Phát hiện đột biến DNA ti thể trong bệnh lý thần kinh thị giác di truyền leber bằng kỹ thuật giải trình tự gen

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Mắt 81 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DNA TI THỂ TRONG BỆNH LÝ THẦN KINH THỊ GIÁC DI TRUYỀN LEBER BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Hoàng Hiếu Ngọc*, Phạm Hùng Vân**, Huỳnh Viết Lộc** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER là một rối loạn di truyền ti thể gây mất thị lực hoàn toàn mà không gây đau. Bệnh do những đột biến điểm trong DNA ti thể làm thay đổi protein thuộc chuỗi vận chuyển điện tử thuộc ti thể. Mục tiêu: Phát hiện các điểm đột biến trong DNA ti thể thường gặp như G11778A, T14484C, G3460A trong DNA ti thể của người bằng cách giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. Phương pháp: DNA của những bệnh nhân bị giảm hoặc mất thị lực hoàn toàn được tách chiết từ mẫu máu toàn phần. Sau đó, dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại từng vùng gen có chứa các điểm đột biến thường gặp. Sản phẩm khuếch đại sau đó được giải trình tự trực tiếp bằng bộ kit BigDye®Terminator. Phân tích kết quả giải trình tự bằng cách so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn để phát hiện điểm đột biến. Kết quả: Từ tháng 08/2011 đến tháng 12/2012 chúng tôi thu thập được 37 ca nghi ngờ bệnh LHON. Trong đó phát hiện được 18 trường hợp có đột biến DNA ti thể, 14 trường hợp mang đột biến G11778A là đột biến nặng và thường gặp nhất, 8 trường hợp còn lại mang đột biến T14484C. Kết luận: Bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến DNA ti thể trong bệnh LHON; đồng thời mở ra một hướng nghiên cứu mới đối với các bệnh di truyền theo DNA ti thể. Từ khóa: bệnh Lebel, đột biến DNA ti thể, LHON, PCR ABSTRACT DETECT MUTATION IN MITOCHONDRIAL DNA IN PATIENTS WITH LEBER’S HEREDITARY OPTIC NEUROPATHY BY GENE SEQUENCING Hoang Hieu Ngoc, Pham Hung Van, Huynh Viet Loc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 - 2014: 81 - 85 Background: Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is a mitochondrial inherited disorder that causes completely loss vision without pain in healthy adults. This disease caused by point mutations in human mitochondrial DNA that lead to change protein in the electron transfer chain of the mitochondria. Objective: Detecting highly prevalent mutation points such as G11778A, T14484C, G3460A in human mitochondrial DNA by direct sequencing PCR products. Method: Patients’ DNA were extracted from whole blood samples and then perform PCR reactions of which primers designed to amplify DNA fragments that include mitochondrial point mutations. Amplified products will be sequenced directly by using BigDye®Terminator kit. Analyse results to detect point mutations of patients. Result: From 08/2011 to 12/2012, we have 37 patients who loss vision without pain. There are 18 cases which have point mutations; 14 cases have severe point mutation of G11778A and the last four cases have point * Bộ môn Hoá Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM , ** Công ty Nam Khoa Tác giả liên lạc: ThS. BS. Hoàng Hiếu Ngọc ĐT: 0988937406 Email: hoanghieungoc@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt 82 mutation of T14484C. Conclusion: By using PCR and gene sequencing, we build up the examination to detect point mutations in LHON successfully. Since, we open up the new trend of research mitochondrial inherited disorders in Vietnam. Keywords: Lebel, mutations in mitochondrial DNA, LHON, PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER được xác định về mặt lâm sàng là do teo thần kinh thị giác gây mất thị