Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính bạch đàn và quy trình nhân nhanh invitro một số dòng bạch đàn ưu trội của vườn giống fortip vạn xuân phục vụ sản xuất

ác tổ chức hành chính sự nghiệp, các tổ chức sản xuất kinh doanh trực thuộc Bộ, Giám đốc các Sở Nông - Lâm nghiệp tỉnh chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./. 6 QUY PHẠM KỸ THUẬT XÂY DỰNG RỪNG GIỐNG VÀ VƯỜN GIỐNG (QPN 15-93) (Ban hành kèm theo Quyết định số 804-QĐ/KT ngày 2-11-1993) PHẦN MỘT CÁC VẤN ĐỀ CHUNG CHƯƠNG 1 ĐIỀU KHOẢN CHUNG Điều 1. Quy phạm này quy định những yêu cầu kỹ thuật xây dựng rừng giống và vườn giống từ khâu chọn xuất xứ cho đến khi bắt đầu thu hái hạt giống, nhằm cung cấp hạt giống có chất lượng được cải thiện (1). Điều 2. Các cơ sở trồng rừng giống và vườn giống phải tiến hành thiết kế, định rõ vị trí, diện tích từng lô, khoảnh cần trồng rừng giống và vườn giống, xác định các biện pháp kỹ thuật cụ thể cần thực hiện trong quá trình trồng rừng và vườn giống. Điều 3. Rừng giống và vườn giống phải được xây dựng theo những biện pháp kỹ thuật đặc biệt và đầu tư cao. Điều 4. Nghiêm cấm dùng nguồn hạt không rõ xuất xứ hoặc lấy từ xuất xứ không phù hợp, hoặc hạt xô bồ để xây dựng rừng giống. Nghiêm cấm dùng cây hom hoặc cây ghép từ cây mẹ không được chọn lọc để xây dựng vườn giống. Điều 5. Quy phạm này chỉ áp dụng cho việc trồng rừng giống từ cây hạt hoặc cây hom được chọn lọc hỗn hợp (2) và trồng vườn từ cây hạt, cây hom, cây ghép được chọn lọc theo dòng dõi (chọn cá thể) (3). CHƯƠNG 2 ĐIỀU KIỆN GÂY TRỒNG RỪNG GIỐNG VÀ VƯỜN GIỐNG Điều 6. Chỉ được gây trồng rừng và vườn giống ở những nơi có đủ các điều kiện sau đây: Điều kiện tự nhiên thuận lợi cho ra hoa, kết quả và có hạt chắc. Nơi chưa xẩy ra dịch bệnh và không bị lũ lụt làm ngập rừng và vườn giống (trừ các loại rừng trên đất ngập). Phải cách ly với các rừng trồng kinh tế có cùng loài cây với cự ly ít nhất là 150m. Đối với loài cây thụ phấn nhờ gió thì rừng giống và vườn giống có thể 7 nằm trên hướng gió chính trong mùa nở hoa mà không cần cách ly. Việc cách ly cũng có thể được thực hiện bằng cách tròng cây khác loài không có khả năng lai giống tự nhiên với cây trong rừng giống và vườn giống. Có điều kiện chăm sóc bảo vệ và thu hoạch quả thuận lợi. Điều 7. Diện tích tối thiểu cho rừng giống và vườn giống lấy hạt là 1 ha. Diện tích tối thiểu cho vườn giống lấy hom là 0,1 ha. CHƯƠNG 3 CHỌN XUẤT XƯ, CHỌN VÀ QUẢN LÝ CÂY MẸ Điều 8. Chọn xuất xứ: Vật liệu để gây trồng rừng giống (hạt, hom) phải được lấy từ xuất xứ tốt nhất đã được khảo nghiệm (có năng suất cao, chất lượng tốt, không bị sâu bệnh), phù hợp với điều kiện sinh trưởng của vùng gây trồng, có khả năng ra hoa kết hạt tại nơi gây trồng rừng giống. Hạt của những xuất xứ này có thể nhập từ nơi khác. Điều 9. Chọn cây mẹ lấy giống 1. Cây mẹ lấy giống để gây trồng rừng giống và vườn giống là những cây trội được chọn lọc trong các rừng trồng từ những xuất xứ tốt nhất đã được xác định, hoặc từ rừng tự nhiên nhằm mục đích lấy giống. 