Thu nhận bột đạm giàu Astaxanthin từ phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon bằng protease và lipase kết hợp

Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 383 THU NHẬN BỘT ĐẠM GIÀU ASTAXANTHIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ PENAEUS MONODON BẰNG PROTEASE VÀ LIPASE KẾT HỢP *Nguyễn Lệ Hà; Huỳnh Hoa Nhi; Nguyễn Đăng Khôi; Hồ Thị Kim Thu; Nguyễn Ngọc Thảo My; Nguyễn Ngọc Linh; Nguyễn Hùng Nam Trường Đại học Công nghệ TP.HCM Email: *nl.ha@hutech.edu.vn TÓM TẮT Nghiên cứu này thực hiện thủy phân phế liệu đầu tôm sú lần lượt bằng protease và lipase kết hợp nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin. Đã xác định được chế độ thủy phân thích hợp gồm 2 giai đoạn: Đầu tiên thuỷ phân bằng Alcalase ở 600C, trong 2 giờ, với nồng độ enzyme 0,5%, tiếp đó phần bã thu được sau khi thủy phân bằng Alcalase sẽ thủy phân với Lipase nồng độ 0,3%, trong 3 giờ ở 400C. Bột đạm giàu astaxanthin thu nhận sau thuỷ phân được đông khô có các thành phần và tính chất phù hợp cho mục đích thực phẩm. Từ khóa: đầu tôm, astaxanthin, thủy phân, bột đạm thuỷ phân. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong phế liệu đầu tôm có một lượng lớn protein, chitin đặc biệt là chất màu astaxanthin (Klomklao, 2008), hợp chất sinh học đang ngày càng thu hút sự chú ý từ các nhà sản xuất và chuyên gia sức khỏe. Tính đến hiện tại, astaxanthin thương mại chủ yếu được thu nhận từ tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Phaffia. Đã có một số nghiên cứu thực hiện chiếc rút astaxanthin từ phế liệu đầu tôm bằng dung môi hóa học hay hữu cơ, một số khác thuỷ phân bằng protease. Tuy vậy, việc sử dụng các tác nhân hóa học hay hữu cơ đều có các một số nhược điểm nhất định, do vậy, hạn chế ứng dụng của sản phẩm thu được. Nghiên cứu này hướng đến quá trình thuỷ phân đầu tôm bằng enzyme nhằm mục đích thu nhận bột đạm giàu astaxanthin với hiệu suất thu hồi cao, phù hợp mục đích thực phẩm và góp phần bảo vệ môi trường. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Đầu tôm nuôi tại Cà Mau được thu tại bàn chế biến của nhà máy thủy sản xuất khẩu Ngọc Sinh. Đầu tôm rửa sạch và cấp đông ở -400C, sau đó bảo quản ở -180C cho đến khi tiến hành thí nghiệm. Các enzyme sử dụng trong đề tài gồm Alcalase LFG 2.4 1128 của Novozyme và Lipase L 3126 của Sigma. Hoá chất sử dụng thuộc nhóm hoá chất phân tích. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 384 Thu nhận bột đạm giàu astaxanthin Đầu tôm đông lạnh được làm nhỏ 2-3 mm, sau đó gia nhiệt ở 95oC trong 10 phút rồi bổ sung nước với tỉ lệ đầu tôm: nước là 1:3 (w/v). Hỗn hợp được bổ sung Alcalase với nồng độ cần thiết (0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 và 0,6%) và thực hiện thủy phân ở các nhiệt độ 45, 55, 60, 650C, khuấy trộn mỗi nửa giờ. Vào các thời điểm định trước, mẫu được lấy ra, lọc qua nhiều lớp vải thô, dịch lọc được kết tủa bằng HCl 10% đến khi đạt pH thích hợp cho kết tủa carotenoprotein, thêm dung dịch chitosan đến nồng độ 100ppm, sau đó để lắng ở 4oC trong 2 giờ. Bột nhão protein- astaxanthin thu nhận bằng cách ly tâm 40 phút ở 4.000 vòng/ph. Sau