Sinh học - Chương 3: Sản xuất sản phẩm từ vi sinh vật

CHƯƠNG 3: SẢN XUẤT SẢN PHẨM TỪ VI SINH VẬT 1 NỘI DUNG 3.1. Sản xuất amino acid 3.2. Sản xuất enzyme 3.3. Sản xuất chất kháng sinh 2 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID • Đặc tính và vai trò của amino acid: – Là thành phần cấu tạo nên . – Hầu hết aa trong tự nhiên đều có dạng L, sinh vật sử dụng aa dạng L là chủ yếu – Một số aa dạng D mà gia cầm và heo có thể sử dụng: Lysine, Valine, Methionine 3 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID • Vì sao phải sản xuất amino acid? • Cần sản xuất loại amino acid nào? 4 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID • Aa dễ được hấp thu. • Aa cần thiết cho người và vật nuôi – Cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp một số aa thiết yếu – Số lượng aa thiết yếu phụ thuộc vào giống loài và giai đoạn phát triển. – Vd: ở người, có . aa thiết yếu ở giai đoạn . → cần bổ sung nguồn aa từ động thực vật hoặc sản xuất công nghiệp Nếu thiếu một số aa hay một aa nào đó → trạng thái bệnh tật cho cơ thể → tình trạng sức khoẻ kém. 5 Các aa dùng trong công nghiệp thực phẩm 6 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID • Trong chăn nuôi, vật nuôi cũng cần lượng aa từ bên ngoài, nhưng thức ăn cung cấp thường không đủ – Aa giới hạn là aa thiết yếu có hàm lượng trong thức ăn thấp hơn so với nhu cầu của vật nuôi I need more L-Lysine 7 Aa giới hạn • Chỉ số aa giới hạn Paa= (aa khẩu phần/ aa nhu cầu)*100 • Axit amin nào có Paa thấp nhất là aa giới hạn thứ nhất Met Phe Try Khẩu phần % 0.50 0.2 0.1 Nhu cầu % 0.60 0.4 0.15 Paa 83% 50% 67% 8 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID aa giới hạn trong vài loại thức ăn cho heo, gà 9 Cân bằng aa trong khẩu phần 10 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID • Sản lượng aa được sản xuất công nghiệp ngày càng tăng. • Một số lĩnh vực hỗ trợ quá trình sản xuất aa: – Phân lập vsv sinh aa, tạo vsv mới bằng công nghệ gen có hoạt tính sinh aa cao – Kết hợp tổng hợp hóa học và enzyme và vsv – Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền – Tối ưu hóa các điều kiện lên men nhằm thu nhận tối đa lượng aa từ vsv 11 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID Một số aa được sản xuất và ứng dụng: (thống kê 2003) 12 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID Các phương pháp sản xuất aa: 1. Tách chiết aa từ dịch thủy phân protein • Dùng thu nhận L-C, L-Y • Phụ thuộc vào tính sẵn có của nguyên liệu để ứng dụng phương pháp này hóa chất/enzyme Protein aa 13 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID Các phương pháp sản xuất aa: 2. Tổng hợp hóa học – Dây chuyền phản ứng hóa học từ các tiền chất – Thường tạo ra 2 dạng đồng phân D và L, khó tách ra – Một số aa tổng hợp được: M, K, W, T, G Vd: Sx Methionine từ acrolein 14 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID Các phương pháp sản xuất aa: 3. Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật – Lên men trực tiếp trong môi trường – Chuyển hóa tiền chất của aa nhờ vsv – Sử dụng enzyme tự do hoặc cố định hoặc tế bào sinh enzyme được cố định. 15 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID Các phương pháp sản xuất aa: 3. Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật Quy trình chung của lên men để thu nhận sản phẩm từ vsv 16 Các phương pháp sản xuất aa: 3. Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật • Nguyên liệu: Đảm bảo cung cấp nguồn carbon, nitơ, và các nguyên tố khác để vi sinh vật phát triển và tổng hợp được nhiều sản phẩm. – Nguồn carbon: rỉ đường, nguyên liệu giàu tinh bột (khoai mì, bắp..) . – Nguồn nitơ: ure, muối amoni, – Các hợp chất khoáng – Các chất kích thích sinh trưởng: vitamin, aa cần thiết cho quá trình tổng hợp aa mong muốn trong vi sinh vật 17 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng  Nồng độ và thành phần thích hợp phụ thuộc vào chủng vi sinh vật và giống sản xuất  Điều chỉnh pH và thanh trùng môi trường 18 Các phương pháp sản xuất aa: 3. Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID Chuẩn bị giống • Chủng vi sinh vật trong môi trường bảo quản • Nhân giống các cấp Lên men  Chú ý điều chỉnh các thông số kỹ thuật  pH, nhiệt độ, thông khí, bổ sung chất dinh dưỡng 19 Xử lý và thu nhận sản phẩm • Tùy vào mục đích sử dụng mà thực hiện các biện pháp xử lý và thu nhận khác nhau: – Dùng để chế biến thức ăn gia súc: cần dạng tinh khiết hoặc chỉ cần chế phẩm thô – Dùng trong chế biến thực phẩm hoặc y học: cần độ tinh sạch cao hơn 20 Các con đường biến dưỡng aa 21 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID • Các chủng vsv dùng sản xuất aa Cryptococcus laurentii Corynebacterium glutamicum 22 3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID • Các chủng vsv dùng sản xuất aa Cryptococcus laurentii Corynebacterium glutamicum 23 3.2. SẢN XUẤT ENZYME • Ưu điểm của việc dùng VSV tổng hợp enzyme • Hệ enzyme phong phú: protease, cellulase, racemase, amylase, trong vsv có thể phục vụ nhiều nhu cầu khác nhau • Enzyme của VSV có hoạt tính cao hơn enzyme từ sinh vật khác. • VSV sinh trưởng và phát triển nhanh, lượng enzyme trong tế bào lớn → thích hợp cho sản xuất công nghiệp 24 3.2. SẢN XUẤT ENZYME • Ưu điểm của việc dùng VSV tổng hợp enzyme • Quy trình nuôi dễ công nghiệp hóa, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền → hiệu quả kinh tế cao • Các chu kỳ lên men ngắn ngày. • Có thể kiểm soát trạng thái sinh lý của vi sinh vật trong quá trình lên men và đảm bảo được tính đồng nhất của các mẻ lên men. 25 3.2. SẢN XUẤT ENZYME • Ưu điểm của việc dùng VSV tổng hợp enzyme • VSV có khả năng điều chỉnh quá trình trao đổi chất để thích nghi với môi trường→ thay đổi thành phần môi trường để thu nhận enzyme mong muốn 26 3.2. SẢN XUẤT ENZYME • Ưu thế của việc dùng VSV tổng hợp enzyme • Một số VSV có khả năng tiết enzyme ngoại bào → không phải phá vỡ tế bào để thu nhận enzyme → tái sử dụng nhiều kỳ và dễ dàng thu nhận sản phẩm 27 3.2. SẢN XUẤT ENZYME • Các công đoạn chính: 1. Lựa chọn chủng: dựa vào nhu cầu thực tế – VD: thu nhận protease loại nào? với mục đích gì? – Thu nhận chitinase, để phân giải chitin từ vỏ tôm 2. Sử dụng các kỹ thuật trên giống – Phân lập từ mẫu thích hợp – Huấn luyện thích nghi – Cải tạo 28 3.2. SẢN XUẤT ENZYME • Các công đoạn chính: 3. Xác định thành phần môi trường lên men: cần cung cấp đầy đủ lượng C, N, O, nước và khoáng – Nguồn C: đường , rỉ đường, nước ép trái cây, cám mì, cám gạo, bã rượu . – Nguồn N: nước chiết bắp, bột đậu nành, dịch thủy phân casein, cao nấm men, – Nhu cầu về vitamin hay chất sinh trưởng Việc xác định thành phân môi trường thường qua nhiều nghiên cứu với quy mô rộng dần (scale up) 29 • Hãy thiết kế thí nghiệm xác định thành phần dinh dưỡng để nuôi cấy Bacillus cho việc sản xuất protease cao nhất. • Nêu cách thức phân lập và lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh cellulase. 30 3.2. SẢN XUẤT ENZYME • Các công đoạn chính: 4. Lên men: lựa chọn phương pháp lên men và điều kiện lên men thích hợp – Lên men bề mặt: cám, tấm lên men mốc sinh amylase – Lên men bề sâu (lên men chìm) – Điều kiện cần lưu ý: nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy 31 3.2. SẢN XUẤT ENZYME • Các công đoạn chính: 5. Thu nhận enzyme và xử lý an toàn chất thải – Chế phẩm enzyme thô: sử dụng toàn bộ canh trường lên men • Không tinh khiết • Không bảo quản lâu – Chế phẩm enzyme kỹ thuật: • Đối với enzyme ngoại bào: thu dịch, trích ly enzyme • Đối với enzyme nội bào: phá vỡ tế bào, thu nhận enzyme qua tủa phân đoạn, hoặc tách qua cột sắc ký sau đó cô chân không 32 • Thu nhận enzyme bằng sắc ký ái lực 33 • Thu nhận enzyme bằng tủa phân đoạn 34 3.2. SẢN XUẤT