2. Số lượng cây mẹ cần thiết để lấy giống dùng cho xây dựng rừng giống tùy thuộc vào quy mô cải thiện giống, song ít nhất là 20 cây. 3. Tiêu chuẩn chung của cây trội là cây ở tuổi thành thục công nghệ, khoẻ mạnh, tán lá phát triển cân đối, không bị sâu bệnh, có sản phẩm theo mục đích kinh tế cao. 4. Tiêu chuẩn cụ thể phải căn cứ vào mục tiêu trồng rừng để lựa chọn. a) Đối với câu lấy gỗ: sinh trưởng nhanh, đoạn thân dưới cành dài, thân cây thẳng tròn đều, không xoắn vặn, cành nhánh nhỏ, góc phân cành lớn. b) Đối với cây lấy củi là sinh trưởng nhanh, nhiệt trị của gỗ lớn, nhiều gỗ, có khả năng nẩy chồi mạnh. c) Đối với cây lấy lá, lấy vỏ phải là cây sinh trưởng nhanh, có nhiều vỏ hoặc nhiều lá, hàm lượng các chất cần dùng trong vỏ hoặc trong lá cao. d) Đối với cây lấy quả phải là cây nhiều quả, quả to, tỷ lệ nhân nhiều và hàm lượng các chất cần thiết trong nhân cao. 8 e) Đối với cây lấy nhựa phải là cây nhiều nhựa. 5. Đánh giá cây trội: Các cây trội được lựa chọn ban đầu theo đặc điểm bên ngoài nói ở điểm 1 được coi là cây trội dự tuyển. Chỉ sau khi đã qua đánh giá mới được coi là cây trội chính thức để lấy vật liệu giống. Đối với rừng đều tuỏi thì cây trội là cây có chỉ tiêu chọn giống trực tiếp theo mục tiêu kinh tế vượt trị số trung bình của đám rừng hoặc của lâm phần ít nhất là 1,5-2 lần độ lệch chuẩn (tức x + 1,5 đến x + 2 hoặc x + 1,5Sx đến x + 2Sx)(4). Đối với rừng tự nhiên khác tuổi cây trội được đánh giá theo phương pháp quan sát. Chọn cây trội để xây dựng rừng giống thì yêu cầu các chỉ tiêu này có thể thấp hơn chọn cây trội để xây dựng vườn giống. Sau khi cây trội được đánh giá được gọi là cây trội chính thức. Vật liệu để xây dựng vườn giống và rừng giống phải được lấy từ cây trội chính thức. Điều 10. Quản lý cây trội (cây mẹ lấy giống). 1. Cây trội phải được ghi chép vào phiếu theo mẫu chung theo phụ lục 1. 2. Cây trội phải được đánh số theo một hệ thống chung trong các đơn vị kinh doanh. 3. Mỗi cây trội được sơn một vòng sơn tương phản với màu sắc của vỏ cây (đỏ, vàng hoặc trắng). Vòng sơn có chiều rộng 2cm, được sơn ở độ cao 1,5m. Phía dưới viết số hiệu cây trội theo cùng một hướng. 4. Những cây trội đã được hội đồng giống của ngành công nhận thì được đánh thêm một số vòng sơn như vòng sơn trước và đánh số phía trên theo một hệ thống chung trong từng tỉnh (theo loại cây). 