Sinh học - Chuyển gene

CHUYỂN GENE Nguyễn Thái Thủy, MSc. National Sales Manager Bio-Rad Laboratories VN Email: thai_thuy@bio-rad.com NỘI DUNG Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene Các phương pháp chuyển gene đang được sử dụng. Lipofection Electroporation Biolistics Microinjection GIỚI THIỆU KỸ THUẬT CHUYỂN GENE 1928 – Báo cáo đầu tiên về chuyển gene: vi khuẩn có thể thu nhận sinh chất nào đó từ môi trường sống làm chúng thay đổi. Chuyển gene = chuyển gene/genome từ sinh vật này vào genome sinh vật khác. GIỚI THIỆU KỸ THUẬT CHUYỂN GENE Chuyển toàn bộ nuclear TẠI SAO PHẢI CHUYỂN GENE Nghiên cứu: Biểu hiện gene trong tế bào sống Điều hòa biểu hiện gene Tầm soát các hướng trị liệu Sinh học ung thư TẠI SAO PHẢI CHUYỂN GENE Ứng dụng: dùng tế bào sống để sản xuất các vector di truyền, protein tái tổ hợp phục vụ cho các mục đích chuyên biệt: heo sản xuất nội tạng người phụ vụ cấy ghép, protein trị liệu tái tổ hợp thế hệ thứ ba được tạo ra và sử dụng ngay trong tế bào chủ, thực vật kháng côn trùng, chống chịu nhiệt độ cao, chống chịu lạnh, chống chịu hạn vaccine DNA trị liệu gene Tại sao phải chuyển gene Cloning: Cừu với genome xác định CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE Khuếch tán thụ động: vi khuẩn thu nhận DNA không cần bất kỳ xử lý đặc biệt nào. Khuếch tán được hổ trợ: ví dụ tế bào vi khuẩn xử lý CaCl 2 kèm sốc nhiệt ở 42 0 C. Vector vi khuẩn/virus: ví dụ Agrobacterium tumefaciens hay CaMV chuyển DNA vào thực vật Lipofection Electroporation Biolistics Microinjection LIPOFECTION Sử dụng hóa chất hữu cơ tổng hợp lipid-polyamines thiết kế đặc biệt để chuyển nucleic acid vào tế bào động vật hữu nhũ. Cấu tạo bao gồm đầu ưa nứơc (+) và đuôi kỵ nước (-). Đầu (+) bám với nucleic acid (-) Lipid micelle phản ứng với màng tế bào để chuyển nucleic acid vào bên trong tế bào. Sử dụng để chuyển DNA/RNA vào trong rất nhiều loại tế bào. Độc tính đối với tế bào thấp LIPOFECTION ELECTROPORATION Electroporation ( chuyển gene xung điện) sử dụng điện trường mạnh trong thời gian ngắn làm tạm thời mất tính ổn định của màng tế bào. Trong thời gian này, màng tế bào có khả năng thấm cao đối với các phân tử hiện diện trong môi trường xung quanh. Nhờ đó, DNA/ RNA có thể được chuyển vào tế bào. ELECTROPORATION Electroporation CÁC ƯU ĐIỂM CỦA ELECTROPORATION Không sử dụng hóa chất, không làm thay đổi cấu trúc, chức năng của tế bào đích Dễ thực hiện Thời gian ngắn Không độc hại Hiệu quả cao Có thể áp dụng cho nhiều loại tế bào ỨNG DỤNG CỦA ELECTROPORATION Chuyển các gene marker Sát nhập các gene chức năng Chuyển thuốc, protein, mồi phân tử, các chất chuyển hóa, kháng thể để khảo sát chức năng và cấu trúc của tế bào. CƠ CHẾ • Tế bào được cho vào cuvette cùng với DNA • Cho xung điện qua cuvette và điện trường tạo các lỗ trên màng tế bào. • DNA đi vào