Sinh hoá miễn dịch

huyết thanh chứa kháng thể ñặc hiệu kháng nguyên ñược gọi là kháng huyết thanh. 4.1. Bản chất và tính chất của kháng thể Trong huyết thanh của người và ñộng vật có vú chứa albumin, α, β và γ- globulin thì γ- globulin là kháng thể vì vậy kháng thể có bản chất protein và bị biến tính bởi các tác nhân hóa học, hóa lý và sinh học. Hoạt tính kháng thể phụ thuộc pH, nhiệt ñộ môi trường và nhiều yếu tố khác. Các muối (NH4)2SO4, Na2SO4, cồn Ở 5 0C làm kết tủa kháng thể nhưng không làm mất ñi những ñặc tính của nó. Nhờ tính chất này mà người ta có thể tinh khiết kháng thể. Hai ñặc tính sinh học quan trọng của kháng thể là: + Có khả năng phản ứng ñặc hiệu với kháng nguyên, thể hiện qua các phản ứng sau: - Phản ứng kết tủa. - Phản ứng ngưng kết. - Phản ứng phát quang. - Phản ứng ñánh dấu phóng xạ. + Khả năng biểu hiện như một kháng nguyên. Tức là kích thích tạo ra kháng thể chống lại chính nó. Chống lại Ig (IgA, IgG, IgM, IgA, IgD) hay từng mảnh của phân tử Ig (mảnh Fab hoặc Fc). Kháng thể chống lại kháng thể gọi là kháng kháng thể. Cơ sở của các phương pháp xét nghiệm dựa trên miễn dịch là tính ñặc hiệu của kháng thể nhận biết kháng nguyên và ái lực của kháng thể khi nhận biết kháng nguyên. Ái lực của kháng thể ñối với kháng nguyên sẽ quyết ñịnh nồng ñộ kháng nguyên kháng thể tối thiểu cần cho phản ứng kháng nguyên kháng thể. Tính ñặc hiệu thể hiện ở khả năng nhận biết ñược một mẫu có hay không có kháng nguyên và khả năng phân biệt một kháng nguyên nhất ñịnh hay một nhóm kháng nguyên. Tính ñặc hiệu của kháng nguyên phụ thuộc chủ yếu vào chất dùng ñể gây miễn dịch. Cấu trúc hoá học của cộng hợp haptenp-protein quyết ñịnh tính ñặc hiệu của kháng thể thu ñược. Tuỳ thuộc vào yêu cầu mà người ta tạo ra những kháng thể chỉ có khả năng nhận biết một chất nhất ñịnh hoặc một nhóm chất có cấu trúc tương tự nhau. 4.2. Cấu trúc của kháng thể miễn dịch 4.2.1.Cấu tạo chung của kháng thể miễn dịch Nhờ công trình nghiên cứu của Porter và Eldelmen ñã xác ñịnh ñược cấu trúc của monomer kháng thể. Tất cả các dạng kháng thể ñều có cấu tạo giống nhau, do một hay nhiều ñơn vị monome tạo thành. ðơn vị cơ bản cửa phân tử kháng thể gồm 4 chuỗi polypeptit hai chuỗi nặng có trọng lương phân tử lớn (2H) và hai chuỗi nhẹ có phân tử lượng thấp (2L) nối nhau bằng liên kết cộng hoá trị (S- S) và liên kết không công hoá trị. Mô hình cấu trúc cơ bản của phân tử Ig miễn dịch gồm 4 chuỗi ñối xứng nhau, trong ñó hai chuỗi nặng, hai chuỗi nhẹ nối với nhau bới cầu nối disulful. Trình tự acid amin giống hệt nhau theo từng ñôi chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Hình 4.1: Cấu trúc của kháng thể miễn dịch -S-S- -S-S- -s-s- -s-s- COOH COOH NH2 NH2 V ù ng cố ñị n h Vùng biến ñổi Phần Fc C h uỗ i nặ ng C h uỗ i n hẹ P hầ n F ab Vùng bản lề Vị trí kết hợp kháng nguyên Vị trí kết hợp kháng nguyên 4.2.2. Chuỗi nhẹ Trọng lượng phân tử 25.000Da chứa 211- 221 acid amin. Tất cả các lớp globulin miễn dịch ñều có 2 loại chuỗi nhẹ κ hay λ Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc 2 chuỗi nhẹ κ hoặc 2 chuỗi λ mà không bao giờ chứa cả hai Mỗi chuỗi nhẹ Ig chứa vùng acid