5. Cây trội là một tài sản quốc gia. Phải có biện pháp bảo vệ đặc biệt. 9 PHẦN BA XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG CHƯƠNG 9 TẠO CÂY GHÉP Điều 35. Tiêu chuẩn cây để làm gốc ghép. Cây để làm gốc ghép phải là những cây còn ở tuổi vườn ươm sinh trưởng khỏe mạnh, không bị sâu bệnh, có đường kính phát triển để phù hợp với kích thước của cành ghép. Kỹ thuật tạo cây làm gốc ghép như kỹ thuật tạo và chăm sóc cây con. Điều 36. Cành ghép lấy từ các cây trội đã được chọn lọc và đánh giá hoặc được Hội đồng giống của ngành lâm nghiệp công nhận. Khi cắt khỏi cây mẹ cành ghép phải được cắt bớt phiến lá và được bảo quản trong điều kiện ẩm mát. Điều 37. Mùa ghép được xác định theo đặc điểm sinh học, vật hậu, yêu cầu sinh thái của cành ghép và theo diễn biến thời tiết khí hậu của từng vùng. Điều 38. Trước khi ghép phải tạo điều kiện cho cây làm gốc ghép sinh trưởng phát triển khỏe mạnh, phải bảo đảm cho đất có đủ độ ẩm cần thiết. Sau khi ghép phải có biện pháp che nắng và giữ ẩm cho cây ghép phát triển thuận lợi. Điều 39. Khi ghép mắt và ghép áp mà cành ghép chắc chắn đã liền sinh với gốc ghép cần cắt bỏ phần trên của gốc ghép cách chỗ ghép 10-12cm. Điều 40. Phải kịp thời cắt bỏ các chồi phụ mọc từ gốc ghép trong suốt quá trình sinh trưởng của cây ghép. Điều 41. Số cây ghép của mỗi dòng thay đổi tùy theo số dòng vô tính tham gia xây dựng vườn giống (ít nhất không dưới 20 dòng) và số lần lặp của chúng trong vườn giống. Khi số dòng vô tính trên cùng một diện tích vườn giống càng nhiều thì số cây ghép trong mỗi dòng càng ít. CHƯƠNG 10 TRỒNG, CHĂM SÓC VƯỜN GIỐNG VÀ THU HÁI QUẢ Điều 42. Trước khi trồng vườn giống phải thiết kế. Nội dung và các bước thiết kế tuân thủ các quy định tại phần 2 của quy phạm. Điều 43. Mật độ trồng vườn giống là mật độ cuối cùng (200 đến 400 cây/ha hoặc 200-400 cụm cây). Tùy theo phát triển tán của các loài cây mà thay đổi khoảng cách trồng là 5m x 5m, 6m x 6m hoặc 6m x 7m hoặc 7m x 7m. 10 Nguyên tắc chung là cây có tán lá nhỏ thì trồng mật độ cao, cây có tán lớn thì trồng mật độ thấp. Điều 44. Khi trồng bằng cây ghép (vườn giống vô tính) thì mỗi hố trồng một cây (theo mật độ cuối cùng). Khi trồng bằng cây hạt (vườn giống cây hạt) thì mỗi cụm 3 cây (trồng cách nhau 1m) được coi là một cụm cây. Khoảng cách giữa tâm các cụm cây là khoảng cách được tính theo mật độ cuối cùng. Điều 45. Bố trí cây trong vườn giống phải bảo đảm nguyên tắc các cây cùng dòng vô tính hoặc cùng một gia đình không được trồng cạnh nhau. Sơ đồ bố trí cây theo phụ lục 2. Điều 46. Việc lựa chọn sơ đồ bố trí cây cụ thể phải căn cứ vào yêu cầu cải thiện giống, trình độ cho phép của cán bộ kỹ thuật và công nhân trồng rừng tại cơ sở và phải được cấp có thẩm quyền phê duyệt. Điều 47. Cây trồng trong vườn giống được bố trí thành nhiều khối. Trong mỗi khối chỉ trồng một cây