trong tế bào qua các lỗ • Khi xung điện tắt, các lỗ trên màng tế bào đóng lại, giữ lại các DNA bên. HỆ THỐNG GENE PULSER Xcell Main unit CE module PC module ShockPod (Capacitance Extender) (Pulse Controller) CHỨC NĂNG Tạo hai loại xung: dạng hàm mũ giảm, dạng sóng vuông. Đáp ứng tối ưu với nhiều loại tế bào, eukaryote hay prokaryote. CHỨC NĂNG PulsTrac đảm bảo cung cấp hiệu điện thế chính xác. Charger Charging Circuit Discharge Circuit Capacitor Cuvette 3ohm resistor CHỨC NĂNG ARQ giảm khả năng tạo tia lửa điện ở điện thế cao, bảo vệ mẫu và thiết bị Ion tích tụ trên bề mặt mẫu tạo hiện tượng tia lửa điện CHỨC NĂNG PC module điều chỉnh thời gian xung điện phù hợp với điện trở của mẫu nhờ điện trở nối song song với cuvette mẫu. Nhờ vậy các mẫu có điện trở cao ( vi khuẩn) không bị chết do xung điện dài. Charger Charging Circuit Discharge Circuit Capacitor Cuvette 3ohm resistor Pulse Controller Resistor in parallel CHỨC NĂNG Chương trình đã thiết lập sẵn cho một số tế bào thông dụng. TB ĐVHN TB VK TB Nấm CHO E. coli S. cerivisiae Cos7 A. tumefaciens P. pastoris 3T3 P. aeruginosa C. albicans 293 S. aureus S. pombe HeLa B. cereus D. discoideum BHK21 S. pyogenes A549 L. plantrum CV1 K562 HL60 Jurkat HuT78 Bird BIOLISTICS- BẮN GENE Chuyển nucleic acid vào trong tế bào bằng cách bắn vi đạn phủ nucliec acid vào chúng. Helios Gene Gun PDS-1000/He ƯU ĐIỂM Phương pháp đơn gỉan, nhanh, linh động Không phụ thuộc loại tế bào Sử dụng ít DNA Chuyển một hoặc nhiều gene Có thể chuyển đoạn DNA lớn Không chuyển gene không mong muốn hoặc protein Ít thao tác trên tế bào Độ lập lại cao Helios Gene Gun Súng cầm tay – có thể áp dụng thực địa Aùp suất 100 – 600 psi Vùng đích nhỏ cho phép định vị mục tiêu chính xác ĐỐI TƯỢNG In vitro – tế bào động vật, thực vật nuôi cấy, cơ quan In vivo – động vật, thực vật, giun, côn trùng, nấm men, tảo, vi khuẩn và các vi sinh vật khác In situ – Mô thực vật, cơ quan nuôi cấy LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU Biểu hiện gene Liệu pháp gene Miễn dịch di truyền Sinh học ung thư Hàn vết thươnmg Bệnh nhiễm trùng Đánh dấu màu các neuron QUY TRÌNH Vi đạn vàng Vi đạn bằng vàng vì: . Vàng không gây độc cho tế bào . DNA gắn lên vàng không bị phân hủy Chuẩn bị ống đạn CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG b-gal expression in CHO cells CHUYỂN GENE in vitro THÔNG SỐ CHO in vitro Aùp suất Helium 100 – 200 psi Kích thước vi đạn 1.6 µm Số lượng DNA 0.5 – 2.5 µg DNA/mg gold (0.06 – 1.25 µg DNA/cartridge) Số lượng vi đạn 0.125 – 0.5 mg/tube 0.5mg vi đạn vàng 400 psi, 24 hours sau bắn gene CHUYỂN GENE in vivo THÔNG SỐ CHO in vivo Aùp suất Helium 200 – 400 psi Kích thước vi đạn vàng 1.6 µm Số lượng DNA 1.0 – 2.5 µg DNA/mg gold (0.12 – 1.25 µgDNA/cartridge) Số lượng vi đạn vàng 0.25 – 0.5 mg/tube CHUYỂN GENE Ở GIUN CHUYỂN GENE