Sinh học - Tổng số vi sinh vật hiếu khí

*TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍTPC (Total Plate Count)/ APC (Aerobic Plate Count)Định nghĩaVSV hiếu khí là vi sinh vật phát triển và tạo được khuẩn lạc có thể nhìn thấy trong điều kiện có O2Tổng số vi sinh vật hiếu khí là số khuẩn lạc hình thành được nhìn thấy trong một khối lượng mẫu Số đơn vị hành thành khuẩn lạc (cfu – colony forming unit) là số khuẩn lạc được nhìn thấy trong môi trường nuôi cấy*Ý NGHĨATPC phản ánh mức độ nhiễm vi sinh vật trong mẫuTPC không phản ảnh tổng số vi sinh vật trong mẫuTPC không phản ánh mức độ an toàn vệ sinh của thực phẩm/ nước uống, sinh hoạtSố TPC thấp hơn rất nhiều so với mật độ vi sinh vật trong mẫu*NGUYÊN TẮCĐịnh lượng TPC bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo nguyên tắc sau:Mẫu được đồng nhất, pha loãng theo từng bậc 10TPC được định lượng theo phương pháp đổ đĩa: - 1ml mẫu (dd mẫu đã pha loãng) cấy vào đĩa petri trống vô trùng - Môi trường agar không chọn lọc được đun chảy và làm nguội đến 45±1oC được đổ vào trong đĩa, lắc đều - Ủ đĩa ở 25-30oC trong 72 ±6giờ - Đếm tất cả các khuẩn lạc nhìn thấy được trong đĩa*MÔI TRƯỜNGDung dịch pha loãng- Pepton 1g- NaCl 8.5gMôi trường không chọn lọc- Plate count agar- Nutrient agar- Standard count agar*QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ10g mẫu + 90g Salin Pepton Water, đồng nhất bằng stomacher trong 30 giây  dd 10-1Pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 Cấy 1ml dd mẫu đã pha loãng vào đĩa petri trống vô trùng. Cấy 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩaĐỗ vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 15-20ml môi trường PCA đã đun chảy và làm nguội đến 45oC. Lắc cho mẫu khuếch tán vào môi trường *QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (tt)Để đĩa trên mặt phẳng ngang cho môi trường đông đặc Lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 301oC trong 72 6 giờĐếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa. Chọn các đĩa có khoảng 25 –250 khuẩn lạc / đĩa để tính kết quảTổng số vi sinh vật hiếu khí / g (TPC) NTPC = n1V1F1 + + niViFi N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa n: số đĩa tại mỗi nồng độ V: thể tích cấy vào đĩa (=1) F: độ pha loãng *TÍNH KẾT QUẢChọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250KL hay 30-300 KL để tính kết quảSố CFU/g(nl) = Nếu ở độ pha loãng thấp nhất hay cao nhất mà có số đếm ngoài giới hạn trên thì kết quả sẽ được đánh dấuNn1V1f1++niVifi*KẾT QUẢ (tt)10-210-3TPC/g1823.0x105 hay4.2x105(*)*ĐỊNH LƯỢNG BÀO TỬ VI SINH VẬT KỴ KHÍ SINH H2S (CLOSTRIDIA)Định nghĩaThuộc giống Clostridium, phát triển trong điều kiện kỵ khíHình que, gram dương, di động (trừ C. perfingens) Tạo bào tử bền nhiệtTạo được H2S từ nguồn SulphiteTạo được enzym protease ngoại bào * Vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, chỉ thị ô nhiễm ngầm, lâu ngàyVi sinh vật gây hư hỏng thực phẩmTrong giống có nhiều loài tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm như: C. botulinum, C. perfrigensÝ NGHĨA*ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIANguyên tắcMẫu được xử lý nhiệt để loại bỏ tế bào sinh dưỡng, chọn lọc bào tửNuôi cấy kỵ khí trong môi trường có Na2S2O3 là cơ chất tạo H2S.Phát hiện H2S bằng Ferric ammonium citrateNuôi