ghép của mỗi dòng vô tính hoặc một cụm cây của mỗi gia đình. Điều 48. Kích thước hố trồng ở vườn giống vô tính ít nhất là 60 x 60 x 60cm. Kích thước trồng ở vườn giống cây hạt như kích thước trồng ở rừng giống (xem Điều 22). Phải bón lót đủ lượng phân hữu cơ trước khi trồng và phải nhiều hơn so với trồng rừng sản xuất. Điều 49. Yêu cầu kỹ thuật trồng, thời vụ trồng, chăm sóc và bảo vệ cây trong vườn giống như yêu cầu cho rừng giống (xem phần 2). Điều 50. Tỉa thưa cho vườn giống cây hạt được thực hiện khi các cây trong cụm bắt đầu khép tán. Việc tỉa thưa được tiến hành từng bước cho đến khi chỉ còn lại một cây trong cụm. Cây giữ lại phải là cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất, đạt yêu cầu cao nhất về sản phẩm giống theo mục tiêu đặt ra. Phương pháp bài cây được thực hiện như tỉa rừng giống (xem chương VIII). Điều 51. Tỉa thưa di truyền vườn giống chỉ được thực hiện sau khi cây giống đã trưởng thành thể hiện đầy đủ các yêu cầu chọn giống hoặc có kết quả của khảo nghiệm hậu thế. Chỉ chặt tỉa những dòng vô tính hoặc những gia đình không đạt yêu cầu chọn giống hoặc cho hậu thế (đời sau) không đạt yêu cầu theo mục tiêu đề ra. Điều 52. Thu hái quả để cung cấp hạt cho trồng rừng sản xuất được tiến hành như thu hái quả ở rừng giống (xem Điều 35). 11 PHỤ LỤC 2 MỘT SỐ KIỂU SẮP XẾP CÂY CHỦ YẾU TRONG CÁC VƯỜN GIỐNG 1. Sắp xếp theo hàng có chuyển dịch là cách xắp xếp mà trật tự cây trong hàng không thay đổi, song trật tự cây giữa các hàng có thay đổi. Đây là cách sắp xếp đơn giản dễ thực hiện, song có hiện tượng tổ hợp lặp một phần có định kỳ. Vì vậy nên hạn chế sử dụng. Thí dụ (cho 20 dòng) Hàng 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ...20 Hàng 2 16 17 18 19 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hàng 3 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 2 3 Hàng 4 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14... 2. Sắp xếp theo khối hoán vị: Chuyển dịch bậc thang có hệ thống của các cây trong mỗi lần gặp để tránh lặp lại một trật tự cây trong khối. Đây là phương pháp được áp dụng ở Mỹ, Colombia, Canada, ưu điểm của cách sắp xếp này là dễ thực hiện, tránh được tổ hợp lặp định kỳ, song vẫn ít tạo được thụ phấn chéo ngẫu nhiên. Thí dụ 5 6 7 8 20 4 6 7 9 10 11 12 5 9 8 11 13 14 15 16 10 13 14 12 17 18 19 20 15 17 18 19 a) Khối xuất phát b) Khối lặp lại chuyển dịch bậc thang có hệ thống lần đầu. 3. Sắp xếp theo khối đảo nghịch là một sự biến đổi khác của việc dùng khối cặp đôi với sự nối tiếp đảo ngược của các dòng trong khối và sắp xếp ngẫu nhiên khác nhau cho mỗi cặp khối. Kiểu sắp xếp này chỉ phù hợp cho cây tự thụ phấn. Khi dùng cho cây thụ phấn chéo phải có biến đổi để tránh hai cây cùng dòng nằm cạnh nhau. Cách bố