amin: vùng có trật tự acid amin thay ñổi VL(variable) nằm ở phía ñầu -NH2-của phân tử. Vùng còn lại trật tự acid amin không thay ñổi CL (constant) vùng này nằm sát ñầu –COOH (hình 4.1) Trật tự acid amin vùng cố ñịnh của chuỗi nhẹ giống nhau ở các lớp kháng thể, còn vùng biến ñổi luôn khác nhau kể cả ở lớp Ig do cùng một tế bào sinh ra. 4.2.3. Chuỗi nặng Trọng lượng phân tử 50.000Da, chứa 450 acid amin, có 5 loại chuỗi nặng γ, µ, α, δ, ε ứng với 5 lớp kháng thể là IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Như thế mỗi lớp kháng thể có 1 chuỗi nặng riêng và 2 chuỗi nhẹ chung. Do vậy: Lớp IgG:ñược ký hiệu như sau γ2 κ2 hoặc γ2 λ2 Lớp IgM:ñược ký hiệu như sau µ2 κ2 hoặc µ2 λ2 Lớp IgA:ñược ký hiệu như sau α2 κ2 hoặc α 2 λ2 Lớp IgD:ñược ký hiệu như sau δ2 κ2 hoặc δ2 λ2 LgE:ñược ký hiệu như sau ε2 κ2 hoặc ε2 λ2 Chuỗi nặng gồm 4 vùng acid amin, 1 vùng biến ñổi và 3 vùng cố ñịnh. Hai vùng biến ñổi VL và VH nằm kề nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên (paratop). Vùng giũa CL1 và CL2 gọi là khớp nối tạo cho Ig có hình chữa Y. Vùng này có thể ñiều chỉnh và tạo ra một góc từ 0 ñến 180 o ñể phù hợp với việc gắn kháng nguyên. ðây là nơi dễ tác ñộng của enzyme 4.2.4. Vùng gấp khúc Cầu nối disulfua vừa nối 2 chuỗi polypeptit lại với nhau tạo thành phân tử kháng thể, vừa nối các acid amin nằm xa nhau trong 1 chuỗi ñể tạo ra những gấp khúc xoắn cuộn. (hình 4.2b) Chuỗi nhẹ có 2 xoắn cuộn còn chuỗi nặng có 4 xoắn cuộn. Chức năng các vùng gấp khúc là hợp tác với nhau tạo nên bề mặt là vị trí gắn kháng nguyên. Tuỳ thuộc vào việc sử lí với các enzym khác nhau mà ta thu các mảnh khác nhau. Dưới tác dụng của enzyme papain cắt IgG làm 3 mảnh mảnh (hình 4.2a). - Hình 4.2a: Cấu tạo vùng gấp khúc của Ig miễn dịch Phần liên kết với kháng nguyên Phần liên kết với kháng nguyên Chuỗi nhẹ Chuỗi nặng Phần biến ñổi Phần cố ñịnh Hình 4.2b: Cấu tạo vùng gấp khúc của Ig miễn dịch. - 2 mảnh Fab (Fragment antigen binding) gồm 1 chuỗi nhẹ và nửa chuỗi nặng ở phần ñầu amin) chịu tách nhiệm kết hợp với kháng nguyên. - Mảnh Fc (Fragment cri stalizable) phần còn lại của 2 chuỗi nặng. Mảnh Fc có tính ñặc hiệu với kháng nguyên khi nó tác dụng như một kháng nguyên và có khả năng gắn với ñại thực bào, hoặc tế bào B hoặc gắn với bố thể. 4.2.5. Chuỗi J - Là một chuỗi glucopolypeptit. - Kích thước gần bằng chuỗi nhẹ. - Trọng lượng phân tử 15.000 Da. .- Thành phần chuỗi J chứa nhiều xystein. Nhiệm vụ: Nối các monome globulin miễn dịch thành phân tử lớn. Ví dụ: Trong phân tử IgM chuỗi J nối các phân tử IgM lại với nhau thành ngôi sao 5 cánh. Trong phân tử IgA tiết, Chuỗi J nối 2 mảnh Fc lại với nhau thông qua cầu nối disulfua. 