cấy trong ống nghiệm hay trong đĩa với điều kiện kỵ khíĐếm tất cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện trong ống/ đĩa*MÔI TRƯỜNGIron sulphite agar- Tryptose 15g- Soyton 5g- Cao nấm men 5g- Na2S2O5 1g- Ferric ammonium citrate 1g- Agar 20g- Nước cất 1lít*ĐỊNH LƯỢNG TỔNG BÀO TỬ VI SINH VẬT KỴ KHÍ SINH H2SCấy 1ml mẫu đã pha loãng 10-1 vào ống nghiệm 18 x 180 mmXử lý nhiệt ở 75-80oC trong 15-20 phút trong bể điều nhiệtĐổ khoảng 15ml môi trường ISA đã đun tan và làm nguội ở 45oCĐể yên cho môi trường đông đặc trong ống Đổ 3-5ml môi trường ISA lên trên mặt ống nghiệm *ĐỊNH LƯỢNG TỔNG BÀO TỬ VI SINH VẬT KỴ KHÍ SINH H2S (tt)Ủ 37  1oC trong 24 giờĐếm tất cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện trong ốngTổng bào tử vi sinh vật kỵ khí sinh H2S/ (cfu)g (A) NA = nVf N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các ống n: số ống tại mỗi nồng độ (=2) V: thể tích cấy vào ống (=1) F: độ pha loãng (10-1)*ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM,  F. COLIFORMĐịng nghĩaColiform là vi khuẩn hình que, gram âm, thuộc họ Enterobacteriaccae, có khả năng lên men lactose và sinh hơi ở 37oC*FEACAL COLIFORMĐịnh nghiã - Coliform chịu nhiệt: là coliforms có khả năng lên men lactose và sinh hơi ở 44oC. Nhóm này còn được goi là Feacal Coliform giả định (presumtive F. coliform) - Feacal Coliform (xác nhận): là Coliform chịu nhiệt có phản ứng indol dương tính. Còn được gọi là E. coli giả định (presumtive E. coli) - E. coli xác định: là feacal coliform có nghiệm pháp IMViC theo trật tự + + - -*SỰ TƯƠNG QUAN COLIFORM – E. COLIColiformColiform chòu nhieätFeacal ColiformE. coli*Ý NGHĨA CHỈ TIÊU COLIFORMLà vi sinh chỉ thị an toàn vệ sinh thực phẩm vì: - Có quan hệ họ hàng gần với các VSV gây bệnh đường ruột - Luôn đồng hành với các vi sinh vật gây bệnh đường ruột và VSV gây ngộ độc thực phẩm - Số lượng cao VSV này trong thực phẩm thì khả năng có mặt của vi sinh vật gây bệnh khác cũng caoSố lượng Coliform giảm dần theo thời gian trong các sản phẩm đông lạnh*NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠCPhương pháp: đổ đĩa (pour plate)Môi trường chọn lọc cho Coliform: chứa laclose, muối mật, chất nhận dạng sự tạo thành axít Trong trường hợp vi khuẩn bị yếu hay tổn thương, phải phục hồi bằng môi trường không chọn lọc, không chứa nguồn carbonhydrate khác (vd TSA)Khẳng định khuẩn lạc đã đếm bằng môi trường lỏng chọn lọc cho Coliform*CÁC TRƯỜNG HỢP CẦN PHẢI KHẲNG ĐỊNHMẫu có hệ VSV gây nhiễu trong môi trường dành cho Coliform: ví dụ: nước biển, cá và các sản phẩm của cá, rau quả Các vi sinh vật gây nhiễu: Aeromomas, Flavobacterium, ErwiniaMẫu có chứa nguồn carbohydrate khác lactose: bánh ngọt, nước ngọt, thực phẩm chứa tinh bột *FEACAL COLIFORMHiện diện thường xuyên trong ruột người và động vậtSự hiện diện của F. coliform được đánh giá là ô nhiễm phân tươi Gồm các giống: Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter*Violet red bile agar (VRB) Cao nấm men 3g NaCl 5g Muối mật số 3 1.5g Lactose 10g Neutral red 0.03g Crystal violet 0.002g Agar 15g nước cất 1000g pH 7.4 ±0.2MÔI TRƯỜNG*MÔI TRƯỜNG (tt)Trypton soya agar (TSA)Trypton 15gSoya pepton 5gNaCl 5gAgar 15gNước 1 lítpH 7.3 ± 0.2Brilliant green bile lactose broth Pepton 10g Lactose 10 Ox bile 20g Brilliant green 0.0133g Nước