Ở LÁ CÂY • Chuyển cDNA virus vào khoai tây. Tuija Kekarainen and Jari P. T. Valkonen, Department of Plant Biology, Swedish MẪU CẮT NÃO CHỒN FERRET Dr. Donald Lo / Duke University HỆ THỐNG PDS-1000/He in vitro, ex vivo (và in vivo cho một số thực vật, vi sinh vật) Aùp dụng cho tế bào động vật, cơ quan nuôi cấy, tế bào và mô thực vật nuôi cấy, phấn hoa, côn trùng, tảo, nấm và vi khuẩn Aùp suất trong khoảng 450 - 2200 psi Vùng bắn lớn – nhiều tế bào được chuyển • In Vitro – Tế bào và cơ quan động vật nuôi cấy, tế bào thực vật • Ex vivo – mô và phấn hoa thực vật • In vivo - một số thực vật, côn trùng, tảo, nấm, vi khuẩn và một số vi sinh vật ĐỐI TƯỢNG • Biểu hiện gene • Công nghệ sinh học nông nghiệp và phát triển mùa vụ – vaccine cho thực vật • Kháng bệnh LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU PDS-1000/He CHUẨN BỊ MẪU PDS-1000/He Rupture Disk PDS-1000/He Nạp Macrocarrier 1 2 3 4 PDS-1000/He Nạp Tế Bào Đích PDS-1000/He Bắn THÔNG SỐ Vi Khuẩn 29 6 1100 M5 Tungsten Nấm Men 28 6 1300 0.6m vàng Tảo 29 6 1300 0.6m vàng TB Thực Vật 28 9 1100 1.0m vàng TBĐông Vật 15 3 1100 1.6m vàng Vacuum Target dist Helium Kích thước vi đạn ins Hg cm psi Lúa Mạch Chuyển Gene Peggy G. Lemaux and colleagues / UC Berkeley PDS-1000/Hepta • Bộ chuyển đổi cho 7 ngõ ra • Tạo vùng bắn lớn • Thích hợp số lượng lớn mẫu • Aùp dụng cho tế bào và cơ quan động vật nuôi cấy, tế bào và mô thực vật, nấm men và vi khuẩn Helios Gene Gun PDS1000/He PDS1000/He Hepta Điều kiện thí nghiệm In situ, in vitro In vivo, ex vivo In vitro, ex vivo in vivo (plants) in vitro, ex vivo in vivo (plants) Kích thước vùng bắn nhỏ (2cm 2 ) lớn (40cm 2 ) Lớn nhất (~75cm 2 ) Aùp suất 100-600psi 450-2200psi 450-2200psi Loại đích Động vật: mọi loại mô có thể tiếp xúc trực tiếp; da, cơ quan; tế bào, mô, cơ quan nuôi cấy Thực vật: trên đồng ruộng, nhà kính, mô và tế bào nuôi cấy Nấm men, vi khuẩn, Vi sinh vật Động vật: tế bào và cơ quan nuôi cấy Thực vật: thực vật nhỏ nguyên vẹn, tế bào và mô nuôi cấy Nấm men, vi khuẩn, Vi sinh vật Động vật: tế bào và cơ quan nuôi cấy Thực vật: tế bào vách mỏng Nấm men, vi khuẩn, Vi sinh vật So Sánh Helios va øPDS MICROINJECTION ĐẶC HIỆU Nhắm đến một tế bào Thao tác vật lý tế bào Cho vào hoặc lấy ra các thành phần của tế bào THÀNH PHẦN Kính hiển vi THÀNH PHẦN Kính hiển vi, bộ vi thao tác THÀNH PHẦN Kính hiển vi, bộ vi thao tác, bộ vi tiêm Thành phần của hệ thống Vi thao tác: • motor tự động – 3 trục – Di chuyển 25mm – Độ phân giải 40nm Bộ điều khiển Tay điều khiển joystick – Joystick treo – Có bộ nhớ vị trí Vi tiêm kỹ thuật số: • 2 kênh áp suất – Giữ – Tiêm/chuyển • Bộ giao diện điều khiển • Bộ nén bên trong -350 đến +5600 hPa Thành phần của hệ thống Vi Tiêm Đồng Bộ: • syringe micrometer • 2 vận tốc • Tương thích nhiều thể tích • Dùng dầu hoặc nước Thành phần của hệ thống