lực trung tâm(7). Bệnh thường xuất hiện ở nam trong độ tuổi 20 – 40(7,8) nhưng cũng có thể xuất hiện ở độ tuổi từ 5 đến 65(8,2). Triệu chứng bệnh thường gặp là mất thị lực trung tâm cấp hoặc bán cấp ở người trẻ đôi khi các triệu chứng về thần kinh, tim mạch và cơ xương cũng đi kèm. Nam giới mắc bệnh chiếm đến hơn 80% các trường hợp bệnh(2). Nguyên nhân gây bệnh được xác định là do đột biến DNA của ti thể thuộc các vùng gen ND (mitochondrial encoded NADH dehydrogenase genes) là mtND1, mtND2, mtND3, mtND4, mtND4L, mtND5, mtND6 gây thay đổi các protein thuộc phức hợp I của chuỗi hô hấp tế bào(9). Các nghiên cứu về bệnh LHON trên thế giới cho thấy 95% các ca bệnh đều mang một trong ba điểm đột biến G11778A, T14484C, G3460A; trong đó G11778A chiếm tỉ lệ cao nhất và bệnh nhân mang đột biến này sẽ có khả năng tiến triển bệnh rất nặng và không hồi phục. Cả 3 điểm đột biến này đều có liên quan đến các gen ND mã hóa protein cho phức hợp(4). Nhiều nghiên cứu dịch tễ về bệnh LHON trên thế giới đã cho thấy tỉ lệ bệnh LHON là rất khác nhau tùy dân số chẳng hạn ở Phần Lan là 1:50,000(2) trong khi ở Anh là 1:25,000(4). Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu khảo sát tỉ lệ bệnh LHON trong dân số và các kỹ thuật sinh học phân tử vẫn chưa được triển khai để nghiên cứu về căn bệnh này. Chính vì vậy, chúng tôi xây dựng đề tài này với mục đích phát hiện đột biến DNA ti thể gây mất thị lực do teo thần kinh thị đồng thời cung cấp cho các bác sĩ lâm sàng Việt Nam có được một công cụ chẩn đoán bệnh LHON nói riêng và các bệnh di truyền ti thể nói chung một cách chính xác và nhanh chóng; từ đó mở ra thêm những hướng nghiên cứu mới về bệnh di truyền tại Việt Nam. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu bệnh phẩm Mẫu máu toàn phần chống đông bằng EDTA của những bệnh nhân nghi ngờ bệnh LHON hoặc cần được chẩn đoán phân biệt với các bệnh gây xơ hóa võng mạc khác. Trích biệt DNA bạch cầu từ máu toàn phần chống đông bằng EDTA Chúng tôi sử dụng bộ tách chiết DNA bằng kit thương mại QIAGEN DNA Blood Mini kit. Phương pháp tách chiết DNA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lấy 200 µl máu toàn phần cho vào 1 tube Eppendorf, lần lượt cho vào tube 20 µl proteinase K và 200 µl AL buffer. Lắc trộn mẫu thật kỹ trong 15 giây, sau đó đem ủ ở 560C trong 10 phút. Thêm vào 200 µl ethanol 100%, lắc trộn thật đều rồi cho toàn bộ hỗn hợp vào cột silica được cung cấp của hãng Qiagen. Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, đổ bỏ dịch lọc và tube thu thập, giữ lại cột. Đặt cột vào tube thu thập mới, rửa cột lần thứ nhất bằng cách cho 500 µl dung dịch rửa 1 có bổ sung ethanol 100% (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) vào cột và ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, đổ bỏ dịch rửa và tube thu thập, giữ lại cột, đặt vào một tube thu thập mới. Rửa cột lần thứ nhì với 500 µl dung dịch rửa 2 cũng có bổ sung ethanol 100% (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và ly tâm 14000 rpm trong 3 phút. Đổ bỏ dịch rửa 2 cùng với tube thu thập. Đặt cột vào một tube thu thập khác, quay ly tâm 14000 rpm trong 1 phút để làm khô cột. Cuối cùng, đặt cột vào một tube Eppendorf tinh sạch, cho 200 µl dung dịch thoi DNA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, ly tâm 14000 rpm trong 2 phút. Dịch cuối cùng thu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Mắt 83 được chính là DNA bạch cầu được hòa tan trong đệm thoi DNA, có thể dùng để thực hiện phản ứng PCR. Khuếch đại các đoạn gen trong DNA ti thể có chứa vị trí đột biến Chúng tôi sử dụng các loại hóa chất sau: (1) PCR master mix 2X của công ty Nam Khoa (được pha sẵn từ những nguồn