc thấm đầu tip bằng bất kỳ cách nào, thậm chí từ bên ngoài, trong khi chất lỏng đang ở bên trong đầu tip. Điều này làm cho dung dịch có xu hướng chảy ra khỏi đầu tip, dẫn đến giảm độ chính xác
Thường xuyên kiểm tra phần đầu pipet xem còn khít với đầu tip không 51 For internal use - Confidential Khuyến cáo từ Rainin
Sử dụng găng tay để tăng độ chính xác
Luôn treo pipet thẳng đứng trên giá để nước / khí ngưng tụ có thể chảy ra
Luôn gắn 1 đầu tip ( với pipet 10ul hoặc nhỏ hơn) vào pipet, kể cả khi không sử dụng để bảo vệ phần đầu pipet
Với pipet đa kênh: sau khi hút phải kiểm tra mực chất lỏng trên tất cả các kênh 52 For internal use - Confidential 55Kiểm tra và hiệu chỉnh
Module 4 & 5: Hiệu chuẩn và vận hành  Bảo trì  Kiểm tra định kì  Hiệu chuẩn 56Cấu tạo pipet 56 Bảo trì pipet tại phòng thí nghiệm Bảo trì pipet thường xuyên tăng tỉ lệ Đạt khi hiệu chuẩn lên 25- 35%
Vệ sinh pipet - Kiểm tra phần shaft, piston, seals và o-rings. Vệ sinh bằng dung dịch de-ion, lau khô toàn bộ bên trong và bên ngoài - Loại bỏ các chất nhiễm bẩn lo ngại như DNA và RNAse, bằng các nhiều giải pháp kể cả dung dịch 10% thuốc tẩy hoặc RNAse Zap. - Tránh làm sạch bằng các dung môi có tính ăn mòn
Khuyến cáo: - Dù không có nứt gãy vẫn nên thay thế o-ring hàng năm - Hiệu chuẩn là không cần thiết nếu pipet được bảo trì thường xuyên, ngoại trừ trường hợp thay thế piston ( bởi nhà cung cấp) 57 For internal use - Confidential 58 Có 2 phương pháp kiểm tra pipet :
Gravimetric Quick Check : cân khối lượng
Leak testing: kiểm tra rò rỉ Kiểm tra định kì 58 Verification results specify whether calibration is necessary.Kết quả sẽ xác định xem việc hiệu chuẩn có cần thiết hay không 59Tỉ lệ hiệu chuẩn Khuyến cáo:  Kiểm tra định kì hàng ngày/ tuần/ tháng/ quý tùy theo nhu cầu để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm  Hiệu chuẩn tại phòng thí nghiệm của bạn để đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại của pipet Accuracy và Precision Độ chính xác- Accuracy độ chính xác là lượng sai khác giữa giá trị trung bình của rất nhiều phép thử với giá trị danh nghĩa. Một kết quả đo được gọi là chính xác khi nó gần với giá trị đúng. Độ đúng (độ lăp lại)- Precision là sự đánh giá bằng số của sự thay đổi của một số phép đo lặp lại như- độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. 63 For internal use - Confidential Thông số kĩ thuật của pipet Data from manufacturers specifications: this data can vary dependent on the user technique and many other factors Độ chính xác Accuracy Độ đúng Precision Thể tích tối đa % thể tích µL % µL (±) % µL (≤) 2 µL 100% 2.0 1.5 0.030 0.7 0.014 50% 1.0 2.7 0.027 1.3 0.013 10% 0.2 12 0.024 6 0.012 10 µL 100% 10 1 0.1 0.4 0.04 50% 5 1.5 0.075 0.6 0.03 10% 1 2.5 0.025 1.2 0.12 20 µL 100% 20 1 0.2 0.3 0.06 50% 10 1.5 0.15 0.5 0.05 10% 2 7.5 0.15 2 0.04 100 µL 100% 100 0.8 0.8 0.15 0.15 50% 50 0.8 0.4 0.24 0.12 10% 10 3.5 0.35 1 0.1 200 µL 100% 200 0.8 1.6 0.15 0.3 50% 100 0.8 0.8 0.25 0.25 10% 20 2.5 0.5 1 0.2 64 Thông số kĩ thuật của nhà sản xuất và ISO 8655 ISO 8655
Với các nhà cung cấp : là cơ sở cho việc kiểm soát chất lượng và công bố chất lượng của nhà cung cấp
Với các cơ quan kiểm tra : là cơ sở để cấp một chứng chỉ độc lập
Với người sử dụng : cho phép kiểm tra định kì chính xác 65 For internal use - Confidential Hiệu chuẩn
Tiêu chuẩn đánh giá : ISO 8655
Tiêu chuẩn môi trường  Nhiệt độ: [± 0,5 ° C], 15- 30 ° C  Độ ẩm tương đối - ˃50%  Gió - ~ 0  Tỉ lệ bay hơi - ~ 0  Rung - ~ 0  Độ cao - ~ 0 66 For internal use - Confidential 67Tiêu chuẩn cân dùng để hiệu chuẩn 68Cân và các thiết bị hiệu chuẩn pipet Pipette calibration MCP2-5 MCP1-S XP26PC Phần mềm hiệu chuẩn XP Analytical & XP Micro + evaporation trap Weighing table SAG-P +evaporation trap AX + evaporation trap