ỨNG DỤNG Tạo động vật chuyển gene Vi tiêm tế bào cố định Thụ tinh nhân tạo TẾ BÀO KHÔNG CỐ ĐỊNH • 2 microtools – Giữ – Bơm/chuyển • Aùp suất thấp – Dương (tiêm) – Aâm (giữ, hút) VI TIÊM TIỀN NHÂN Hợp tử ở giai đoạn tiền nhân của tế bào động vật hữu nhủ được tiêm dung dịch DNA. Tiêm DNA vào trong tiền nhân Hợp tử phát triển thành các thể có thể biểu hiện chuyển gene CHUYỂN TẾ BÀO MẦM Phôi chưa biệt hóa chứa khoảng 100 tế bào mầm được chuyển vào một số tế bào mầm mang đột biến gene quan tâm Phôi phát triển thành cá thể mang thể khảm. CHUYỂN NHÂN Tế bào trứng được lấy toàn bộ nhân ra bằng vi hút Chuyển nhân tế bào sinh dưỡng vào tế bào trứng Kết quả tạo dòng vô tính (cừu Dolly 1996) Tế bào trứng được vi tiêm tinh trùng Thụ tinh nhân tạo intracytoplasmic sperm injection (ICSI) TẾ BÀO CỐ ĐỊNH • phase contrast • Góc thao tác 45 độ • 1 vi thao tác • 1 vi tiêm kỹ thuật soô1 Gene Transfer Gene Pulser Xcell MicroPulser Cuvettes Helios Gene Gun PDS-1000/He XenoWorks LipidCompetent Cells ElectroCompetent Cells Electroporation GT Reagents Biolistics Microinjection Lipid Transfection Cơ chế tự nhiên có ở hầu hết eukaryotes giúp điều hoà biểu hiện gene liên quan đến quá trình biệt hóa, hay chống lại sự xâm nhập của virus. • RNAi: RNA interference, RNA mạch đôi bám vào mRNA làm bất hoạt biểu hiện gene. • siRNA: small interfering RNA Ứng dụng mới: RNAi trong ức chế HBV ở chuột. McCaffrey, A. P. et al. RNAi và Central Dogma A B Cơ Chế RNA Bước 1: dsRNA> 25nt vào trong tế bào, Dicer endonuclease cắt dsRNA thành siRNAs (MacRae et al.2006), hoặc chuyển các siRNA <25 nt vào trong tế bào Bước 2: siRNAs gắn với phức hợp protein RISC (RNA-induced silencing complex) và loại bỏ bớt một mạch đơn RNA. Bước 3: RISC-siRNA gắn đặc hiệu bổ xuang với mRNA đích và phân cắt mRNA này. 21-25 nt siRNA dsRNA (>25 nt) Dicer hoặc RISC siRNA Phân cắt mRNA bị phân hủy RISC Nhận biết mục tiêu Chuyển vô tế bào đích siRNA Quy Trình Thí Nghiệm RNAi Gene ExpressionProtein Expression Phát hiện và phân tích • qRT-PCR • Microarrays • Northern Blots • 2-D Analysis • Western Blots • Bio-Plex assays Microarray Phân tích Protein Expression (2D, Bio-Plex, Western blotting) Quy Trình Thí Nghiệm RNAi : qRT-PCR Reverse Transcription & amplification iScript cDNA kits iQ Supermixes iTaq Supermix iProof polymerase PCR instrument Chuyển RNAi • siLentFect • Transfectin •Gene Pulser Xcell Phân tích •Real time PCR Systems (iQ 5, Chromo 4, MyiQ) •Experion System •SmartSpec Plus •VersaFluor fluorometer Phân tích RNA (Chất lượng, hiệu suất) Chuẩn bị RNA •Aurum Total RNA Kits Quy Trình Thí Nghiệm RNAi : Microarray Phân tích Label probes bằng Cy3 & CY5 Lai trên microarray Scan mức độ biểu hiện Tạo microarray slides • VersArray Hybridization Chamber •BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer •Gene Pulser