cất 1 lít pH 7.2 ± 0.2*ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS (PP ĐẾM KHUẨN LẠC)Cấy 1ml mẫu đã pha loãng 10-1 vào đĩa petriĐổ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đềuỦ ở nhiệt độ phòng khoảng 1-2 giờĐổ vào 10-15ml VRB đã đun tan và làm nguội đến 45oC  chờ đông đặcLật ngược và ủ ở 37.0  0.5oC trong 24 - 48 giờ Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ, đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, 0.5mm*ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS (PP ĐẾM KHUẨN LẠC) (tt)Chọn 5 khuẩn lạc đã đếm cấy sang môi trường BGBLỦ 37.0  0.5oC trong 24 -48 giờTỉ lệ xác nhận R Số KL sinh hơi trong BGBLR = Số KL đã cấyTổng số Coliforms (cfu/ g) (C) NC = x R nVf *Qui trình định lượng F. Coliform tương tự qui trình định Coliform, chỉ khác nhau mấy điểm sauỦ đĩa môi trường VRB ở 44.0  0.5oC trong 24 -48 giờCấy khẳng định vào EC và ủ 44.0  0.5oC trong 24 -48 giờCác khuẩn lạc sinh hơi trên EC được cấy qua môi trường canh Trypton để thử nghiệm indolKhuẩn lạc dương tính khi sinh hơi trên EC và có phản ứng indol dương tínhĐỊNH LƯỢNG FEACAL COLIFORMS (PP ĐẾM KHUẨN LẠC)*ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS (PP MPN)Cấy 10ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đôi: 5 ốngCấy 1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ốngCấy0.1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ốngỦ ở 37.0  0.5oC trong 24-48 giờChọn các ống sinh hơi cấy sang BGBLỦ ở 37.0  0.5oC trong 24-48 giờĐếm số lượng ống sinh hơi trong từng dãyTra bảng MPN tương ứng với 5 ống 10ml, 5 ống 1ml, 5 ống 0.1ml. Kết quả: MPN/100ml*ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORMS (PP MPN)Cấy 10ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đôi: 5 ốngCấy 1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ốngCấy0.1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ốngỦ ở 37.0  0.5oC trong 24-48 giờChọn các ống sinh hơi cấy sang ECỦ ở 44.0  0.5oC trong 24-48 giờChọn các ống sinh hơi trên EC để cấy sang Endo agarỦ ở 37.0  0.5oC trong 24giờ*ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORMS (PP MPN) (tt)Chọn các khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, cấy sang môi trường canh tryptonỦ 37.0  0.5oC trong 24 giờ Đếm số lượng ống có vi khuẩn cho phản ứng indol (+) tương ứng trên mỗi dãy môi trường LSB Tra bảng MPN tương ứng với 5 ống 10ml, 5 ống 1ml, 5 ống 0.1ml. Kết quả: F. coliform (MPN/100ml)*ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN, MỐCĐịnh nghĩaNấm mốc: là vi sinh vật có nhân, dạng rợi, sinh sản bằng bào tử hay khuẩn tyNấm men là vi sinh vật có nhân, đơn bào, sinh sản bằng bào tử đơn nhân hay nẩy chồiNấm men và mốc là những vi sinh vật hiếu khí bắt buộc*ĐẶC ĐIỂM- Nấm men hay mốc đều kháng kháng sinhKhuẩn lạc nấm mốc có dạng sợi, có màu của bào tử Bào tử, khuẩn ty hay tế bào đơn đều có thể hình thành khuẩn lạc mớiKhuẩn lạc nấm men thường to, tròn khô, có màu trắng đục, tế bào có hình cầu hay hình trứng. Có thể tạo bào tử đơn nhân Chỉ tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí*Nhiệt độ thích hợp: 20 - 28oCHoạt tính nước thích hợp: khoảng 85%. Một số loài có thể phát triển trong mẫu có hoạt tính nước 60 - 70%Có thể phát triển ở dãi pH 2 – 9, pH thích hợp là 4 - 6.5ĐẶC ĐIỂM (tt)*VAI TRÒ TRONG THỰC PHẨMNấm