NGUYÊN LÍ KỸTHUẬT GEN

Chuyên đề công nghệ sinh học ---------------------------------------------------Phạm Việt Hà Cao Học K18 -------------------------------------------------- Trang ---------------------------------------------------------- 1 II . NGUYÊN LÍ KỸ THUẬT GEN 1. Các bước chủ yếu của kỹ thuật gen Kỹ thuật gen gồm nhều giai đoạn nhằm biến đổi cấu trúc gen, tạo gen mới, đưa các gen tái tổ hợp vào tế bào chủ để thu nhận các prôtêin tái tổ hợp, hoặc nghiên cứu cấu trúc bộ gen, lập bản đồ gen. Kỹ thuật gen gồm các bước cơ bản sau: a. Chuẩn bị gen cần tách dòng Gen cần tách dòng (đoạn ADN insert), có thể được chuẩn bị bằng phương pháp tách chiết (ADN, ARN) từ sinh vật mang nguồn gen tự nhiên hoặc tổng hợp nhân tạo. Tách chiết (ADN, ARN) từ sinh vật mang nguồn gen tự nhiên; tách chiết plasmid từ vi khuẩn. Tinh sạch và chọn lọc để thu được các gen cần tách dòng. Sử dụng kỹ thuật nhân gen PCR để nhân gen cần thiết lên một số lượng lớn các bản sao, đảm bảo một lượng ADN (ARN) cần thiết. Tổng hợp đoạn ADN nhân tạo trên cơ sở đã biết các trình tự đặc hiệu ( hoặc trình tự axitamin trong chuỗi polipeppit). Dùng kỹ thuật tổng hợp nhân tạo đoạn oligonuclêotit mạch đơn và nhân gen PCR để tạo số lượng các đoạn ADN nhân tạo đủ lớn. b. Tạo vectơ tái tổ hợp Dựa vào đặc điểm của gen cần tách dòng để lựa chọn loại vectơ và enzim giới hạn phù hợp. Gồm + Cắt ADN của tế bào cho chứa gen cần chuyển và ADN của plasmid cùng một loại enzim cắt giới hạn, enzim này sẽ cắt hai mạch đơn của phân tử ADN ở vị trí nuclêôtit xác định (trình tự nhận biết) tạo ra các đầu dính có trình tự nuclêôtit bổ sung. + Trộn ADN của tế bào cho với ADN plasmid đã cắt hở, các đầu dính bắt cặp bổ sung với nhau nhờ enzim nối ligaza tạo liên kết photphođieste làm liền mạch ADN. Plasmid mang gen lạ gọi là ADN tái tổ hợp. Hình . Sơ đồ các bước chủ yếu của kỹ thuật gen Chuyên đề công nghệ sinh học ---------------------------------------------------Phạm Việt Hà Cao Học K18 -------------------------------------------------- Trang ---------------------------------------------------------- 2 c. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ Sử dụng các phương pháp biến nạp khác nhau ( sốc nhiệt, xung điện, bắn gen…) để đưa các vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ. Tạo môi trường thích hợp để vectơ tái tổ hợp tồn tại và được nhân lên cùng tế bào chủ. d. Sàng lọc các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp Sàng lọc dòng tái tổ hợp là quá trình kiểm tra chọn lọc và tách riêng các dòng tái tổ hợp có hoạt tính. e. Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm tế bào tái tổ hợp được nuôi trong các bình lên men, với điều kiện thích hợp về dinh dưỡng, nhiệt độ, độ pH…để các tế bào tăng sinh khối nhanh, tạo các sản phẩm prôtêin tái tổ hợp ở mức cao nhất. Thực hiện công nghệ tách chiết prôtêin tái tổ hợp, tinh sạch thu chế phẩm. 2. Nguyên tắc chọn vectơ tách dòng Chọn vectơ tách dòng thích hợp có vai trò quyết định sự thành công trong tách dòng gen. Để đảm bảo tách dònh gen thành công, khi chọn vectơ tách dòng cần chú ý nguyên tắc sau: +Dựa vào kích thước và bản chất đoạn ADN cần tách dòng làm căn cứ chọn vectơ. - Nếu ADN cài có nguồn gốc từ gen cuả sinh vật nhân sơ vectơ tách dòng