ENZYME Một số vi sinh vật sinh enzyme protease: • Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số chủng thuộc chi Clostridium • Nấm sinh protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti, có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát. • Xạ khuẩn: một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus 35 3.2. SẢN XUẤT ENZYME Nguồn thu nhận enzyme cellulase: • Động vật: dịch tiết dạ bò, nhóm thân mềm, • Thực vật: trong ngủ cốc nảy mầm như lúa mì, yến mạch, • Vi sinh vật: vi khuẩn, nấm sợi, nấm men – Nấm sợi: Aspergilus niger, A. oryzae, A. candidus, – Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli, – Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacilllus subtilis, B. pumilis, 36 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Kháng sinh (Antibiotic) là gì? Những chất hóa học có tác động chống lại sự sống của VSV ở nồng độ thấp, ức chế hoặc tiêu diệt VSV bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa hoặc thay đổi cân bằng lý hóa của VSV mà vẫn an toàn cho người và vật nuôi. 37 • Lịch sử – Cuối TK 19 tại Anh, các mẫu bánh mì mốc được dùng để chữa vết thương – 1928, Alexander Flemming (BV Saint Mary, London) phát hiện nấm tiết ra chất có tác dụng diệt khuẩn • Nấm Penicillium notatum • Chất có tác dụng diệt khuẩn : penicillin 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH 38 • Lịch sử – 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey (ĐH Oxford) bắt đầu nghiên cứu tác dụng điều trị của penicillin – 25/5/1940 thử nghiệm thành công trên chuột. Edward Abraham nghiên cứu điều chế penicillin tinh chất – 1942 triển khai công nghệ lên men chìm sản xuất penicillin G 39 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH 40 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự thành lập vách tế bào – Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào – Ức chế sự tổng hợp protein – Ức chế sự tổng hợp acid nucleic 41 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự thành lập vách tế bào • VK G (+) biến thành dạng hình cầu không có vách (proto-plast) • VK G (-) có vách không hoàn chỉnh (spheroplast) •  tế bào dễ vỡ ở môi trường có trương lực bình thường 42 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự thành lập vách tế bào. Ks thuộc nhóm này: Bacitracin, Cephalosporin, Cycloserine Penicillin, Rostocetin, Vancomycin 43 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào • Mất sự toàn vẹn của màng tế bào  đại phân tử và ion thoát ra khỏi tế bào  tế bào chết • Màng tế bào VK và vi nấm dễ bị phá hủy bởi một số tác nhân 44 Imidazole làm suy yếu sự toàn vẹn của màng tế bào vi nấm bằng cách ức chế sự tổng hợp lipid Polymycins tác động lên VK Gr (-) Polyenes tác động lên vi nấm Colistin 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự tổng hợp protein Tetracyclines • Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosome ngăn chặn các amino acid mới gắn vào chuỗi peptid mới được thành lập 45 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự tổng hợp protein Aminoglycosides : Streptomycin – GĐ 1: thuốc gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30S – GĐ 2 : phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên trong quá trình thành lập chuỗi peptid – GĐ 3 : thông tin mRNA bị đọc sai  1 acid amin không phù hợp – GĐ 4 : làm vỡ các polysomes thành monosomes  không có chức năng tổng hợp protein 46 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự tổng hợp protein Chloramphenicol – Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosome  ức chế peptidyltransferase  ngăn các amino acid mới gắn vào chuỗi peptid mới thành lập 47 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự tổng hợp protein Macrolides – Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 50S ribosome ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi peptid Lincomycins – Cơ chế giống nhóm Macrolides 48 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự tổng hợp acid nucleic Actinomycin – Thuốc gắn vào DNA tạo nên một phức hợp  ức chế polymerase  ngăn sự tổng hợp RNA (mRNA) Mitomycin – Thuốc gắn vào 2 chuỗi DNA ngăn 2 chuỗi tách rời ra  không sao chép được 49 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự tổng hợp acid nucleic Rifampin – Thuốc gắn vào polymerase  ức chế tổng hợp RNA Nalidixic acid – Phong tỏa DNA gyrase  ức chế tổng hợp DNA 50 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cơ chế tác động – Ức chế sự tổng hợp acid nucleic Sulfonamides – PABA là một tiền chất để tổng hợp acid folic  tổng hợp acid nucleic – Sulfonamides có cấu trúc tương tự PABA  cạnh tranh  tạo những chất tương tự acid folic nhưng không có chức năng  cản trở sự phát triển của VK 51 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Biểu diễn nồng độ kháng sinh – mg/ml, ug/ml, UI/ml, UI/g • Xác định nồng độ kháng sinh gây ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn – MIC, MBC 52 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Cách xác định MIC, MBC 53 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Điều chỉnh tổng hợp chất KS – Tuyển chọn và tạo chủng công nghiệp siêu sản xuất kháng sinh: • Tuyển chọn quy mô PTN: đặc tính sinh lý, sinh hóa, động học phát triển, động học quá trình tạo sản phẩm, nguồn cơ chất, điều kiện lên men, các công nghệ thu sản phẩm • Tuyển chọn quy mô sản xuất thử và sản xuất công nghiệp: chủng phù hợp với trang thiết bị, nguồn nguyên liệu sẵn có, trình độ công nghệ và năng lực vận hành 54 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Điều chỉnh tổng hợp chất KS – Tuyển chọn và tạo chủng công nghiệp siêu sản xuất kháng sinh: • Việc chọn chủng tốn nhiều thời gian, nhân lực và đòi hỏi phải tiến hành nghiêm túc, lâu dài • Một số chủng vsv sản xuất kháng sinh: 55 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Điều chỉnh tổng hợp chất KS – Tối ưu hóa thành phần môi trường, thiết bị lên men, điều kiện vận hành: • Nguồn C: các loại bột, cám, vỏ khoai tây, rỉ đường, • Nguồn N: bột đậu nành, cao nấm men,. • Khoáng đa lượng: P, S, Mg,Fe, Ca, K, Na • Khoáng vi lượng • Chất cảm ứng, chất phá bọt, chất kìm hãm, chất định hướng, 56 3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Điều chỉnh tổng hợp chất KS – Tối ưu hóa thành phần môi trường, thiết bị lên men, điều kiện vận hành: • Nhiệt độ, • pH • Nồng độ oxy • Thế oxy-hóa khử • Cường độ sục khí • Cường độ khuấy trộn 57 SẢN XUẤT PENICILLIN 58 SẢN XUẤT PENICILLIN 59 SẢN XUẤT PENICILLIN 60 SẢN XUẤT PENICILLIN 61 heat_sterilization SẢN XUẤT PENICILLIN 62 Fermenters Chủng vsv vào nồi lên men SẢN XUẤT PENICILLIN 63 SẢN XUẤT PENICILLIN 64 Rotary_vacuum_filter To remove biomass SẢN XUẤT PENICILLIN 65 disk_centrifuge SẢN XUẤT PENICILLIN • Batch_extraction Penicillin được hòa tan trong phosphate buffer, sau đó là chloroform, hòa lại trong phosphate buffer và cuối cùng là ether (ê-te). Sau đó, được trộn với sodium bicarbonate để thu penicillin dạng muối Na có thể bảo quản lâu ở nhiệt độ phòng. 66 Ôn tập • Vì sao cần sản xuất aa quy mô công nghiệp? • So sánh các phương pháp sản xuất aa. • Aa thiết yếu là gì? Aa giới hạn là gì? • Nhận biết aa dạng L, D, học các chữ viết tắt của 20 loại aa. • Cho ví dụ ứng dụng của 3 loại aa trong thực phẩm hay trong thức ăn vật nuôi. • Vẽ quy trình sản xuất vsv sinh aa từ giống bảo quản ban đầu. 67 Ôn tập • Nêu được các loại vsv có khả năng sản xuất aa, enzyme, kháng sinh cho nhu cầu con người? • Nêu ưu điểm của việc sản xuất enzyme từ vsv. • Giải thích các cách thu nhận enzyme từ dịch nuôi cấy vsv. • Định nghĩa kháng sinh. Liệt kê các cơ chế tác động của kháng sinh. • Nêu cách thu nhận penicillin tinh khiết từ dịch nuôi cấy mốc Penicillum • MIC, MBC là gì? 68