4.3. Các lớp Ig miễn dịch Có 5 lớp globulin miễn dịch mang tên chuỗi nặng là Lớp IgG, Lớp IgM, Lớp IgA, Lớp IgD và Lớp IgE 4.3.1. Lớp IgG (γ2 κ2 hoặc γ2 λ2) Cấu tạo Là globulin miễn dịch chủ yếu, chiếm 80 ñến 85% tổng số Ig trong huyết thanh, là phân tử monome có trọng lượng phân tử 160.000 Da, hằng số lắng 6S chiếm 2,5% hydratcarbon. Cấu trúc của phân tử IgG thường thay ñổi, nhưng ở dạng tự do có như hình chữ Y Ở người bình thường nồng ñộ IgG trong huyết thanh là 1200mg/100ml. Còn thông thường nó chiến khoảng 800 ñến 1680 mg/100ml . Nó là kháng thể quan trọng nhất ở người. Nó là kháng thể vi khuẩn, kháng thể kết tủa, chất ngưng kết máu, chất tan máu. Dựa vào sự khác biệt về số lượng và vị trí gắn của cầu nối disunfua, người ta chia IgG ra làm 4 phân lớp: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Trong huyết thanh người bình thường IgG1 nhiều nhất và IgG4 là ít nhất. ðặc tính sinh học: Là kháng thể duy nhất truyền từ mẹ sang con qua nhau thai và tự tổng hợp sau khi sinh vài tháng. IgG ñảm nhiệm nhiều chức năng: Opsonin hóa: Fc gắn với thụ trên bề mặt của ñại thực bào và Fab gắn với quyết ñịnh kháng nguyên tạo ñiều kiện cho ñại thực bào bắt giữ và dung giải kháng nguyên. Hoạt hóa bố thể trừ IgG4, theo con ñường cổ ñiển dẫn ñến làm tan tế bào ñích. Gây ñộc qua trung gian tế bào phụ thộc kháng thể: phần Fab gắn với tế bào ñích, phần Fc gắn với tế bào K và hút tế bào ñích cho tế bào K và tiết ra lymphokin tiêu diệt tế bào ñích. Trung hòa ñộc tố như uốn ván, nọc ong. Gây ngưng kết tế bào vi khuẩn và trung hòa virus. 4.3.2. Lớp IgM (µ2 κ2 hoặc µ2 λ2) Hình 4.3: Cấu trúc kháng thể IgM Cấu tạo. Chiếm 5-10% tổng Ig, trọng lượng phân tử 900.000Da, hằng số lắng 16S, chứa10% C/H Nồng ñộng thấp, ở người bình thường có nồng ñộ 125mg/100ml Cấu tạo hình 5 cánh, nhờ cầu nối disunfua và chuỗi J IgM có 10 vị trí kết hợp kháng nguyên nên có hoạt tính mạnh hơn IgG từ 60 ñén 180 lần IgM xuất hiện sớm khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể. Chức năng sinh học IgM Hoạt hóa bố thể: IgM có khả năng hoạt hóa bố thể mạnh vì luôn có 2 mảnh Fc nằm kề nhau gắn với bố thể, thực hiện quá trình làm tan vi khuẩn. Ngưng kết hồng cầu cùng loài Ngưng kết vi khuẩn: IgM ñáp ứng với polysaccarit vỏ nhày của nhiều loại vi khuẩn, nên ñược dùng ñể chống loại vi khuẩn này. IgM cũng có khả năng gắn với lông của vi khuẩn và cũng có khả năng ngưng kết chúng. IgM dạng ñơn có trên bề mặt tế bào B làm nhiệm vụ như thụ thể giành cho kháng nguyên. Trong máu của ñông vật IgM tồn tại ở dạng monome, tetrame, haxame 4.3.3. Lớp IgA: (ε2 κ2 hoặc ε2 λ2) Cấu tạo. Gồm 2 chuỗi nhẹ; κ, λ và 2 chuỗi nặng α, trọng lượng phân tử từ 140.000 - 300.000 Da, hằng số lắng là 7S, bao gồm IgA huyết thanh và IgA tiết IgA huyết thanh chiếm 15-20% tổng IgA. Ở người tồn tại dang monome, ở ñộng vật ở dạng dime. IgA tiết dạng dime có trong sữa, nước bọt, nước tiết phế quản... Hai phân tử gắn với nhau ở mảnh Fc nhờ chuỗi J hoặc mảnh tiết Hoạt tính sinh học: IgA huyết thanh có thời gian sống ngắn (6 ngày) và hoạt hóa bố thể IgA tiết chống vi khuẩn trên bề măt niêm mạc, chống kháng nguyên nhóm máu A,B Hình 4.4: Cấu trúc kháng thể IgA 4.3.4. LỚP IgD và IgE Lớp IgD:(δ2 κ2 hoặc δ2 λ2) Trong huyết thanh có nồng ñộ thấp từ 0,4- 40 mg/100ml , chiếm 0,2- 1% Ig, hàm lượng H/C cao. Mẫn cảm với enzyme phân giải protein Chức năng chưa biết ñến, nhưng nó có mặt trong tế bào B làm nhiệm vụ thụ thể cho kháng nguyên. Lớp IgE (ε2 κ2 hoặc ε2 λ2) Trong lượng phân tử 180.000, hằng số lắng 7S, nồng ñộ thấp nhưng tăng nhanh khi bị dị ứng hoặc bị nhiễm kí sinh trùng Chức năng sinh học