có thể chọn là plasmid, phage, cosmid… - Nếu ADN cài có nguồn gốc từ gen cuả sinh vật nhân thực vectơ tách dòng có thể chọn là, phage, nhiễm sắ thể nhân tạo nấm men… + Sự tương đồng các vị trí đặc hiệu của các enzim giới hạn giữa đoạn cài ADN và vectơ tách dòng. Nghĩa là, đoạn cài ADN và vectơ tách dòng phải có các vị trí cắt đặc hiệu của cùng một loại enzim giới hạn. + Vectơ tách dòng phải thích hợp với loại tế bào chủ, có khả năng tái bản trong tế bào chủ, tạo số lượng bản sao lớn ( 50bản/1tế bào), nhưng không gây ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào chủ. +Gen chỉ thị trong vectơ tách dòng càng dễ nhận biết càng tốt để dễ dàng chọn lọc các vectơ tái tổ hợp. Các điểm cắt của enzim giới hạn thường nằm trong các gen chỉ thị, giúp cho sự nhận biết và sàng lọc dễ dàng. + Vectơ tách dòng phải có hiệu quả tách dòng cao, tạo nên tỉ lệ vectơ tái tổ hợp cao. 3. Nguyên tắc tạo vectơ tái tổ hợp Tạo vectơ tái tổ hợp là thực hiện kỹ thuật gắn nối gen cần tách dòng vào vectơ tách dòng. Tạo vectơ tái tổ hợp thực hiện theo các bước sau : + Chuẩn bị nguyên liệu : Gen cần tách dòng (ADN insert) tinh sạch cần được nhân lên bằng PCR ( 20- 25 chu kỳ) tạo một hàm lượng cần thiết sản phẩm PCR. Vectơ tách dòng thích hợp nhw pBR 322, pUC 18… + Thực hiện phản ứng nối gen cần tách dòng với vectơ : chuẩn bị thành phần phản ứng phù hợp với mỗi loại vectơ tách dòng. Ví dụ : vectơ tách dòng là pUC 18 hỗn hợp phản ứng gồm : 1,0 µl đệm phản ứng ; 0,5µl ATP 10 mM ; 1,0 µl enzym T4 ADN ligase ; 1,0 µl vectơpUC 18 ; 5,0 µl sản phẩm PCR tách dòng ; 1,5 µl H2O. Chuyên đề công nghệ sinh học ---------------------------------------------------Phạm Việt Hà Cao Học K18 -------------------------------------------------- Trang ---------------------------------------------------------- 3 + Hỗn hợp các thành phần phản ứng được ủ qua đêm ở nhiệt độ 160C. Sau đó, tiến hành điện di với thang ADN chuẩn để kiểm tra kết quả tạo vectơ tái tổ hợp. Vectơ tái tổ hơph đã tạo được cần giữ trong tủ lạnh sâu ở -800C đến -850C để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo. 4. Một số kỹ thuật biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ Biến nạp vectơ tái tổ hợp và tế bào vật chủ được thực hiện bằng nhiều kỹ thuật khác nhau : bắn gen, vi tiêm, xung điện, sốc nhiệt, sử dụng PEG… 4.1. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E. coli bằng kỹ thuật sốc nhiệt a. Chuẩn bị tế bào khả biến Tế bào E.coli (LE 392, MC 1061, BL 21…) được nuôi cấy trên môi trường thạch LB (5% cao nấm men, 10% trypton, 10% NaCl). Lấy 1 khuẩn lạc E. coli vào 5ml môi trường LB lỏng , nuôi ở 370C, lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 12- 16 giời. Lấy 1ml dịch VK + 99ml môi trường LB nuôi lắc 2-3 giờ, khi OD600 đạt 0,4 -0,6 lấy dịch nuôi cấy để lên đá trong 1,0 - 1,5 giờ, sau đó li tâm lạnh thu cặn tế bào ở tốc độ 4500 - 5000 vòng trong 8-10 phút. Hoà cặn tế bào trong 100ml CaCl2 100mM lạnh, để trên khay đá 15 phút rồi li tâm lạnh thu cặn tế bào. Cặn tế bào hoà trong 40 ml CaCl2 100mM lạnh, để 1 giờ trên đá, sau đó li tâm thu cặn tế bào với tốc độ trong 4000 vòng trong 10 phút, thêm 500 µl CaCl2 100mM lạnh, có chứa 15% glycerol vào cặn tế bào thu được các tế bào khả biến. Lấy vào mỗi ống