mốc có lợiNấm mốc có hại Gây hư hỏng thực phẩm: thay đổi mùi vị, màu sắc, kết cấu Tạo độc tố: aflatoxin *MÔI TRƯỜNG Dung dịch pha loãng - Pepton 1g - Nước 1 lítDG18 (Dichloran glycerol agar): sử dụng cho mẫu có hoạt tính nước thấp: ngũ cốc, gia vị bánh mứt có đường hay mối caoDRBC (Dichloran rose bengal chloramphenycol agar): sử dụng cho mẫu có hoạt tính nước cao: sữa, trái cây, rau quả tươi Dung dịch khử trùng: Disodium hipocholride 0.4% (dùng để khử trùng trong phân lập nấm mốc)*Dichloran glycerol agar (DG18):Peton 5gDextrose 10gKH2PO4 1gMgSO4.7H2O 0.5g2,6-dichloro-4-nitroaniline (Dichloran) 0.002gZnSO4. 7H2O 0.01gCuSO4. 5H2O 0.005gGlycerol 220gChloramphenicol 0.05gChlotetracyline 0.05gAgar 15g*Dichloran rose bengal chloramphenicol (DRBC)Peton 5gDextrose 10gKH2PO4 1gMgSO4.7H2O 0.5g2,6-dichloro-4-nitroaniline (Dichloran) 0.002gRose bengal 0.025gZnSO4. 7H2O 0.01gCuSO4. 5H2O 0.005gChloramphenicol 0.05gChlotetracyline 0.05gAgar 15g*ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN, MỐC 10g mẫu + 90g dd pha loãng (1g pepton trong 1lít nước), đồng nhất trong 30 giây. Nếu là mẫu khô, ngâm khoảng 30 phút trước khi đống nhấtPha loãng đến nồng độ phù hợp (10-1, 10-2, 10-3) Cấy 0.1-0.3ml lên bề mặt môi trường DRBC/DG18, trang đều bằng que tam giác Ủ ngửa đĩa trong bao PE hở miệng ở 25.0  0.5oC trong 3-4 ngày Đếm tất cả khuẩn lạc nấm men, nấm mốc xuất hiện trên đĩa. Tính kết quả men, mốc*E. COLIĐịnh nghĩa: Là F. coliform có nghiệm pháp IMViC + + - -Sống hiếu khí tuỳ nghi trong đường tiêu hoá của người và động vậtTồn tại vô hại trong đường tiêu hoá, có tác dụng ổn định sinh lý đường ruộtĐóng vai trò là vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh thực phẩm và môi trườngMột số ít dòng của E. coli có khả năng gây bệnh cho người và động vật  enterovirulent E.coli (EEC)*CÁC DÒNG E. COLI GÂY BỆNHHầu hết các dòng gây bệnh đều mang plasmid có chứa các gen gây bệnhCác dòng gây bệnh thường gặp - Enterotoxigenic E. coli (ETEC) sình hơi, đau bụng - Enteropathogenic E. coli (EPEC)tiêu chảy ở trẻ em - Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)/ Verocytocin E. coli (VTEC) hay E. coli O157:H7  xuất huyết tiêu hóa - Enteroinvasive (EIEC)  triệu chứng của bệnh lỵ - Enteroadherent E. coli (EAEC): một dòng gây bệnh mới*SỰ PHÂN BỐ CỦA E. COLIDễ dàng tìm thấy trong môi trường nước, đất bị ô nhiễm, phân hay chất thảiCó thể tồn tại 2-3 tháng trong nước ở nhiệt độ thườngTrong các thực phẩm đông lạnh số lượng E. coli bị giảm theo thời gian. Sau 2 tháng có thể không tìm thấy E. coli trong sản phẩm *ĐỊNH TÍNH E. COLINguyên tắcTăng sinh trong môi trường chọn lọc cho Coliform ở 44oC. Môi trường tăng sinh chọn lọc có thể là Lauryl Sulphate Broth, Brilliant Green Bile Lactose Broth, EC Broth Phân lập trên môi trường chọn lọc phân biệt cho F. coliform: Eosin Methyl Blue Agar, Endo Agar, Mac Conkey Agar Khẳng định sinh hoá theo nghiệm pháp IMViC*MÔI TRƯỜNGEosin Methyl Blue AgarPepton 10gK2HPO4 2gLactose 5gSucrose 5gEosin Y 0.4gMethyl blue 0.07gAgar 13.5g*QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH E .COLILấy 1g (1ml) mẫu vào 10ml môi trường BGBLỦ ở 44.0  0.5oC trong 24-48 giờChọn các ống sinh hơi cấy sang Endo agarMẫu không sinh hơi được coi là âm tính E. coliỦ ở 37.0  0.5oC trong 24 giờChọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA hay BHI*E. coli trên môi trường Eosin methyl blue agar*QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH E .COLI (tt)Ủ ở 37.0  0.5oC qua đêm Kết luận: Phát hiện (không phát hiện) E. coli/gCấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hoá: Canh trypton (1), MRVP (2), Simmon Citrate (1) để thử nghiệm pháp IMViCE. coli có biểu hiện sinh hoá: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-). Một trong số các phản ứng trên sai là không phải E. coli**STAPHYLOCOCCUS AUREUSĐịnh nghĩaThuộc họ MicroccaceaeTế bào có hình cầu, thường tụ thành từng chùm hay từng đôiSống hiếu khí tuỳ nghiPhản ứng catalase, coagulase dương tínhPhản ứng Oxydase âm tínhHầu hết có khả năng tan huyết (95%)Có khả năng lên men tạo axit từ mannitolCó thể phát triển trong môi trường đến 10% NaClTrên môi trường không chọn lọc thường tạo sắc tố vàngTạo độc tố enterotoxin bền nhiệt*Hầu hết S. aureus đều có thể tạo protease và lipase ngoại bàoMột số S. aureus có phản ứng coagulase âm tínhS. intermedius và S. hyicus có phản ứng coagulase dương tính nhưng không cho khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Paker agar hay Chapman agar, không tan máu trên môi trường thạch máuSTAPHYLOCOCCUS AUREUS*SỰ PHÂN BỐ TRONG TỰ NHIÊNThường tìm thấy trên da, tóc hay các nơi ẩm thấp ở người và động vật máu nóngCác vết trầy xước hay lở loét là nơi tập trung của S. aureus Nhiễm vào thực phẩm chủ yếu qua việc chế biến, sản xuất không hợp vệ sinhPhát triển được ở nhiệt độ 10 - 45oC, pH 4.6 – 9.3, tối thích ở 37oC và pH 7Cạnh tranh yếu với các VSV khácBị ức chế ở mẫu có hoạt tính nước <86% hay nồng độ nuối 25%Enterotoxin được tạo ra ở 15oC, tối đa ở 37oCĐộc tố bền ở 100oC trong 30 phút*ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUSNguyên tắcCấy lượng mẫu xác định trên môi trường chọn lọc chuyên biệt. Ủ ở 37oCCác KL đặc trưng trên môi trường chọn lọc được thử nghiệm phản ứng coagulseS. aureus có phản ứng coagulase dương tính làm vón cục huyết tương*ĐỊNH TÍNH S. AUREUSNguyên tắc Tăng sinh 1g (ml) trong môi trường chọn lọc cho S. aureus trong 24-28 giờ / 37oCMẫu có biểu hiện dương tính được phân lập trên môi trường chọn lọc Khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ bằng phản ứng coagulase làm ngưng kết huyết tương*MÔI TRƯỜNGBaird Parker AgarPepton casein 10gCao thịt 5gCao nấm men 1gSodium pyruvate 10gGlycine 12gLithium chloride 5gAgar 15gEgg yolk tellurite 50mlpH 6.8 ±0.2*MÔI TRƯỜNGEgg yolk tellurite emulsionLòng đỏ trứng 200mlNaCl 4.25gPotassium tellurite 2.1gNước cất vô trùng đủ 1 lít*MÔI TRƯỜNGBaird Parker AgarPepton casein 10gCao thịt 5gCao nấm men 1gSodium pyruvate 10gGlycine 12gLithium chloride 5gEgg yolk 10mlNaCl 0.2gPotssium tellurite 0,105gAgar 15gNước cất 1 lít pH 6.8 ±0.2*QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUSCấy 0.1-0.3ml dd mẫu đã pha loãng (10-1) lên bề mặt môi trường Baird parker agar hay Chapman agar, trang đều bằng que tam giácỦ ngược đĩa ở 37.0  0.5oC trong 48 giờĐếm số KL đặc trưng (Nt) và số khuẩn lạc không đặc trưng (Na)Chuyển ít nhất 5 KL đặc trưng và 5 KL không đặc trưng sang môi trường TSAỦ ở 37.0  0.5oC qua đêm*QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUS (tt)Cấy chuyển vào ống chứa 0.3ml huyết tương, Kết quả: Số S. aureus (S