đó, bã đầu tôm sau lọc được gia nhiệt đến 85oC để bất hoạt Alcalase rồi tiếp tục thuỷ phân bằng Lipase ở các nhiệt độ 30; 35; 40; 450C, với nồng độ enzyme lipase lần lượt là 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5% và thu bột nhão tương tự trên. Cả hai bột nhão được đông khô ở -40oC để thu thành phẩm. Xác định pH thích hợp cho kết tủa bột đạm-astaxanthin từ dịch thủy phân phế liệu tôm Việc xác định pH thích hợp cho kết tủa carotenoprotein được thực hiện theo phương pháp của Klomklao (2009) và Chakrabarti (2002) có đôi chút chỉnh sửa như sau: Hỗn hợp đầu tôm chuẩn bị như trên được thủy phân bằng Alcalase với nồng độ 0,1%, thời gian thủy phân 30 phút ở nhiệt độ 45oC, dịch carotenoprotein thu nhận sau lọc được bổ sung HCl 10% đến khi đạt pH 4; 4,5; 5; 5,5; 6 rồi thêm chitosan để đạt nồng độ 100ppm, sau đó lắng ở 4oC trong 2 giờ. Quá trình ly tâm được thực hiện 40 phút,4.000 vòng/ph để thu dịch trong và bột nhão. Hàm lượng protein hòa tan của dịch trong được xác định bằng phương pháp Bradford (1976), hàm lượng astaxanthin của bột nhão được xác định bằng phương pháp Tolasa (2005). pH thích hợp để kết tủa thu bột đạm astaxanthin là giá trị pH cho độ hòa tan protein của dịch trong thấp nhất và hàm lượng astaxanthin trong bột nhão cao nhất. Phương pháp phân tích Hàm lượng astaxanthin được xác định bằng phương pháp Tolasa (2005) với chất chuẩn astaxanthin (Sigma). Hàm lượng tro xác định bằng phương pháp trọng lượng, nung ở 600oC. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford. (Bradford, 1976). Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Kjeldahl (Rao, MS và cộng sự, 2007). Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson cải tiến (Anson, M.L 1938), hoạt tính Lipase theo phương pháp Titrimetric ( Sigma - Aldrich Mỹ). Xác định độ ẩm bằng phương pháp trọng lượng , sấy đến độ ẩm không đổi ở 1050C (Phạm Văn Sổ và Bùi Thị Như Thuận, 1991). Hiệu suất thu hồi của chế phẩm đươc tính theo phương pháp Dauphin (Dauphin, 1991). Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được thực hiện song song ba lần, mỗi lần ba mẫu. Toàn bộ số liệu được phân tích ANOVA để kiểm tra sự khác biệt giữa các lần lặp lại và tính giá trị trung bình. Phân tích thống kê được thực hiện với phần mềm JMP 10 và đồ thị được vẽ trên phần mềm Excel. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 385 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định pH thích hợp cho kết tủa dịch thủy phân sau lọc nhằm thu protein và astaxanthin cao nhất Số liệu thực nghiệm cho thấy hàm lượng protein hòa tan trong dịch trong sau lọc thấp nhất, astaxanthin trong bột nhão cao nhất đều tại pH =4,5. Astaxanthin trong các loài giáp xác thường không tồn tại tự do mà nằm trong phức chất cùng với protein, vì thế, khi thu nhận protein có thể đồng thời thu được astaxanthin. Nếu điều chỉnh pH cao hơn cần thiết có thể protein chưa bị kết tủa hoàn toàn, làm giảm hiệu suất thu nhận. Nếu điều chỉnh pH thấp hơn thì mức độ keo tụ có thể giảm xuống, lúc này có thể nồng độ H+ dư nên một số protein tích điện dương yếu, đẩy nhau, liên kết giữa các phân tử protein yếu đi, tăng khả