Tạo chế phẩm lân sinh học từ các chủng nấm mốc phân lập từ đất rừng ngập mặn và thử nghiệm trên cây chá (Escoecaria agallocha)

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – ĐH Huế Tập 7, Số 1 (2017) 111 TẠO CHẾ PHẨM LÂN SINH HỌC TỪ CÁC CHỦNG NẤM MỐC PHÂN LẬP TỪ ĐẤT RỪNG NGẬP MẶN VÀ THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY CHÁ (ESCOECARIA AGALLOCHA) Hoàng Dƣơng Thu Hƣơng*, Phạm Thị Ngọc Lan Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế *Email:thuhuongcnk32@gmail.com TÓM TẮT Hai chủng nấm mốc (Aspergillus oryzae M33 và A. japonicus M72) có khả năng hòa tan phosphate vô cơ mạnh được sử dụng để tạo chế phẩm lân sinh học trên 5 nguồn cơ chất riêng lẻ và 4 nguồn cơ chất phối trộn. Nguồn cám gạo và 2 công thức phối trộn: cám gạo – lõi ngô và cám gạo – bã mía là thích hợp cho sự tồn tại của nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ trong chế phẩm. Sau thời gian bảo quản 60 ngày, số lượng nấm mốc đạt 2,21 – 2,67 x 10 9 CFU/g chế phẩm. Hai chủng nấm mốc đã được lây nhiễm vào bầu đất trồng cây chá và một số đặc tính của cây đã thay đổi một cách đáng kể. Chiều cao cây tăng 197,53% - 213,20%, số lá cây tăng 160,56% – 202,16%, trọng lượng tươi tăng 52,35% - 67,06% và trọng lượng khô tăng 66,67% – 114,81% trong các thí nghiệm đối với các chủng Aspergillus oryzae M33 và A. japonicus M72 sau 3 tháng thử nghiệm. Từ khóa: Cây ngập mặn, Hòa tan phosphate, Nấm mốc. 1. MỞ ĐẦU Rừng ngập mặn là hệ sinh thái quan trọng có năng suất sinh học cao ở vùng cửa sông ven biển nhiệt đới, có giá trị và ý nghĩa to lớn về đa dạng sinh học và có vai trò rất quan trọng đối với tự nhiên cũng như con người. Tuy nhiên, rừng ngập mặn ở nước ta đang đứng trước nguy cơ bị khai thác và tàn phá nghiêm trọng, diện tích ngày càng thu hẹp và gây ra các hậu quả nặng nề. Vì vậy, việc bảo vệ và phát triển bền vững rừng ngập mặn ở tỉnh Thừa Thiên Huế nói riêng và cả nước nói chung là vấn đề cấp thiết và có ý nghĩa lớn về môi trường đối với vùng đầm phá ven biển. Một trong những biện pháp để bảo tồn góp phần tạo cân bằng sinh thái đó là tách được các chủng vi sinh vật có hiệu lực hòa tan phosphate mạnh để tạo thành chế phẩm lân sinh học và đưa trở lại môi trường đất, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng mà không gây hại đến sức khỏe của con người, động vật, thực vật và không ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái [1,3]. Trong khuôn khổ bài báo này chỉ đề cập đến nhóm nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ trong đất rừng ngập mặn với mục đích tạo chế phẩm lân sinh học để làm cơ sở cho các Tạo chế phẩm lân sinh học từ các chủng nấm mốc phân lập từ đất rừng ngập mặn 112 nghiên cứu ứng dụng nhằm cải thiện hiệu quả công tác ươm trồng phục hồi và phát triển hệ sinh thái rừng ngập mặn. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae M33 và Aspergillus japonicus M72 có khả năng hòa tan phosphate vô cơ mạnh được phân lập từ đất rừng ngập mặn ở Thừa Thiên Huế. Chủng giống đang được lưu giữ tại bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế. - Cây chá (Escoecaria agallocha) được trồng trong các bầu đất tại vườn ươm Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phương pháp nhân giống và bảo quản giống nấm mốc: sử dụng môi trường Czapek nhưng thay nguồn K2HPO4 bằng nguồn Ca3(PO4)2 để nhân giống và giữ giống [2]. - Thử nghiệm tạo chế phẩm lân sinh học với nguồn cơ chất riêng lẻ: bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường Czapek dịch thể ở các điều kiện tối ưu. Trộn dịch nuôi cấy chứa sinh khối nấm mốc với các nguồn cơ chất là cám gạo, vỏ lạc, bã mía, lõi