cfu/g) 1S = (NtRt + NaRa) nVfỦ ở 37.0  0.5oC và theo dõi sau 2,4,6,8 giờ. Nếu không có biểu hiện dương tính sẽ ủ tiếp đến 24 giờ. Xác định tỉ lệ dương tính Rt (KL đặc trưng) và Ra (KL không đặc trưng)*Cấy 1g (1ml) vào ống nghiệm chứa 10ml MSBỦ ở 37.0  0.5oC trong 24 - 48 giờChọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang TSAỦ ở 37.0  0.5oC trong khoảng 48 giờChọn ống nghiệm dương tính: môi trường chuyển sang vàng để cấy chuyển sang Baird Parker agar hay Chapman agar.Mẫu không chuyển vàng là âm tính S. aureusQUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH S. AUREUS**QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH S. AUREUS (tt)Cấy chuyển vào ống chứa 0.3ml huyết tương, Kết quả: S. aureus dương tính khi có ngưng kết huyết tươngỦ ở 37.0  0.5oC và theo dõi sau 2,4,6,8 giờ. Nếu không có biểu hiện dương tính sẽ ủ tiếp đến 24 giờỦ ở 37.0  0.5oC qua đêmKết luận: Phát hiện (không phát hiện) S. aureus/g*Coagulase test*SALMONELLA Thuộc họ Enterobacteriaceae, có hình que, gram âm, không sinh bào tử, sống hiếu khí tuỳ nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khíHầu hết đều có khả năng di động bằng tiên mao (trừ S.pollurum/galinarum và các thể đột biến)Hầu hết có khả năng tạo H2S (trừ S. typhi)Có khả năng lên men và sinh axít từ glucose, mannitol nhưng không có khả năng này đối với lactose, sucroseKhông tạo indolCó khả năng tạo enzym lysine decarboxylase*PHÂN LOẠI SALMONELLA Có hai loài chính: Salmonella enterica: có 6 loài phụ gồm I, II, IIIa, IIIb, IV, VI. Các loài gây bệnh chủ yếu tập trung trong S. enterica ISalmonella bongori (V)Salmonella II, IIIa, IIIb, IV, VI và V thường tìm thấy trong động vật máu lạnh. Rất hiếm khi tìm thấy trong động vật máu nóngTên thường gọi: S. typhi, S. enteritidis là tên kiểu huyết thanh*PHÂN LOẠI KHÁNG NGUYÊNCó khoảng 2500 kiểu kháng nguyênKiểu kháng nguyên được chia dựa trên 3 loại kháng nguyên chính: Kháng nguyên O (soma): kháng nguyên màng tế bào, bền nhiệtKháng nguyên H (flagella): kháng nguyên tiên maoKháng nguyên Vi (capsul): kháng nguyên vỏ *PHÂN BỐ CỦA SALMONELLA - Được tìm thấy khắp nơi: đất, nước, thực phẩm Tế bào chủ của Salmonella: người, vật nuôi, động vật hoang dã và cả các loài thực vật- Nhĩm cĩ ký chủ rộng: S. enteritidis, S. typhimurium -Nhĩm có ký chủ hẹp: S. dublin, S. cholerasuis - Nhĩm có ký chủ chuyên biệt: S. typhi chỉ tìm thấy ở người và linh trưởng *NGUỒN NHIỄM VÀO THỰC PHẨMNguyên liệu chế biến Nguồn nước bị nhiễmQuá trình chế biến, vận chuyển, bảo quản không đảm bảo vệ sinhCác con đường lây nhiễm vào người Khoảng 90% lây nhiễm chủ yếu qua con đường thực phẩm và nước uốngKhoảng 10% lây nhiễm trực tiếp từ người sang người*BỆNH DO SALMONELLA Thương hàn do S. typhi và S. paratyphiBệnh đường ruột: có triệu chứng của ngộ độc thực phẩm: tiêu chay’, nôn mữa, buồn nôn, đau thắt vùng bụng, sốt Nhiễm trùng máuThời gian ủ bệnh từ 3 ngày đến 3 tuầnLiều gây bệnh 103  109 tế bào. Liều gây bệnh phụ thuộc vào trạng thái sức khoẻ và kiểu huyết thanh xâm nhiễm*ĐỊNH TÍNH SALMONELLA Qua 4 bước:Tiền tăng sinh: thực hiện trong môi trường không chọn lọc như Buffered Pepton WaterTăng sinh chọn lọc: thực hiện trong môi trường chọn lọc cho Salmonella: Selenite Cysteine Broth, Rappaport Vassiliadis broth (RV), Muller Kauffmann Tetrathionate Broth (TTB) Không có môi trường nào chọn lọc cho tất cả các kiểu huyết thanh SalmonellaNên chọn ít nhất 2 môi trường chọn lọc trên cùng một mẫuMôi trường RV và TTB không chọn lọc cho S. typhi*-Phân lập: được thực hiện trên môi trường chọn lọc phân biệt cho Salmonella: Xylose lysine desoxycholate agar (XLD), Shigella Salmonella agar (SS), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BPLS) Nên sử dụng ít nhất 2 môi trường phân lập cho cùng một mẫu để tăng cường khả năng phát hiện SalmonellaMôi trường XLD được khuyếnh kích sử dụng-Thử nghiệm sinh hoá: KIA, lên men mannitol, LDC, urea, indol -Thử nghiệm huyết thanh: đa giá và đơn giáĐỊNH TÍNH SALMONELLA (tt)*MÔI TRƯỜNGBuffered pepton waterPepton 10gNaCl 5gNa2HPO4. 12 H2O 9gKH2PO4 1.5gNước cất 1 lítpH 7.0 ± 0.2*Xylose lysine desoxycholate agarCao nấm men 3gNaCl 5gD(+) xylose 3.5gLactose 7.5gSucrose 7.5gL(+) lysine 5.0gSodium desoxycholate 2.5gSodium thiosulphate 6.8gAmmonium iron (III) citrate 0.8gPhenol red 0.08gAgar 13.5gpH 7.4 ± 0.2MÔI TRƯỜNG*Selenite cysteine brothCasein pepton 5.0gL-Cysteine 0.01gLactose 4gK2HPO4 10gSodium hydrogen selenite 4.0gNước cất 1 lítpH 7.0 ± 0.2MÔI TRƯỜNG*QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA Cân 25g mẫu + 225g BPW, đồng nhấtỦ ở 37.0  0.5oC trong 16 - 24 giờCấy phân lập sang môi trường XLD, SS, HEAỦ ở 37.0  0.5oC trong khoảng 24 giờChọn khuẩn lạc đặc trưng: trong suốt có hay không có tâm đen, cấy sang TSA hay BHIChuyển 0.1ml canh khuẩn sang ống nghiệm chứa 10ml Selenite Cystein BrothỦ ở 37.0  0.5oC trong khoảng 24 giờ*Salmonella trên XLDSalmonella trên HEA*QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA (tt)Cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hoá: KIA, Manitol Phenol Red Broth, Urea Broth, Lysine Decarboxylase Broth, Canh TryptonỦ ở 37.0  0.5oC qua đêmBiểu hiện của Salmonella: trên KIA: đo û/ vàng / H2S (+) / gas (+); Urea (-); Mannitol (+); Indol (-); LDC (+); ngưng kết với KHT O đa giáỦ ở 37.0  0.5oC trong khoảng 24 giờPhát hiện (không phát hiện) Salmonella / 25g*VIBRIO CHOLERAEĐịnh nghĩa:Là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không bằng nhau, di động rất nhanh trong môi trường nướcCó phản ứng oxydase dương tínhLên men được sucroseKhử nitrat thành nitriteCó khả năng phân huỷ lysine nhưng không phân hủy arginineCó thể phát triển trong môi trường không có NaCl đến 3% NaCl, bị ức chế trong môi trường có 6,8,10% NaClCó phản ứng ONPG dương tínhNhạy cảm với Vibrio staticum 10g và 150 g *+-+-++--SS*PHÂN LOẠI V. CHOLERAEChia thành 2 nhóm: V. cholerae O1 và non – O1V. choleare O1 tập trung các kiểu huyết thanh gây bệnh như Ogawa, Inaba, Hikojima (classic)Kiễu huyết thanh Eltor còn được gọi là O129V. cholerae non – O1 là nhóm gây bệnh cơ hội*TÍNH GÂY BỆNH VÀ SỰ PHÂN BỐV. cholerae gây bệnh thổ tả cho ngườiLà vi sinh vật bản địa trong nướcLan truyền truyền dịch tả rất nhanh do tính di động và phát tán nhờ nướcKhi vào cơ thể chúng sản sinh choleratoxin là loại độc tố có cường độ gây bệnh mạnh và các độc tố khác như hemolysine có tác dụng như shiga toxinV. cholerae nhiễm vào người qua đường thực phẩm và nước uống, cũng có thể truyền trực tiếp từ người sang ngườiCác loại nước uống và thực phẩm thuỷ hải sản tươi sống có khả năng nhiễm V. cholerae cao*PHÁT HIỆN V. CHOLERAE TRONG THỰC