thể hiện rõ trong quá mẫn tức thì. Phần Fc gắn với thụ thể bạch cầu ưa kiềm. Khi kháng nguyên xuất hiện gắn với Fab khích thích tế bào trên tiết các chất từ trong bọng như histamin, serotonin làm dãn mạch và tăng tính thấm thành mạch. 4.5.Cơ chế hình thành kháng thể miễn dịch Chuỗi J Chuỗi nặng α Chuỗi nhẹ Như chúng ta ñã biết, khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, chúng sẽ gặp phải hàng loạt cơ chế bảo vệ không ñặc hiệu của ñáp ứng miễn dịch tự nhiên, với mục ñích tiêu diệt và loại trừ chúng ra khỏi cơ thể. Nếu kháng nguyên vượt khỏi hàng rào bảo vệ tự nhiên, và ñủ thời gian, chúng sẽ gặp phải cơ chế bảo vệ ñặc hiệu của ñáp ứng miễn dịch thu ñược. Như vậy nhiều trường hợp ñáp ứng miễn dịch tự nhiên có tác dụng mở ñầu cho ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu, hoặc ngược lại, ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu xuất hiện làm tăng cường ñáp ứng miễn dịch tự nhiên. Ở chương 1 chúng ta ñã làm quen với ñáp ứng miễn dịch tự nhiên. Trong phần này chúng ta ñề cập ñến ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu, trong ñó vấn ñề mấu chốt là cơ chế hình thành kháng thể miễn dịch. Việc cơ thể tạo ra kháng thể khi có sự kích thích của kháng nguyên là một quá trình phức tạp, dưới sự tham gia của nhiều tế bào và phải có mối tương tác của các phân tử hoạt ñộng bề mặt của các tế bào khác nhau. 4.5.1.Cách tiếp cận kháng nguyên Kháng thể xuất hiện như thế nào khi có kháng nguyên? Kháng nguyên sau khi vào cơ thể, chúng ñi tới lách và hạch nhờ máu và bạch huyết, ñây là thời kỳ tiềm ẩn và chưa xuất hiện kháng thể. Sau ñó kháng thể xuất hiện tăng rồi lại giảm. Phản ứng với kháng nguyên lần ñầu gọi là ñáp ứng miễn dịch nguyên phát. Khi kháng nguyên vào lần thứ 2 (tiếp cận kháng nguyên lần 2) nồng ñộ kháng thể tăng nhanh gấp từ 10 ñến 100 lần so vơí lần tiếp cận kháng nguyên lần ñầu (thời kỳ thứ phát) Kháng thể giảm dần theo thời gian, nếu tiếp cận kháng nguyên lần tiếp theo quá trình lại ñược lặp lại. 4.5.2. Sự hợp tác của tế bào B, T, ñại thực bào và cơ chế hình thành kháng thể miễn dịch ðể hình thành kháng thể miễn dịch thì các tế bào T, B, ñại thực bào phải hợp tác nhịp nhàng với nhau. Quá trình hình thành kháng thể miễn dịch xảy ra như sau (hình 4.5) Giai ñoạn chế biến kháng nguyên bởi APC. ðại thực bào và tế bào B thông qua thụ thể (BCR là các kháng thể bề mặt của tế bào B) bắt giữ nuốt và chế biến kháng nguyên thành những peptit sau ñó ñược ñưa ra bề mặt gắn với phức hợp kháng nguyên - MHC lớp II. Giai ñoạn trình diện kháng nguyên Kháng nguyên ñược ñại thực bào hoặc tế bào lympho B (có hiện tượng thực bào) trình diện. Kháng nguyên sau ñã chế biến kết hợp với MHC lớp II ñi ra bề mặt tế bào ñể trình diện tế bào T thông qua thụ thể TCR của tế bào lympho T. Như vậy phần tử MHC -II trên bề mặt APC sẽ tương tác với CD4 trên bề mặt của tế boà TH. Giai ñoạn sinh kháng thể. Do ñược tiếp xúc thông qua kháng nguyên, tế bào TH lại phát tín hiệu cho tế bào B và kích thích tế bào B sản ra interluekin. Chất này lại kích thích tế bào B tăng sinh ñể tạo hai dòng tế bào. Dòng tế bào B trí nhớ và dòng tế bào plasma sinh kháng