ngô, trấu theo tỷ lệ 8 ml dịch nuôi cấy (tương ứng mật độ tế bào 5 x 107 CFU/ml) : 10 g cơ chất. Tiến hành bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. - Thử nghiệm tạo chế phẩm lân sinh học với nguồn cơ chất phối trộn: nuôi cấy nấm mốc trong môi trường cám gạo phối trộn với các nguồn carbon khác như vỏ lạc, lõi ngô, bã mía, trấu (tỷ lệ 1: 1). Bố trí thí nghiệm tương tự như với nguồn cơ chất riêng lẻ. - Xác định thời gian bảo quản: Tạo chế phẩm lân sinh học trên môi trường cơ chất thích hợp, sau đó tiến hành xác định sự thay đổi số lượng tế nấm mốc sau khoảng thời gian bảo quản 15, 30, 45, 60 ngày bằng phương pháp phân lập và đếm số lượng tế khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa. - Thăm dò ảnh hưởng của nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ đến một số chỉ tiêu sinh lý của cây chá: thí nghiệm được tiến hành tại vườn ươm trường Đại học Khoa học. Cây chá được trồng trong các bầu đất, kích thước 10 x 20 cm, đục các lỗ nhỏ xung quanh để thoát nước. Cây chá thí nghiệm đạt 30 ngày tuổi và lượng nấm mốc được bón là 50 ml dịch nuôi cấy/bầu đất. Đồng thời với các công thức thí nghiệm có bón sinh khối nấm mốc, công thức không bón sinh khối nấm mốc cũng thiết lập để làm đối chứng, các công thức thí nghiệm được bố trí sát nhau theo hàng ngang, mỗi công thức có 20 cây. Sau 3 tháng bón sinh khối nấm mốc, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của sinh khối nấm mốc qua một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây chá. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – ĐH Huế Tập 7, Số 1 (2017) 113 - Chiều cao cây (cm) được xác định bằng phương pháp đo từ gốc đến ngọn, số lá/cây được xác định bằng phương pháp đếm, xác định sinh khối tươi, khô (g) của cây bằng phương pháp cân. 2.3. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và phân tích ANOVA (Duncan’s test p<0,05) bằng chương trình SPSS 16.0. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo chế phẩm lân sinh học với nguồn cơ chất riêng lẻ Qua kết quả thu được chúng tôi nhận thấy, nguồn cơ chất cám gạo cho hiệu quả tốt nhất đối với cả 2 chủng nấm mốc, chủng A. oryzae M33 có số lượng đạt 5,75 x 109 CFU/g mẫu, chủng A. japonicus M72 đạt 6,35 x 109 CFU/g mẫu. Sở dĩ nguồn cám gạo thích hợp cho tạo bào tử vì trong cám gạo có nhiều chất dinh dưỡng, đặc biệt là vitamin nhóm B cần thiết cho sinh trưởng phát triển của vi sinh vật. Bảng 1. Số lượng nấm mốc A. oryzae M33 và A. japonicus M72 trong chế phẩm với nguồn cơ chất riêng lẻ Chủng nấm mốc Nguồn cơ chất Số lượng (x109 CFU/g mẫu) A. oryzae M33 Cám gạo 5,75a Bã mía 3,88 c Lõi ngô 4,70 b Vỏ lạc 2,85e A. japonicus M72 Cám gạo 6,35a Bã mía 4,40 b Lõi ngô 3,32 c Vỏ lạc 1,58d Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Duncan’s test) Trong môi trường lõi ngô, chủng A. oryzae M33 tạo bào tử tương đối mạnh (4,70 x 109 CFU/g mẫu) nhưng thấp hơn cám gạo, tiếp đến là bã mía (3,88 x 109 CFU/g mẫu ) và thấp nhất là vỏ lạc (2,85 x 109 CFU/g mẫu). Còn đối với chủng A. japonicus M72, tạo bào tử mạnh nhất trong môi trường cám gạo, tiếp đến là bã mía (4,40 x 109 CFU/g mẫu), lõi ngô (3,32 x 109 CFU/g mẫu) và thấp nhất là vỏ lạc (1,58 x 109 CFU/g mẫu). 