Xcell •siLentFect Lipid Reagent •TransFectin (vector-based) • VersArray ChipReader Xác định lại qRT-PCR Chuẩn bị RNA •Aurum Total RNA Kits •Experion System •SmartSpec Plus •VersaFluor Phân tích RNA (số lượng, hiệu suất) Chuyển RNAi •GeneGazer Software •VersArray analyzer 5.0 Đánh giá số lượng và hiệu suất SDS-PAGE Chụp ảnh và phân tích Chuẩn bị mẩu protein Quy Trình Thí Nghiệm RNAi : điện di SDS-PAGE và blotting Chuyển RNAi Gene Pulser Xcell • siLentFect Lipid Reagent (siRNA) •TransFectin or HEKFectin (vector-based) • Immun-Star Chemiluminescent Kits • Immun-Blot Colorimetric Assay Kits • Amplified Alkaline Phosphatase Immun-Blot Kit • Opti-4CN Substrate and Detection Kits • Colorimetric Blotting Substrates; Conjugated 2o Antibodies • Molecular Imager FX Pro Systems • VersaDoc systems • ChemiDoc XRS system • Gel Doc XR system • Quantity One 1-D Analysis Software •Mini-PROTEAN 3 Cell •Ready Gel Precast Gels •Criterion Cells + Precast Gels •PROTEAN Plus and PROTEAN Cells •Protein Standards •Power supplies •Protein Prep kits •Premixed Sample Buffers •Protein Blotting Membranes •Protein Blotting Cells •Protein Blotting Buffers Đánh dấu/ phát hiện Blotting/Transfer Experion System SmartSpec Plus VersaFluor Fluorometer Protein Assays (Bradford, RC DC, ..) 1 st dimension IEF 2 nd dimension SDS-PAGE Chụp ảnh và phân tíchCắt các spot quan tâm Chuẩn bị mẫu protein Quy Trình Thí Nghiệm RNAi : điện di 2D Chuyển RNAi •EXQuest Spot Cutter •PROTEAN IEF Cell •ReadyStrip IPG Strips •Power Supplies •Silver stain •Coomassie Blue •SYPRO Ruby •Dodeca stainers •Molecular Imager FX Pro systems •VersaDoc systems, PDQuest software •Mini-PROTEAN 3 Cell •Ready Gel Precast Gels •Criterion Cells + Precast Gels •PROTEAN Plus and PROTEAN Cells •Protein Standards •Power Supplies Nhuộm gel •Aurum serum protein mini kits •Aurum Affi-Gel Blue mini kits •Aurum ion exchange mini kits •ReadyPrep 2-D Starter kit •Premixed Sample BuffersPhân tích Protein Expression (Bio- Plex, Western blotting, etc); or qRT-PCR, Microarrays Xác định các spot bằng Mass Spec Gene Pulser Xcell • siLentFect Lipid Reagent (siRNA) •TransFectin or HEKFectin (vector-based) Quy Trình Thí Nghiệm RNAi : Bio-Plex Chuẩn bị mẫu protein Phân tích biểu hiện Chuyển RNAi •Bio-Plex Cell Lysis Kit Bio-Plex Suspension Array System •Bio-Plex Phosphoprotein Assays •Bio-Plex Total Target Assays Bio-Plex Assays (qRT-PCR, Microarrays, Northern blots) Western blotting • siLentFect • Transfectin • HEKFectin • Gene Pulser Xcell Chuột được chuyển plasmid mang bộ gene HBV vào gan: biểu hiện bệnh, HBV có sinh sản Chuột được chuyển thêm plasmid có siRNA chuyên biệt cho HBV mRNA: ức chế sinh sản HBV. Triển vọng: điều trị HBV, bệnh nhiễm virus Vấn đề cần giải quyết: phương pháp chuyển gene ứng dụng cho điều trị không ảnh hưởng đến tế bào chủ.