nguyên liệu mua từ các hãng BioRad, Merck, Sigma, Proligo); (2) MgCl2 50mM do BioRad sản xuất; (3) UNG của Invitrogen; (4) dUTP của Promega; (5) Các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu trên các vùng gen có chứa điểm đột biến của ti thể lần lượt là 3460F/R phát hiện đột biến G3460A (gen MT-ND1), 11778F/R phát hiện đột biến G11778A (gen MT-ND4), 10663F/R phát hiện đột biến T10663C (gen MT-ND4L), 14484F/R phát hiện đột biến T14484C (gen MT-ND6), 9804F/R phát hiện đột biến G9804A, 15257F/R phát hiện đột biến G15257A. Như vậy, với từng mẫu bệnh phẩm, chúng tôi thực hiện 6 phản ứng PCR. Sản phẩm khuếch đại lần lượt có kích thước như sau: 417 bp, 297 bp, 410 bp, 210 bp, 470 bp, 250 bp. Phương pháp khuếch đại DNA được thực hiện trong những tube PCR 0.2 ml với thể tích dung dịch phản ứng là 50 µl bao gồm 2.5U Taq Polymerase, 3,5mM MgCl2, 50 µM mồi xuôi, 50 µM mồi ngược, UNG 0.1U, dNTP 25mM, dUTP 20mM. Phản ứng được thực hiện trong máy luân nhiệt MyCycler của BioRad có buồng ủ nhiệt 96 giếng với chu kỳ nhiệt như sau: 1 chu kỳ 40oC trong 10 phút, 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút, 40 chu kỳ 950C 30 giây – 55oC 30 giây – 72oC 1 phút, 1 chu kỳ 72oC 10 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện trên gel agarose 2%. Giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại từ các vùng gen ti thể Sau khi xác định có sự hiện diện của các sản phẩm khuếch đại, chúng tôi thực hiện tinh sạch sản phẩm PCR bằng cách sử dụng enzym tinh sạch Exonuclease (IllustraTM) và Alkaline Phosphatase (IllustraTM). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được lấy ra 5 µl điện di gel agarose để kiểm tra sự hiện diện của băng DNA và sau đó xác định hàm lượng DNA bằng máy BioPhotometer của hãng Eppendorf. Sau đó, chúng tôi thực hiện phản ứng giải trình tự bằng cách sử dụng bộ thuốc thử của hãng ABI là BigDye®Terminator v3.1 Cycler Sequencing Kit với các mồi xuôi hoặc mồi ngược của chúng tôi thiết kế. Sản phẩm giải trình tự được làm tủa và tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol. Cuối cùng thực hiện điện di mao quản sản phẩm giải trình tự trên máy ABI3130XL. Kết quả giải trình tự sau đó sẽ được so sánh với trình tự DNA chuẩn của ti thể đã được công bố trên ngân hàng gen NBCI ( hoặc trang web www.mitomap.org từ đó phát hiện ra điểm đột biến trên gen ti thể của bệnh nhân bằng phần mềm SeqScape của hãng ABI. KẾT QUẢ Trong thời gian từ tháng 08/2011 đến tháng 12/2012, chúng tôi thu thập được 37 mẫu máu bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh LHON hoặc cần chẩn đoán phân biệt bệnh LHON với các bệnh gây xơ hóa võng mạc khác. Hình 1: Kết quả điện di trên gel agarose 2% sản phẩm PCR khuếch đại 6 vùng gen ti thể có chứa các điểm đột biến tương ứng. (A) là đoạn khuếch đại chứa vị trí nucleotid 3460, (B) chứa vị trí 9804, (C) chứa vị trí 10663, (D) chứa vị trí 11778, (E) chứa vị trí Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt 84 14484, (F) chứa vị trí 15257 (A) (B) Hình 2: Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn của người. (A) mẫu giải trình tự có điểm đột biến T14484C. (B) mẫu giải trình tự có điểm đột biến G11778A. Sau khi ly trích DNA bạch cầu từ những mẫu máu toàn phần, nồng độ DNA tách chiết đo được nằm trong khoảng 30 – 60 ng/µl với độ tinh sạch OD 260/280 từ 1.8 đến 2. Nồng độ và độ tinh sạch như trên đảm bảo cho phản ứng PCR được thực hiện tốt. Những sản phẩm PCR này sau đó được tiến hành giải trình tự trên hệ thống ABI 3130XL. Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự DNA chuẩn của ti thể bằng phần mềm SeqScape của hãng ABI. Khảo sát trên 37 mẫu máu của bệnh nhân nghi ngờ bệnh LHON, chúng tôi nhận thấy có 18 trường hợp mang đột biến. Trong đó, 14 mẫu mang đột biến G11778A và 4 trường hợp còn lại mang đột biến T14484C. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Mắt 85 KẾT LUẬN Kỹ thuật sinh học sinh tử nói chung và kỹ thuật giải trình tự nói riêng giờ đây trở thành một công cụ hữu ích trong việc chẩn đoán xác định các bệnh lý di truyền nói chung và bệnh ty thể nói riêng, trong có đó bệnh di truyền thần kinh thị giác Leber. Bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến DNA ti thể trong bệnh LHON. Điều này sẽ giúp ích rất nhiều cho các bác sĩ lâm sàng ở Việt Nam trong việc chẩn đoán bệnh LHON, đồng thời bệnh nhân không phải tốn công ra nước ngoài để làm xét nghiệm này. Ưu điểm của kỹ thuật giải trình tự là có thể khảo sát toàn bộ trình tự trong một vùng gen mong muốn, từ đó so sánh với trình tự gen chuẩn để tìm ra điểm đột biến. Đây là một lợi thế so với việc dùng men cắt giới hạn vốn dĩ có thể gây sai sót nếu xuất hiện đột biến nằm ngoài vị trí cần tìm làm thay đổi khả năng cắt hoặc không cắt của men cắt tại vị trí đột biến. Trong số 18 trường hợp phát hiện đột biến (48,7%), 14 ca mang đột biến tại điểm G11778A là điểm đột biến chiếm tỉ lệ cao nhất trong bệnh LHON (77,78%) và khi bệnh mắt đã tiến triển thì khả năng hồi phục là rất thấp. Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy tỉ lệ mang đột biến này chiếm đa số và phù hợp với y văn trên thế giới. Chính vì thế, cùng với việc xây dựng thành công kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán bệnh LHON, chúng tôi cũng rất mong muốn mở ra một nghiên cứu lớn hơn nhằm tầm soát bệnh LHON trong dân số Việt Nam đồng thời tư vấn di truyền cho những người mang gen bệnh để định hướng nghề nghiệp cũng như chế độ ăn uống nhằm hạn chế sự phát triển của bệnh trong tương lai. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hsu TK, Wang AG, Yen MY, Liu JH (2013). “Leber's hereditary optic neuropathy masquerading as optic neuritis with spontaneous visual recovery”. Clin Exp Optom. doi: 10.1111/cxo.12100. 2. Huoponen K (2001). “Leber hereditary optic neuropathy: clinical and molecular genetic findings”. Neurogenetics 3: 119 – 125. 3. Istikharah R, et al (2013).”Identification of the variants in PARL, the nuclear modifier gene, responsible for the expression of LHON patients in Thailand”. Exp Eye Res. 116: 55-57. 4. Johns DR et al (1993). “Pitfalls in the molecular genetic diagnosis of Leber’s hereditary optic neuropathy. Am”. J. Hum. Genet, 53: 916 – 920. 5. Mackey DA, Oostra RJ, Rosenberg T, et al (1996). “Primary pathogenic mtDNA mutations in multigeneration pedigrees with Leber hereditary optic neuropathy”. Am J Hum Genet; 59:481 – 485. 6. Man PY, Turnbull DM, Chinnery PF (2002). “Leber hereditary optic neuropathy”. J Med Genet; 39:162 – 169. 7. Oostra RJ, et al (1993). “Mitochondrial DNA analysis as a diagnostic tool in singleton cases of Leber’s hereditary optic neuropathy”. Ophthalmic Paediatrics and Genetic, Vol. 14, No3, pp. 109 – 115. 8. Oostra RJ, et al (1994). “Leber’s hereditary optic neuropathy: correlations between mitochondrial genotype and visual outcome”. J Med Genet; 31: 280 – 286. 9. Spruijt L (2008). Leber’s hereditary optic neuropathy – an interaction between two genomes. Maastricht University, Netherlands. 10. Ziccardi L, Sadun F, et al (2013). “Retinal function and neural conduction along the visual pathways in affected and unaffected carriers with Leber's hereditary optic neuropathy”. Invest Ophthalmol Vis Sci.2013. Ngày nhận bài báo:01/11/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo:26/11/2013 Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014