3.2. Tạo chế phẩm lân sinh học với nguồn cơ chất phối trộn Qua kết quả chúng tôi nhận thấy, cả hai chủng nấm mốc đều tạo bào tử tốt trên môi trường có nguồn cơ chất phối trộn. Trong đó, chủng A. oryzae M33 tạo bào tử tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường cám gạo: lõi ngô (5,25 x 109 CFU/g mẫu), tiếp đến là cám gạo: vỏ lạc (4,55 Tạo chế phẩm lân sinh học từ các chủng nấm mốc phân lập từ đất rừng ngập mặn 114 x 10 9 CFU/g mẫu), cám gạo: bã mía (4,22 x 109 CFU/g mẫu) và thấp nhất trong môi trường cám gạo: trấu (1,33 x 109 CFU/g mẫu). Chủng A. japonicus M72 nguồn phối trộn thích hợp nhất là cám gạo: bã mía (4,73 x 109 CFU/g mẫu), tiếp đến là cám gạo: lõi ngô (4,13 x 109 CFU/g mẫu), cám gạo: vỏ lạc (2,68 x 109 CFU/g mẫu) và thấp nhất là trong môi trường cám gạo: trấu (2,13 x 10 9 CFU/g mẫu). Bảng 2. Số lượng nấm mốc A. oryzae M33 và A. japonicus M72 trong chế phẩm với nguồn cơ chất phối trộn Chủng nấm mốc Nguồn cơ chất phối trộn Số lượng (x109 CFU/g mẫu) A. oryzae M33 Cám gạo : bã mía 4,22c Cám gạo : lõi ngô 5,25a Cám gạo : trấu 1,33d Cám gạo : vỏ lạc 4,55b A. japonicus M72 Cám gạo : bã mía 4,73a Cám gạo : lõi ngô 4,13b Cám gạo : trấu 2,13d Cám gạo : vỏ lạc 2,68c Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Duncan’s test) Như vậy, trên môi trường rắn, đặc biệt là đối với các nguồn phế phẩm như cám gạo, vỏ lạc, lõi ngô, bã mía, thì khuẩn ty phát triển mạnh trên bề mặt và cả bề sâu của môi trường. Khi phối trộn các nguồn cơ chất thì nấm mốc sinh trưởng phát triển và tạo bào tử tốt hơn khi nuôi cấy riêng lẻ. 3.3. Xác định thời gian bảo quản Bảng 3. Số lượng nấm mốc A. oryzae M33 và A. japonicus M72 trong chế phẩm sau thời gian bảo quản Chế phẩm Số lượng (x109 CFU/g chế phẩm) 15 ngày 30 ngày 45 ngày 60 ngày A. oryzae M33 5,12 a 4,38 b 3,63 c 2,21 d A. japonicus M72 5,75 a 4,83 b 4,10 c 2,67 d Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Duncan’s test) Như vậy, số lượng nấm mốc hòa tan phosphate trong chế phẩm giảm dần theo thời gian bảo quản, sau 60 ngày số lượng giảm mạnh chỉ còn 2,21 x 109 - 2,67 x 109 CFU/g chế phẩm (vẫn đảm bảo TCVN - 2004 đối với phân bón vi sinh vật hòa tan phosphate trên nền chất mang không thanh trùng). Tuy vậy, để phát huy tốt hiệu quả của các chủng nấm mốc khi sinh trưởng và phát triển trong đất, nên sử dụng chế phẩm này trước thời gian bảo quản 60 ngày, vì sau thời gian này sức sống của nấm mốc trong chế phẩm đã giảm mạnh. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – ĐH Huế Tập 7, Số 1 (2017) 115 3.3. Ảnh hƣởng của nấm mốc hòa tan phosphate đến một số chỉ tiêu sinh lý của cây chá Bảng 4. Ảnh hưởng của sinh khối nấm mốc đến chiều cao và số lá của cây chá Công thức TN Chiều cao cây (cm) Số lá/cây Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm Độ tăng (%) Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm Độ tăng (%) A. oryzae M335 c5v 6,47 a 19,25 b 297,53 4,26 a 11,10 b 260,56 A. japonicus M72 6,44 a 20,17 a 313,20 4,17 a 12,60 a 302,16 ĐC 6,55a 12,02b 183,51 4,30a 8,10c 188,37 Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Duncan’s test) Bảng 5. Ảnh hưởng của nấm mốc hòa tan phosphate đến khả năng tích lũy sinh khối của cây chá (sau 3 tháng bón sinh khối nấm mốc) Công thức TN Sinh khối (g) Sinh khối tươi % so ĐC Sinh khối khô % so ĐC A. oryzae M33 2,59 a 152,35 0,45 ab 166,67 A. japonicus M72 2,84 a 167,06 0,58 a 214,81 ĐC 1,70b 100,00 0,27b 100,00 Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Duncan’s test) Qua kết quả thí nghiệm cho thấy, xử lý cây chá bằng sinh khối nấm mốc hòa tan phosphate có ảnh hưởng khá rõ đến sinh trưởng phát triển của cây. Với 2 công thức thí nghiệm, chiều cao cây, số lá cũng như sinh khối tươi và khô của cây đều tăng so với cây đối chứng. Nguyên nhân của sự tăng chiều cao cây và số lá ở các công thức thí nghiệm có thể là do khi bón sinh khối nấm mốc vào đất, hoạt động trao đổi chất của chúng sẽ tiết ra các acid hữu cơ và H2CO3 hòa tan muối phosphate khó tan thành dạng dễ tan giúp cho cây hấp thụ dễ dàng hơn là cơ sở để cây tăng