PHẨMGồm ba công đoạn chínhTăng sinh chọn lọc trong môi trường nước pepton kiềm có pH 8.6 Phân lập trên môi trường chọn lọc phân biệt TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar)Thử nghiệm sinh hoá: KIA, tính di động trong thạch mềm, oxydase, phản ứng string, LDC, ADH, lên men mannitol, thử nghiệm tính chịu mặn, ONPG, nhạy cảm Vibrio staticum O/129 *MÔI TRƯỜNGNước Pepton Kiềm (Alkaline Pepton Water)Pepton 10gNaCl 10 gNước cất 1 lít pH 8.6 ± 0.2*TCBS agarPepton casein 5gPepton thòt 5gCao naám men 5gSodium citrate 10gSodium thiosulphate 10gOx bile 5gSodium cholate 3gSucrose 20gNaCl 10gIron (III) citrate 1gThylmol blue 0.04gBrommothymol blue 0.04gAgar 14g pH 8.6 ± 0.2MÔI TRƯỜNG*QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH V.CHOLERAE Đồng nhất 25g mẫu với 225 APWỦ ở 37.0  0.5oC Chọn khuẩn lạc đặc trưng: vàng, đường kính 2-3mmỦ ở 37.0  0.5oC trong khoảng 24 giờCấy chuyển sang BHI hay TSA có 1% NaClPhân lập lên TCBS Phân lập lên TCBS 6-8giờ16-20giờ*QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH V.CHOLERAE (tt)Ủ ở 37.0  0.5oC qua đêmCấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hoá: KIA, Thạch mềm, Canh trypton 0, 3,6,8,10%NaCl, thử nghiệm oxydase, ONPG, LDC, Vibriostaticum O/129 10 và 150gỦ ở 37.0  0.5oC qua đêmBiểu hiện của V. cholerae : trên KIA: đo û/ vàng / H2S (-) / gas (-); LDC (+); 0%NaCl (+), 3%NaCl (+); 6%NaCl (-); 8%NaCl (-); 10%NaCl (-); oxydase (+); ONPG (+), O/129 10g (S), O/129 150g (S),*V. CHOLERAE*LISTERIA MONOCYTOGENESĐịnh nghĩa:Gram (+) trong canh khuẩn nonDi động trong canh khuẩn khi nuôi cấy <25oC.Trong thạch mềm: chuyển động dùTrong giọt treo: chuyển động xoayTan huyết yếuCAMP (+) với S. aureus; (-) với R. equiRhamnose (+) / 48hXylose (-) /48h*PHÂN BỐRộng khắp trong môi trường: đất, nước, thực phẩm, trong nhà xưởng, phân Thực phẩm: đã gia nhiệt, bảo quản lạnh Nhiễm vào thực phẩm qua nguyên liệu, nước và qui trình chế biến*MÔI TRƯỜNGTăng sinh 1: Listeria enrichment broth 1 (UVM Listeria enrichment broth):Thành phần chọn lọc: Nalidixic acid: 40mg/lít Acriflavine: 25mg/lítTăng sinh 2: Listeria enrichment broth 2 (UVM Listeria enrichment broth)Thành phần tương tự UVM 1Lượng Acriflavine: 250mg/lít*MÔI TRƯỜNGPhân lập: Oxford Listeria selective agarPalcam agarSinh hoáThạch mềm: BHI bán lỏngBHIThạch máuRhamnose phenol red brothXylose phenol red broth*QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH L. MONOCYTOGENES Cân 25g mẫu + 225g UVM1, đồng nhấtỦ ở 30.0  0.5oC trong 16 - 24 giờCấy phân lập sang môi trường Oxford/Palcam agarỦ ở 30.0  0.5oC trong khoảng 24 giờChọn khuẩn lạc đặc trưng: nhỏ, nâu xám, lõm, mơi trường xung quanh chuyển nâu đen, cấy sang TSAChuyển 0.1ml canh khuẩn sang ống nghiệm chứa 10ml UVM 2Ủ ở 37.0  0.5oC trong khoảng 48 giờ*QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH L. MONOCYTOGENESCấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hoá: --- BHI lỏng/bán rắn: ủ 22oC/24-48hThạch máu/ phản ứng CAMP: ủ 37oC/24-48h Rhamnose/Xylose phenol red borthỦ ở 37.0  0.5oC qua đêmBiểu hiện của L. mono.:- Di động dù / xoay, Gram (+)Tan máu yếu, CAMP (+) với S. aureus/ (-) với R. equiRhamnose (+)/ Xylose (-)Phát hiện (không phát hiện) L. monocytogenes / 25g*L.monocytogenes trên Palcam agar và Oxford agar*L. monocytogenes trên ALOA agar