eppendorf 50 µl tế bào khả biến, giữ trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ -750C đến -800C để thực hiện biến nạp. b. Kỹ thuật biến nạp Lấy 50 µl tế bào khả biến đang giữ trong ống eppendorf ở nhiệt độ -750C đến -800C để trên đá khoảng 15 phút, sau đó thêm 0,5 ng ADN đaot nhẹ ống 3-4 lần và để trên đá khoảng 15-20 phút. Lấy mẫu đặt vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 420C trong 2 phút, đặt nhanh trên đá 2 phút. Sau đó thêm khoảng 1000 µl môi trường LB lạnh, nuôi trong 370C ở máy lắc trong 30-60 phút. Lấy 100 µl dịch tế bào đã sốc nhiệt, trải lên hộp Petri môi trường LB 2% agarose có bổ sung ampicilin với nồng độ 50 µg/ml, IPTG và X-gal. Ủ hộp petriở 370C trong 12- 16 giờ, kiẻm tra các khuẩn lạc phát triển trên hộp petri. Thu nhận khuẩn trắng, cấy vào trong môi trường lỏng để kiểm tra kết quả. Biến nạp E.coli bằng kỹ thuật sốc nhiệt có hiệu quả khoảng 1/10000. sàng lọc các tế bào mang vectơ tái tổ hợp, chuyển sang ống thạch nghiêng để giữ chủng giống. 4.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện a. Chuẩn bị tế bào Cấy 1 khuẩn lạc nấm men vào 5 ml môi trường YPD ( 1% cao nấm men, 2% pepton, 2% glucose), nuôi ở 280C với tốc độ lắc 250 vòng/ phút trong 1 ngày đêm. Lấy 30 µl dung dịch nuooi cấy vào 100 ml YPD, lắc 16-18 giờ, đo OD600 để xác định mật độ tế bào (OD =1,3 - 1,5). Để mẫu trên đá 5-10 phút, li tâm với tốc độ 4500 - 5000 vòng trong 5 phút, lấy cặn tế bào hoà trong 100ml nước khử ion lạnh, li tâm thu cặn tế bào. Hoà tế bào trong 20 ml sorbitol 1M, li tâm 4500 vòng trong 5 phút thu cặn tế bào. Hoà cặn tế bào với 0,2 ml sorbitol, chia đều mỗi ống eppendorf 50 µl dịch tế bào khả biến giữ trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ -750C đến -800C. b. Kỹ thuật xung điện Lấy 50 µl dịch tế bào khả biến trong ống eppendorf giữ trong tủ lạnh sâu thêm vào 10- 15 µg ADN plasmid tái tổ hợp, trộn đều và chuyển vào cuvet xung điện 0,2 cm. Thực hiện xung điện 0,25 µF, 200 , 1,5 kV trong 4-5 phần nghìn giây. Bổ sung 1 ml sorbitol 1M lạnh, Chuyên đề công nghệ sinh học ---------------------------------------------------Phạm Việt Hà Cao Học K18 -------------------------------------------------- Trang ---------------------------------------------------------- 4 đảo đều chuyển sang ống mới, cấy lên môi trường thạch đĩa để kiểm tra kết quả biến nạp. Hiệu quả biến nạp bằng xung điện tương đối cao (khoảng 1%). 5. Kỹ thuật chọn lọc các dòng tế bào tái tổ hợp Dòng tế bào tái tổ hợp là dòng các tế bào mang vectơ tái tổ hợp, được nuôi ở môi trường thích hợp tạo thành các khuẩn lạc. Phương pháp chọn lọc tế bào tái tổ hợp theo nhiều kỹ thuật khác nhau : 5.1. Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng chỉ thị kháng sinh Đây là phương pháp đơn giản và dễ sử dụng. Do hiệu quả biến nạp thường rất thấp, vì vậy sau khi biến nạp cần phải chọn lọc đúng các tế bào mang vectơ tái tổ hợp. Dựa vào gen kháng chất kháng sinh trong vectơ tái tổ hợp, chuẩn bị môi trường dinh dưỡng có bổ sung chất kháng sinh tương ứng để nuôi cấy các tế bào sau biến nạp. Trong môi trường có chất kháng sinh, các tế bào chứa vectơ tái tổ hợp có gen kháng chất kháng sinh tồn tại và phát triển được, những tế bào không có vectơ tái tổ hợp không phát triển được. Phương pháp dùng chỉ thị kháng sinh thường có hiệu quả không cao, do 1 số tế bào không mang vectơ tái tổ hợp nhưng do xuất hiện các đột biến kháng chất kháng sinh, nên vẫn có thể phát triển được. Để đảm bảo hiệu quả sàng lọc chuẩn xác, thường kết hợp sử dụng chỉ thị hai loại kháng sinh, hoặc đồng thời sử dụng gen chỉ thị kháng sinh cùng với gen chỉ thị màu, chỉ thị enzym... 