Nguyên tắc và ứng dụng

TS. BS Đỗ Thị Thanh Thủy PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG MỤC TIÊU BÀI GIẢNG 1. Trình bày được nguyên tắc PCR 2. Trình bày được cách chống ngoại nhiễm trong PCR 3. Trình bày được ứng dụng của PCR  Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation)  1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science”  Đạt Nobel Prize hóa học 1993  Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase, thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao. PCR POLYMERASE CHAIN REACTION PCR POLYMERASE CHAIN REACTION PCR NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG 35-40 chu kì nhiệt Amplicon Số copies = 2n.y n: Số cycle y: số copies ban đầu 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 Denaturation Annealing Extension T e m p e ra tu re ( ° C ) Time (minutes) Lập lại ≥ 30 lần (chu kỳ) Biến tính 92-96oC Bắt cặp 45-55 o C Kéo dài 72oC PCR POLYMERASE CHAIN REACTION GĐ BIẾN TÍNH (92-96oC) DNA đích 95oC 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ GĐ BẮT CẶP (45-55oC) ~55oC 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ A B Primers A B GĐ KÉO DÀI (72oC) 72oC 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ Taq polymerase 72oC 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ Cycle 1 MỘT CHU KỲ NHIỆT Giai đoạn biến tính (92-96oC) Giai đoạn bắt cặp (45-55oC) Giai đoạn kéo dài (72oC) PCR POLYMERASE CHAIN REACTION ĐỘNG HỌC CỦA PCR THÀNH PHẦN TRONG PCR DNA đích 5’ 3’ 3’ 5’ primers A B Nucleotide tự do Taq DNA polymerase Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Dd đệm chứa magnesium NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR 1. DNA đích (đoạn DNA quan tâm) Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp, tóc, phết niêm mạc má, phết cổ tử cung), [C]  1 µg (0,1-1 µg) Đoạn DNA 1kb đến 10kb (thường <1 kb) 2. Mồi (primers) đoạn đơn DNA thường có 18-22 nucleotide, bổ xung với đoạn DNA đích. 5’-ACT TTC ACC AGC GTT TCT GG-3’ Mồi xuôi, mồi ngược (F, R). Tm (Melting Temperature): 52-58 °C Tm= 4 x (số C + số G) + 2 x (số A + số T)°C %GC: 40% đến 60% Ta: Tm - 5 °C [C]: 0.1-0.5µM PCR MIX 5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC------- TCCTGTGCA TTTCGCCACTAGAG-3’ 3’-TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG------- AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC-5’ 5’-ATTCCGATCGCTAATCGATG-3’ 3’-CACGTAAAGCGGTGATCTC-5’ Tm=11x2+9x4=58 o C Tm=9x2+10x4=58 o C 3. DNA polymerase: enzym chịu nhiệt, xúc tác tổng hợp sợi DNA mới, kỹ thuật đơn giản, đặc hiệu. [C]: 1-2.5 units Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích - Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt: Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent) - Tổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp như Ampli Taq, Vent (exo). - Tổng hợp men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3-5 exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu. NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR 4. dNTP (deoxy ribonucleotid): dATP, dGTP, dCTP, dTTP [C]: 20-200µM 5. Ion Mg++ - cofactor của enzyme MgCl2: 1.5 mM (0.75-4 mM) 6. Dung dịch đệm pH 8.3-8.8 NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR 1. Máy luân nhiệt (THERMOCYCLER) (I) Thổi liên tục những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt vào buồng ủ, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạnh (LightCycler – Roche). (II) Dựa theo hiệu ứng Peltier ngược. Hai thanh kim loại nối với hai cực của nguồn điện và được điều chỉnh tự động để chiều dòng điện đi qua có thể thay đổi: bên này nóng, bên kia lạnh. Khi thay đổi chiều dòng điện thì nhiệt độ của hai thanh cũng thay đổi ngược lại: bên này lạnh, bên kia nóng THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR MÁY LUÂN NHIỆT CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH PCR 1. Khuếch đại DNA đích 2. Phát hiện sản phẩm PCR (amplicon) PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR Điện di trên gel agarose (submarine agarose gel electrophoresis) phân loại DNA dựa vào kích thước 1. Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương, đoạn DNA có kích thước ngắn di chuyển nhanh hơn so với đoạn có kích thước lớn. 2. Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan sát dưới đèn UV Chuẩn bị gel agarose Chuẩn bị mẫu điện di : – Ống DNA cần điện di (chứa 1 hoặc nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau) – Ống chứa thước đo (ladder, marker) – Ống chứa dd đệm có màu (loading buffer) . – Chất phát quang (EtBr, SYBR G,) PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR Loading buffer  Theo dõi sự di chuyển của các đoạn DNA  Glycerol/buffer giúp kéo các đoạn DNA lắng xuống đáy giếng. PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR Chụp hình gel (đèn UV) PCR  Nhiễm chéo từ mẫu sang mẫu  Mẫu [-] thành [+]  PCR carry-over (nhiễm từ amplicon)  Mẫu [-] thành [+] vì nhiễm amplicon (sản phẩm PCR)  Hiểm họa NGOẠI NHIỄM TRONG PCR UDG (Uracyl DNAse Glycosylase) dUTP PCR MIX PCR mix chứa hệ thống chống ngoại nhiễm CHỐNG NGOẠI NHIỄM • Phòng pre-PCR và post-PCR tách biệt • Chiếu tia UV khu vực làm việc. • Vệ sinh khu làm việc bằng isopropanol hay dd tẩy 10%. 1 2 PCR luôn khởi đầu 40oC x 10min CHỐNG NGOẠI NHIỄM UDG (Uracyl DNAse Glycosylase) dUTP PCR MIX hệ thống chống ngoại nhiễm PCR mix chứa dUTP and UDG 40oC for 10min Amplicon chứa U DNA đích chứa T U bị UDG cắt bỏ DNA đích chứa T PCR mix chứa dUTP và UDG DNA đích chứa THYMINE Amplicon, T thay thế U nick DNA đích không bị UNG tác động PCR mix chứa dUTP and UDG 30X-40X 94oC/30s-1min 55-60oC/30s-1min 72oC/30s-1min UDG bị bất hoạt do To cao trong PCR Amplicon T thay thế U CHỐNG NGOẠI NHIỄM CÁC LOẠI PCR 1. RT-PCR 2. One-step RT-PCR 3. Two-step RT-PCR 4. Multiplex PCR 5. Nested PCR, hemi-nested PCR 6. Non-stop nested PCR 7. Touch-down PCR RT-PCR RNA cDNA DNA for analysis Reverse Transcription RTase PCR DNA polymerase Avian myeloblastosis virus (AMV) Moloney murine leukemia virus (M-MLV) RT SỬ DỤNG MỒI ĐẶC HIỆU RNA RT (37o C - 40o C/1h) Reverse transcriptase dNTP Buffer and MnCl 2 PCR (30 - 40 thermal cycles) cDNA RNA cDNA - Reverse transcriptase - dNTP - Buffer and MnCl 2 RT (37o C - 40o C/1h) RT SỬ DỤNG MỒI ĐẶC HIỆU RNA RT (37o C - 40o C/1h) Reverse transcriptase dNTP Buffer and MnCl 2 PCR (30 - 40 cycles) cDNA RT SỬ DỤNG RANDOM PRIMER CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG PCR 1. Nhiệt độ biến tính và thời gian 2. Nhiệt độ bắt cặp và thiết kế đoạn mồi 3. Độ dài của đoạn mồi 4. Nhiệt độ giai đoạn kéo dài và thời gian 5. Số chu kỳ thực hiện CHÚ Ý TRONG PCR Khi thực hiện PCR 1. Chứng âm (Negative control) Không cho DNA (thay bằng nước cất) Mục đích: Phân biệt có ngoại nhiễm hay không 2. Chứng dương (Positive control) Có một lượng DNA đã biết trong phản ứng Mục đích: Đảm bảo phản ứng tốt ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC 1. Phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây bệnh 2. Chẩn đoán và nghiên cứu các bệnh lí di truyền 3. Chẩn đoán và nghiên cứu một số bệnh ung thư 4. Pháp y, quan hệ huyết thống ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC 1. Sản xuất thuốc 2. Sản xuất vaccin PCR PHÁT HIỆN TÁC NHÂN VSV GÂY BỆNH Bệnh phẩm Chuẩn bị mẫu Ly trích acid nucleic acid PCR Phát hiện sản phẩm PCR - Tác nhân không thể nuôi cấy thường qui - Tác nhân virus (HBV, HCV, SXH) - Tác nhân vi khuẩn (Chlamydia, Legionella,) - Tác nhân VK nuôi cấy chậm (M. tuberculosis) - Tác nhân VK nuôi cấy thất bại (số lượng ít, hay đã bị điều trị KS trước đó) ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC Sản xuất Insulin Yếu tố di truyền ngoài chromosomal One cell with the recombinant plasmid A fermentor used to grow recombinant bacteria. ỨNG DỤNG PCR TRONG PHÁP Y, QUAN HỆ HUYẾT THỐNG Short Tandem Repeats (STR) Các trình tự lập lại ngắn từ 2-5 bp, dùng để phân biệt DNA profile của từng người . Sự đa hình trong STR thể hiện số copy của các đoạn lặp lại khác nhau trong quần thể. Ex: locus TH01 có 6 trình tự lập lại “TCAT”. CCC TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT AAA - Có hơn 20 alleles chứa TH01 được biết. - Mỗi người được hưởng 1 allele từ cha hay mẹ 7 repeats 8 repeats TCAT (14) (12) (11) (9) (8) (7) (6) (5) (4) (3) (13) (10) TH01 alleles Allele ladder Mother Father Child C Child D Child E