thể. - Dòng tế bào B trí nhớ là dòng tế bào ñáp ứng miễn dịch thứ phát, dẫn ñến việc sán xuất kháng thể kịp thời, nhanh chóng với một số lượng lón khi có sự kích thích lặp lại của kháng nguyên. - Tế bào plasma có ñời sống ngắn khoảng dưới một tuần, nhưng chúng lại tiết ra một lượng lớn kháng thể. Trrên ñây là một vài những nguyên tắc cơ bản của sự tạo thành kháng thể miễn dịch. Mỗi một quyết ñịnh kháng nguyên thông qua hoạt ñông của APC và tế bào T sẽ kích thích cho sự phát triển của một dòng tế bào B nhất ñịnh. Trong mỗi trường hợp, mỗi tế bào B ñược tạo thành là một khả năng di truyền sản xuất kháng thể, ñể phản ứng với kháng nguyên ñã kích thích sinh ra nó. Bằng cách như vậy, mỗi một cơ thể ñông vật có thể ñáp ứng với hàng tỷ kháng nguyên khác nhau nhờ sự phát triển dòng tế bào B ñặc hiệu phù hợp với nó. Hình 4.5: Sơ ñồ hình thành kháng thể miễn dịch 4.6. Kháng thể ñơn dòng ðịnh nghĩa: kháng thể ñơn dòng là kháng thể do một dòng tế bào B sinh ra ñể chống lại quyết ñịnh một kháng nguyên. 4.6.1. Cách tạo kháng thể ñơn dòng Dung hợp tế bào. Trước ñây ñể sản xuất kháng thể ñơn dòng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào invitro. Năm1975 Milstein và Kohler ñã ñưa ra kỹ thuật sản xuất kháng thể ñơn dòng dựa trên nguyên tắc lai tế bào u tủy với tế bào lympho B hoạt hóa . Tế bào lai có cả hai ưu ñiểm vừa phân bào liên tục trong ñiều kiện nuôi cấy ñồng thời lại có khả năng tổng hợp kháng thể, từ ñó kháng thể sản xuất ra với khối lượng lớn.. Việc phát hiện ra kỹ thuật sản xuất kháng thể ñơn dòng ñánh giá là thành tựu lớn, tạo ra cuộc cách mạng trong miễn dịch học Cách tạo kháng thể ñõn dòng (hình 4.6) Tế bàoB Tế bào u tuỷ xương Tế bào lai Dung hợp Hình 4.6: Cách tạo kháng thể ñơn dòng KT ñơn dòng - Lai tế bào u tủy và tế bào lympho B - Pha loãng cho ñến khi mỗi ống chỉ nhận 1.106 tế bào - Nuôi tế bào trong dung dịch HAT (Hypoxantin aminopterin- tmidin) ta ñược kháng thể ñơn dòng Ngày nay người ta chọn một loại tế bào có khả năng sinh kháng thể ñó là tế bào lách của chuột nhắt ñã ñược miễn dịch chống lại một kháng nguyên nhất ñịnh. Ta tiến hành lai giữa tế bào lách chuột nhắt với tế bào u tuỷ xương. Tế bào lai ñem nuôi cấy sẽ phân chia liên tục và sản ra một lượng lớn kháng thể ñơn dòng. 4.6.2. Ứng dụng của kháng thể ñơn dòng Phát hiện kháng nguyên chưa biết trên bề mặt tế báo. Nhờ kỹ thuật ELSA , người ta sử dụng kháng thể ñơn dòng ñể phát hiện kháng nguyên tương ứng. Bằng kháng thể ñơn dòng ñã nhanh chóng ñã nhanh chóng thay thế phương pháp miễn dịch học và huyết thanh học truyền thống trong các xét nghiệm như: - Xác ñịnh mức hoocmon ñể ñánh giá chức năng nội tiết. - Phát hiện một số protein trong chẩn ñoán ung thư. - Dùng trong ñịnh loại vi sinh vật gây bệnh. - Phát hiện loại thuốc cấm sử dụng trong máu (dopinh) Dùng chẩn ñoán bệnh truyền nhiễm, bệnh di truyền, bệnh miễn dịch, bệnh lao, bệnh phong. Ức chế phản ứng thải loại trong gép cơ quan, bằng cách dùng kháng thể ñơn dòng chống lại kháng nguyên ñặc hiệu của tế bào lypmphoT. Miễn dịch hóa thụ ñộng chống kháng nguyên tham gia vào quá trình sinh sản như tránh thai bằng phương pháp miễn dịch.