5.2. Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng gen chỉ thị màu Sử dụng gen chỉ thị màu kết hợp với gen chỉ thị khánh sinh là phương phápchọn lọc dòng tái tổ hợp có hiệu quả cao. Trong kỹ thuật sàng lọc thể tái tổ hợp ở tế bào vi khuẩn, gen LacZ kết hợp với IPTG và X- gal làm gen chỉ tị màu được sử dụng tương đối phổ biến, dễ nhận biết dòng tái tổ hợp nhờ màu sắc khuẩn lạc. Gen LacZ mã hoá enzym β- galactosidase của vi khuẩn E.coli có chất cảm ứng IPTG (isopropyl thiogalactoside- chất đồng đẳng của lactose) β- galactosidase được tổng hợp trong tế bào E.coli. Nếu môi trường có mặt X-gal (5-bromo -4-cloro-3-indolyl - β-D- galactopyranoside), enzym β- galactosidase có khả năng thuỷ phân X-gal từ 1 hợp chất không màu thành màu xanh. Do đó ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn sau khi biến nạp có bổ sung thêm một ít X-gal và chất cảm ứng IPTG, các tế bào vi khuẩn có gen LacZ nguyên vẹn (không tạo ADN tái tổ hợp) tổng hợp enzym β- galactosidase thuỷ phân X-gal các tế bào này phát triển thành khuẩn lạc có màu xanh. Nếu gen cài ADN được xen vào giữa gen LacZ (vectơ tái tổ hợp) làm cho gen LacZ mất hoạt tính, enzym β- galactosidase không được tổng hợp, tế bào vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc có màu trắng . Lựa chọn các khuẩn lạc có màu trắng cấy truyền vào môi trường dinh dưỡng có thạchthu được dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp. 5.3. Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng phương pháp lai phân tử Đây là phương pháp chọn lọc dòng tái tổ hợp có độ chính xác cao, nhưng phức tạp và tốn kém, phải có thiết bị chuyên dùng…Phương pháp lai axit nuclêic (ADN, ARN)với mẫu dò đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang (mẫu dò là các đoạn oligo nuclêôtit được đánh dấu phóng xạ, hoặc huỳnh quang). Các bước thực hiện gồm : +Sau khi biến nạp các tế bào vi khuẩn ( hoặc nấm men) được nuôi cấy từ hộp petri trên môi trường có 2% agar, để mỗi tế bào phát triển thành một khuẩn lạc. Đặt một màng lai lên trên hộp petri Chuyên đề công nghệ sinh học ---------------------------------------------------Phạm Việt Hà Cao Học K18 -------------------------------------------------- Trang ---------------------------------------------------------- 5 + Lấy màng lai đã in dấu các khuẩn lạc vi khuẩn sau biến nạp, đem lai phân tử với mẫu dò đámh dấu phóng xạ (hoặc huỳnh quang), mẫu dò phải có trình tự tương ứng với đoạn đặc hiệu của gen tái tổ hợp. + Ủ ở nhiệt độ thích hợp để tạo phản ứng lai. Rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không được lai và thực hiện kỹ thuật phóng xạ tự ghi. + Kết quả hiện hình phóng xạ cho thấy ở những vị trí có phản ứng lai sẽ có các chấm đen trên phim nhạy phóng xạ, hoặc các vết màu khi hiện hình huỳnh quang. Lựa chọn các khuẩn lạc ở các vị trí tương ứng trong hộp petri được các dòng tái tổ hợp. -