năng hydrat hóa, độ hòa tan của protein tăng lên và khó kết tụ. Hình 1: Hàm lượng protein(mg/g) trong dịch trong và astaxanthin (μg/g) trong bột nhão khi kết tủa dịch thủy phân ở các giá trị pH khác nhau Giá trị pH 4,5 cho hiệu quả kết tủa protein và astaxanthin tốt ở nghiên cứu này cao hơn so với giá trị 5,78 của dịch nghiền phế liệu tôm hồng Metapenaeus monoceros (Chakrabarti, 2002), cũng cao hơn so với pH kết tủa protein từ dung dịch máu cá trong qui trình chế biến cá tra đông lạnh (Trang Sĩ Trung, 2008). Nguyên nhân của điều này có lẽ là thành phần protein trong các nguyên liệu khác nhau, cũng có thể do dịch phế liệu tôm sau thủy phân có nhiều axit amin và peptid mạch ngắn, thành phần của các phần tử mang điện đã thay đổi nhiều so với nguyên liệu chưa thủy phân. Như vậy, pH 4,5 được chọn để tủa dịch thuỷ phân đầu tôm sau lọc và thu nhận bột đạm- astaxanthin. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 386 Quá trình thủy phân đầu tôm sú bằng Alcalase LFG 2.4 1128 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân bằng Alcalase theo thời gian Nghiên cứu tiến hành khảo sát qúa trình thủy phân với nồng độ enzyme là 0.1% ở các nhiệt độ 45; 55; 60 và 650C. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin theo thời gian thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau được trình bày ở hình 2 cho thấy hiệu suất này tăng dần khi nhiệt độ thuỷ phân tăng, đạt cực đại tại 60oC, sau đó giảm xuống. Điều này dễ hiểu, bởi vì hoạt độ enzyme tăng khi tăng nhiệt độ, nhưng nếu vượt qúa nhiệt độ biến tính protein thì enzyme (bản chất chính là protein) cũng bị vô hoạt. Đồ thị cũng cho thấy xu hướng tăng nhanh hàm lượng protein và astaxanthin theo thời gian thủy phân, đạt cực đại sau 2 giờ và sau đó giảm xuống ở tất cả các nhiệt độ. Có lẽ, Alcalase giữ hoạt tính tốt trong 2 giờ, sau đó không còn khả năng tốt như trước, các acid amin tạo thành bị vi sinh vật phân huỷ dần nên lượng protein giảm, astaxanthin cũng thóai hoá dần nên hàm lượng trong bột nhão giảm xuống. Hình 2: Hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin theo thời gian thuỷ phân ở các nhiệt độ khác nhau Ảnh hưởng của nồng độ Alcalase đến quá trình thủy phân Thí nghiệm tiến hành khảo sát nồng độ enyme cho từ 0.1 đến 0.6% với nhiệt độ thủy phân là 600C thời gian từ 0 giờ đến 5 giờ. Hình 3: Hiệu suất thu hồi protein và astxanthin theo thời gian ở các nồng độ khác nhau Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 387 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ Alcalase đến hiệu suất thu nhận protein và astaxanthin khi thủy phân đầu tôm trên hình 3 cho thấy, nồng độ enzyme sử dụng cho thủy phân càng cao thì hiệu suất thu protein và astaxathin cũng tăng tương ứng, đạt cực đại khi sử dụng nồng độ 0,5%, sau đó giảm nhẹ (p<0,05). Xu hướng này cũng được Klomklao (2009) ghi nhận khi thực hiện thuỷ phân vỏ tôm bằng tripsin cá xanh Pomatomus. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân bằng Lipase Bã đầu tôm sau khi thủy phân bằng Alcalase được gia nhiệt vô hoạt enzyme rồi tiếp tục thủy phân bằng Lipase với nồng độ 0.1% ở các nhiệt độ từ 30 đến 450C, kết quả thể hiện trong hình 4. Hình 4: Hiệu suất thu hồi protein theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau Các số liệu thực nghiệm cho thấy, quá trình thuỷ phân bằng Lipase cho hiệu suất tốt hơn nhiều so với Alcalase (gần gấp đôi). Đây là điều ngạc nhiên thú vị vì trong các nghiên cứu đã thực hiện trước kia đều chỉ chú ý đến việc dùng protease để thuỷ phân phế liệu tôm. Astaxanthin ở động vật giáp xác tồn tại trong phức chất với protein và nhóm lipid hay giả lipid (Nguyễn Lệ Hà, 2018) có lẽ là giải thích phù hợp cho điều này. Ngoài ra, cũng dễ thấy rằng, hiệu suất thu protein và astaxanthin có xu hướng tăng dần từ 0 giờ đến 3 giờ tại tất cả các nhiệt độ, sau đó giảm đáng kể, nhiệt độ thích hợp nhất giúp thuỷ phân đạt hiệu quả cao là 40oC. Nếu so sánh với quá trình thuỷ phân phế liệu tôm sú bằng chế phẩm protease của chính nó có thời gian tối ưu là 9h (Nguyễn Lệ Hà, 2013) thì việc sử dụng enzyme thương phẩm trong nghiên cứu này đã giúp rút ngắn đáng kể quá trình thuỷ phân. Ảnh hưởng của nồng độ Lipase đến quá trình thủy phân Việc thuỷ phân bã đầu tôm được thực hiện với nồng độ Lipase từ 0.1 đến 0.5% với nhiệt độ thủy phân 400C, thời gian từ 0 giờ đến 5 giờ. Xu hướng quan sát được từ đồ thị là khi tăng nồng độ Lipase lên thì hiệu suất thu nhận protein và astaxanthin cũng tăng lên, đạt cực đại tại nồng độ sử dụng 0.3% và sau đó không tăng nữa, thậm chí giảm nhẹ (không khác biệt, p<0,05). Tại nồng độ 0,3%, hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin lần lượt đạt 37,01% và 51,67%, cao hơn đáng kể so với khi thủy phân đầu tôm bằng Alcalase. Việc này mở ra triển vọng sử dụng enzyme protease và Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 388 lipase kết hợp để nâng cao hiệu suất thuỷ phân và đặc biệt giúp thu nhận astaxanthin tự nhiên từ phế liệu giáp xác. Hình 5: Hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin theo thời gian ở các nồng độ Lipase khác nhau Như vậy, quá trình thủy phân bằng Lipase để thu được hiệu quả cao nhất có thể chấp nhận là ở nồng độ enzyme 0.3% trong thời gian 3 giờ tại nhiệt độ 400C. Hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin cho thủy phân khi sử dụng kết hợp Alcalase và Lipase Khi sử dụng kết hợp Alcalase và Lipase, hiệu quả thuỷ phân nâng lên thật sự rõ rệt và được thể hiện trong biểu đồ ở hình 10. Điều đặc biệt trong nghiên cứu này là hiệu suất thu astaxanthin cao đáng kể, và có thể coi như mục tiêu chính cần đạt. Với nguyên liệu đầu tôm sú, Pham Thi Dan Phuong (2017) thu nhận dịch đạm thuỷ phân giàu astaxanthin (36% chất khô) bằng acid formic và Alcalase, sản phẩm thu được là dịch thủy phân có hàm lượng protein và astaxanthin lần lượt là 52,1% (d.b) và 192ppm, nếu so với số liệu của bột thu được khi dùng Alcalase và Lipase kết hợp trong nghiên cứu này (86,7% chất khô) là 67% và 865 ppm thì quá trình thuỷ phân bằng Alcalase và Lipase kết hợp tỏ ra cho hiệu quả thu nhận astaxanthin tốt hơn. Hình 6: Hiệu suất thu protein và astaxanthin khi sử dụng kết hợp Alcalase và Lipase Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 389 KẾT LUẬN Enzyme thương phẩm Alcalase và