Sự glycosyl hóa protein ở Eukaryote

Sự glycosyl hóa protein ở Eukaryote Các glycoprotein chiếm thị phần chính trên thị trường các protein dược phẩm. Hầu hết các protein này đều được sản xuất bởi công nghệ protein tái tổ hợp nhờ vào việc sử dụng các hệ thống biểu hiện như vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật. Hệ thống biểu hiện của nấm men và tế bào động vật có nhiều ưu điểm trong sản xuất các protein tái tổ hợp. Ở sinh vật nhân chuẩn, các protein thường được biến đổi sau quá trình dịch mã, điều này có liên quan mật thiết đến hoạt tính của các protein. Sự glycosyl hóa là sự biến đổi thông dụng nhất trong các hệ thống này và nó cần thiết cho các chức năng của protein như sự nhận diện, sự truyền tín hiệu, sự tương tác giữa các protein và tế bào. Vì vậy, bộ máy glycosyl hóa của các hệ thống này là một vấn đề rất quan trọng mà chúng ta cần phải hiểu khi biểu hiện một protein nào đó. 1. Các dạng glycosyl hóa protein 1.1. Glycosyl hóa protein ở vị trí N Sự glycosyl hóa protein ở vị trí N là quá trình biến đổi sau dịch mã được bảo tồn ở nấm men và các eukaryote khác. Glycosyl hoá ở vị trí N bắt đầu từ mạng lưới nội chất (ER) với sự chuyển chuỗi oligosaccharide vào vị trí asparagine của một protein [19,20]. Vị trí gắn bao gồm trình tự ba axit amin là Asn-Xaa-Ser/Thr nơi mà vị trí thứ hai không phải là Pro. Chuỗi oligosaccharide này chứa 3 phân tử đường glucose ở đuôi không khử của cấu trúc lõi Man9GlcNAc2 gắn vào protein và nó bị cắt bởi các enzyme glucosidase của lưới nội chất và enzyme α-1,2 mannosidase và đi vào bộ máy Golgi . Cơ chế glycosyl hóa ở vị trí N: - Glc3Man9GlcNAc2 được tập hợp ở mạng lưới nội chất nhám và được biến đổi thành Man8GlcNAc2. - Sự cắt bỏ bớt các phân tử đường diễn ra trong Golgi bởi các enzyme mannosidase tạo thành Man5GlcNAc2 để tổng hợp các oligosaccharide phức tạp hoặc hình thành các oligomannoside. - Sự chuyển thành dạng đa anten phức tạp xảy ra ở thuỳ giữa của Golgi và trans-Golgi, có hoặc không có đuôi sialic acid, và từ đó protein được tiết ra môi trường ngoại bào. 1.2. Glycosyl hóa ở vị trí O Sự glycosyl hóa ở vị trí O là việc tạo liên kết cộng hóa trị giữa một monosaccharide với axit amin Ser hay Thr. Tính đặc hiệu của trình tự cho thấy Glycosyl hoá ở vị trí O không quyết định sự gấp cuộn và tính tan của protein. Dạng phổ biến của hiện tượng glycosyl hoá ở vị trí O ở người thường xảy ra ở Golgi , liên quan tới sự chuyển GalNAc từ UDP-GalNAc sang axit amin Ser hoặc Thr thông qua hoạt động của enzyme GalNAc transferase kéo theo sự chuyển của hàng hoạt các phân tử đường khác nhau như galactose, GalNAc, and N-GlcNAc, fucose, glucose, mannose, hydroxyproline… 2. Sự glycosyl hóa protein ở tế bào động vật có vú Các tế bào động vật có vú (như tế bào CHO, tế bào myeloma, tế bào HEK) đang được ưa chuộng bởi vì bộ máy glycosyl hoá của chúng rất giống ở người, mặc dù các phân tử đường được gắn vào protein không hoàn toàn giống ở người, chúng vẫn được bán trên thị trường. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí N đều có cấu trúc nhánh chuẩn bao gồm mannose, galctose, N- acetylglucosamine (GlcNAc) và axit neuramic. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí O thì bao gồm một số lượng phân tử đường khác nhau bao gồm galactose, N- acetylglucosamine, N- acetylgalactosamine, axit sialic và axit neuramic. Kiểu mẫu glycosyl hóa các protein dược phẩm được sản xuất bởi hệ thống tế bào động vật có vú là khác nhau và thay đổi theo từng mẻ. Vì vậy, sự đa dạng này phải được kiểm tra lâm sàng và tiền lâm sàng. Trong thực tế, các kiểu mẫu glycosyl hóa này có thể được thay đổi bằng cách tối ưu hóa quy trình lên men, sử dụng các enzyme biến đổi, hoặc tạo ra những hệ thống biểu hiện được làm giàu hoặc loại bỏ những dạng gắn phân tử đường đặc biệt nào đó. 3. Sự glycosyl hóa protein ở hệ thống nấm men Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các glycoprotein dược phẩm bởi dễ thao tác, dễ sản xuất với quy mô lớn, chi phí sản xuất thấp và chu kỳ sản xuất ngắn. Một ưu điểm khác là chúng có khả năng tạo ra các kiểu mẫu glycosyl hóa giống nhau và đã được hiểu rõ vai trò của phần carbonhydrate. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí N trong S. cerevisiae có đặc điểm phân nhánh rất nhiều và mang rất nhiều đường mannose. Trong khi các protein được glycosyl hóa ở vị trí O chỉ bao gồm nhiều nhất là 5 phân tử mannose. Sự glycosyl hóa ở vị trí N trong Pichia hầu hết bao gồm chuỗi ManGlcNAc, giống với kiểu glycosyl hóa protein điển hình trong tế bào động vật có vú. In Pichia, the outer oligosaccharide chain of secreted proteins is mostly unaltered and consists of Man8–9GlcNAc2. Mặc dù có nhiều sự khác nhau về số lượng và độ phức tạp của sự kiểu glycosyl hóa liên kết với N được thấy, nhưng chúng vẫn có chứa trình tự bảo tồn nhận biết cho sự khởi đầu sự glycosyl hóa, Asn-Xaa- Ser/Thr. Ở Pichia có sự gắn chuỗi oligosaccharide tại vị trí O nhưng nó không phải là thành phần quan trọng của các glycoprotein tan. Sự gắn chuỗi oligosaccharide chỉ bao gồm các phân tử mannose. Tuy nhiên, số lượng mannose trên một chuỗi, các liên kết tạo ra, tần số và tính đặc hiệu của sự glycosyl hóa ở vị trí O trong Pichia pastoris vẫn chưa xác định được. Chúng ta không nên thừa nhận rằng một protein không bị glycosyl hóa ở vị trí O trong tế bào chủ tự nhiên thì sẽ không bị glycosyl hóa trong Pichia. 4. Các enzyme dùng cho nghiên cứu về glycoprotein Các enzyme thường được sử dụng trong những nghiên cứu về cấu trúc đường của các glycoprotein: Enzyme Loại enzyme Sự đặc hiệu Endoglycosidase D Endo Cắt các phân tử glycan chứa nhiều mannose Endoglycosidase F Endo Cắt các phân tử glycan chứa nhiều mannose Endoglycosidase H Endo Cắt các phân tử glycan chứa nhiều mannose β-galactosidase Exo Loại bỏ các enzyme galactosidase khỏi Gal-β1, 5, 8, 9 3-GlcNAc; Gal-β1,4- GlcNAc; Galβ1,3 GalNAc N-glycosidase F Endo Các glycoprotein giữa Asn và GlcNAc Stalidases (Neuraminidases) Exo NeuAc-α2,6- Gal; NeuAc- α2,6-GlcNAc; 2 or NeuAc- α2,3-Ga 5. Kết luận Glycosyl hóa là một quá trình phức tạp và đa dạng trong các sinh vật nhân chuẩn. Vì vậy, nó không thể khái quát hóa theo những kiểu mẫu glycosyl hóa chuẩn. Trước khi biểu hiện một protein tái tổ hợp, chúng ta nên hiểu rõ hệ thống biểu hiện và phải nắm được mục đích sử dụng của sản phẩm. Các nhà khoa học đang cố gắng tạo ra các chủng vi sinh vật mới có khả năng tổng hợp các glycoprotein với cấu trúc giống với khi chúng được tổng hợp ở người. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Roland Contreras ở trường đại học Ghent, Bỉ và Tillman Gerngross ở trường Glycofi, Boston, Mỹ đã báo cáo về việc tạo ra được chủng Pichia pastoris có khả năng sản xuất protein với kiểu gắn mannose giống với ở con người. Nhóm nghiên cứu này hy vọng sẽ có thể tạo ra được chủng Pichia pastoris có khả năng tổng hợp được các protein hoàn toàn giống như chúng được tổng hợp ở con người Phước Toàn Tài liệu tham khảo 1. Sue Macauley-Patrick, Mariana L. Fazenda, Brian McNeil and Linda M. Harvey. 2005.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast, 22: 249–270. 2. James Cregg, Ph.D., Keck Graduate Institute, Claremont, Calif. The Pichia System 3. Benjamin Lewin. 2000. Genes VII. Oxford Univerisity Press Inc., NewYork. Chapter 26.Gen VII 4. Huijuan Li and Marc d’Anjou. 2009. Pharmacological significance of glycosylation in therapeutic proteins. Current Opinion in Biotechnology, 20:678– 684