trưởng. Đồng thời sự hấp thu P còn hỗ trợ cho cây hấp thu và chuyển hóa đạm tốt hơn, là tác nhân ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây [4]. Đối với chủng A. oryzae M33, chiều cao trung bình của cây ở công thức thí nghiệm sau 3 tháng tăng 197,53%, số lá tăng 160,56%. Còn đối với chỉ tiêu sinh khối tươi tăng 52,35% và sinh khối khô tăng 66,67% so với cây đối chứng. Đối với chủng A. japonicus M72, chiều cao trung bình của cây ở công thức thí nghiệm sau 3 tháng tăng 213,20%, số lá tăng 202,16%. Còn đối với chỉ tiêu sinh khối tươi tăng 67,06% và sinh khối khô tăng 114,81% so với cây đối chứng. Nhìn chung xét về các chỉ tiêu chiều cao, số lá và khả năng tích lũy nước và chất khô của cây thì chủng A. japonicus M72 phát huy hiệu quả tốt hơn chủng A. oryzae M33. Tạo chế phẩm lân sinh học từ các chủng nấm mốc phân lập từ đất rừng ngập mặn 116 Hình 1. Cây chá trước khi bón sinh khối nấm mốc Hình 2. Cây chá sau 3 tháng bón sinh khối nấm mốc 4. KẾT LUẬN - Nguồn cám gạo và 2 công thức phối trộn: cám gạo – lõi ngô và cám gạo – bã mía thích hợp cho sự tồn tại của nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ trong chế phẩm. Sau thời gian bảo quản 60 ngày, số lượng tế bào đạt 2,21 x 109 – 2,67 x 109 CFU/g chế phẩm, đảm bảo TCVN-2004 về phân lân sinh học trên nền chất mang không thanh trùng. - Lây nhiễm sinh khối 2 chủng A. oryzae M33 và A. japonicus M72 vào đất trồng cây chá sau 3 tháng: Chiều cao cây tăng 197,53% - 213,20%, số lá cây tăng 160,56% – 202,16%, trong khi đó công thức đối chứng chỉ tăng 83,51% về chiều cao và 88,37% về số lá; sinh khối tươi tăng 52,35% - 67,06%; sinh khối khô tăng 66,67% – 114,81% so với cây đối chứng. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – ĐH Huế Tập 7, Số 1 (2017) 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. K. K. Kapoor (1996). “Phosphate mobilization through soil microorganisms”. Plant Microbe Interaction in Sustainable Agriculture, CCSHAU, Hisar and MMB, New Delhi, pp. 46-61. [2]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội. [3]. S. Gaind and A. C. Gaur (1991). “Thermotolerant phosphate solubilizing microorganisms and after interaction with mung bean”. Plant and Soil, Vol. 133, 1, pp. 141-149. [4]. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1999), Sinh lí học thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội. PRODUCING BIO-PRODUCT OF PHOSPHATE SOLUBILIZING FUNGI AND TEST ON THE MANGROVE PLANTS (ESCOECARIA AGALLOCHA) Hoang Duong Thu Huong * , Pham Thi Ngoc Lan Department of Biology, Hue University College of Sciences *Email:thuhuongcnk32@gmail.com ABSTRACT From two fungi strains (Aspergillus oryzae M33 and A. japonicus M72) with high phosphate solubilizing activity, we made bio-products in five separately substances and four mixed substances. Rice bran, mixtures of rice bran - cob and rice bran - bagasse are suitable for the maintenace of phosphate solubilizing fungi in the bio-products. After 60 days of preserving, the quantity of phosphate solubilizing microorganisms is 2,21 × 10 9 – 2,67 × 10 9 CFU/g sample. Two fungi strains were inoculated in the mangrove plants cultivar potting and some characteristics of the mangrove plants have been changed considerably. After 3 months of testing, the height of the mangrove plants increased by 197.53% - 213.20%, number of leaves increased by 160.56% – 202.16%, fresh and dry weight increased by 52.35% - 67.06% and 6667% – 11481% respectively in the experiments with the inoculation of the strain Aspergillus oryzae M33 and A. japonicus M72. Keywords: Fungi, Mangrove plants, Phosphate solubilizing.