Lipase có thể sử dụng hữu hiệu để thủy phân phế liệu đầu tôm thu bột đạm giàu astaxanthin bằng cách thực hiện thuỷ phân theo hai giai đoạn: đầu tiên bằng Alcalase 0.5% ở nhiệt độ 600C trong 2 giờ, sau đó tiếp tục thuỷ phân bã đã qua lọc bằng Lipase với nồng độ 0.3% nhiệt độ 400C trong 3 giờ. Dịch thuỷ phân được kết tủa bằng HCl 10% đến pH 4,5 để thu bột nhão rồi tiếp tục đông khô ở -60oC. Bột đạm thành phẩm có nồng độ astaxanthin cao, giàu protein, phù hợp sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hay thực phẩm chức năng cho con người. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Alim. Nutr (2011). Total carotenoid content off shrimp commercialized in florianopolis and evaluation of color preference for consumers, Araraquara, Vol.22, pp 17-20. [2] Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem, Vol.72, pp 248–254. [3] Chakrabarti (2002). Carotenoprotein from tropical brown shrimp shell waste by enzymatic process, Food Biotechnol, Vol.16, pp 81-90 [4] Chakrabarti R. (2002). Carotenoprotein from tropical brown shrimp shell waste by enzymatic process, Food Biotechnology 16 (1): 81-90. [5] Klomklao S., Benjakul S., Viessanguan W., Kishimura H., and Simpson B.K., (2009), “Extraction of carotenoprotein from black tiger shrimp shells with the aid of bluefish trysin” J.Food Biochem.33: 201 – 217. [6] Nguyễn Lệ Hà (2013). Thu nhận carotenoprotein từ phế liệu tôm sú bằng chế phẩm protease đầu tôm Penaeus monodon. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Số 50, trang 222-228 [7] Nguyễn Lệ Hà (2018). Carotenoprotein trong động vật thuỷ sản. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Số 2, 109-116. [8] Pham Thi Dan Phuong, Nguyen Cong Minh, Hoang Ngoc Cuong et al., (2017). Recovery of protein hydrolysate and chitisan from black tiger shrimp (Penaeus monodon) heads: approching a zero waste process. J. Food Sci. Technol., 54(7): 1850-1856. [9] Tolasa S., Cakli S., Ostermeyer U., (2005) .Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid, Eur. Food Res. Technol 221: 787-791 [10] Trang Sĩ Trung (2008). Nghiên cứu ứng dụng chitosan trong việc thu hồi protein từ nước rửa surimi, Tạp chí Khoa học và Công nghệ thủy sản 2, 23-28 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 390 RECOVERY OF ASTAXANTHIN-RICH PROTEIN POWDER FROM SHRIMP HEADS PENAEUS MONODON USING PROTEASE AND LIPASE COMBINED *Nguyen Le Ha; Huynh Hoa Nhi; Nguyen Dang Khoi; Ho Thi Kim Thu; Nguyen Ngoc Thao My; Nguyen Ngoc Linh; Nguyen Hung Nam Hochiminh University of Technology HUTECH Email: *nl.ha@hutech.edu.vn ABSTRACT The hydrolysis of black tiger shrimp heads was carried out using protease and then lipase to improve protein and astaxanthin recovery. Optimal hydrolysis parameters with Alcalase were 600C, 2 hours, and Alcalase concentration of 0.5%, the residue obtained from the hydrolysis with Alcalase was then hydrolyzed with Lipase at concentration of 0.3% for 3 hours at 400C. The astaxanthin-rich protein powder obtained from freeze drying was suitable for food applications. Keyword: shrimp head, astaxanthin, protein hydrolysis, protein powder.