trí này được dùng cho cây Ulmus carpiniflolia ở Hà Lan. 12 7 11 4 3 2 1 8 7 12 3 6 12 5 7 10 8 6 4 10 5 5 12 6 9 5 5 9 1 11 2 4 11 7 6 8 10 7 2 11 1 3 10 8 1 1 2 3 5 10 4 2 9 9 2 11 4 12 3 12 7 8 1 8 10 3 12 4 11 6 9 9 6 Sắp xếp theo khối đảo nghịch 4. Sắp xếp theo khối cân bằng không đầy đủ: là cách sắp xếp mà vị trí các cây trong khối nhỏ và các khối nhỏ trong vườn giống có thể được ấn định ngẫu nhiên. Cách sắp xếp này cho phép sắp xếp ngẫu nhiên các dòng vô tính cũng như tạo khả năng so sánh tính chất của các dòng vô tính một cách hiện quả nhất. Đây là cách sắp xếp phù hợp với cây thụ phấn chéo, được dùng ở Đức. Ưu điểm của cách sắp xếp này là dự kiến được sự hoán vị của những cây cạnh nhau trong các khối nhỏ, là phương pháp thích hợp để so sánh các công thức sắp xếp cây trong vườn giống và nghiên cứu so sánh các dòng vô tính, thích hợp cho nghiên cứu khả năng tổng hợp riêng; song không thích hợp cho tỉa thưa có hệ thống. Thí dụ: Trường hợp có: 10 dòng vô tính mỗi khối nhỏ có 3cây 9 lần lặp 30 khối nhỏ (khối 3 cây) 13 1 2 3 2 4 10 3 8 9 2 3 1 10 6 5 10 8 1 1 2 4 2 5 8 3 9 10 5 9 4 2 9 7 3 9 10 1 3 5 2 5 9 3 9 10 7 6 10 8 3 4 2 5 3 1 4 6 2 6 7 4 5 10 3 1 5 9 6 8 10 4 2 1 5 7 2 7 9 4 6 9 8 4 7 3 10 7 5 1 7 1 6 8 2 8 10 4 7 8 5 9 2 4 1 2 8 9 3 1 7 9 3 4 7 5 6 10 1 6 8 5 6 3 4 6 1 1 8 10 3 4 8 5 7 8 3 4 7 2 8 10 7 5 8 1 9 10 3 5 6 6 7 10 10 9 1 10 4 5 6 9 4 2 3 6 3 7 10 6 8 9 7 2 6 9 7 1 2 3 6 a) Kế hoạch lý thuyết b) Sau khi đã sắp xếp ngẫu nhiên trong khối và giữa các khối. 5. Sắp xếp mạng cân bằng được dùng khi số dòng vô tính là bình phương của một số nguyên. Cách sắp xếp này có ưu điểm là các khối nhỏ trong mỗi lần gặp có thể ngẫu nhiên và cách sắp xếp về cơ bản giống với ô vuông latinh. Đây là cách sắp xếp được dùng ở Đức và ở Mỹ. 1 2 3 4 5 1 6 11 10 21 1 7 13 19 25 6 7 8 9 10 2 7 12 17 22 21 2 8 14 20 11 12 13 14 15 3 8 13 13 23 16 22 3 9 15 16 17 18 19 20 4 9 14 19 24 11 17 24 4 10 21 22 23 24 25 5 10 15 20 25 6 12 18 24 5 1 12 23 9 20 1 17 8 24 15 1 22 18 14 10 16 2 13 24 10 11 2 18 9 25 6 2 23 19 15 6 17 9 14 25 21 12 3 19 10 11 7 3 24 20 21 7 18 4 15 6 22 13 4 20 16 12 8 4 25 11 22 8 19 5 16 7 23 14 5 21 17 13 9 5 25 dòng, mỗi khối nhỏ 5 cây, 6 lần lặp, 30 khối nhỏ. 14 6. Sắp xếp hoàn toàn ngẫu nhiên: Được thực hiện bằng cách trước hết chia vườn giống thành các khối bằng nhau sao để đủ cho mỗi dòng có một cá thể tham gia, còn vị trí của các cá thể trong khối thì hoàn toàn ngẫu nhiên. Sau đó phải điều chỉnh để tránh được hiện tượng các cây cùng dòng nằm cạnh nhau. Đây là phương pháp dễ sử dụng khi tỉa thưa có hệ thống, song khó thực hiện trên hiện trường. Phương pháp này được dùng nhiều ở Ôxtrâylia, Canađa, Đanh Mạch, Na Uy, Nam Phi, Liên Xô (cũ), Mỹ, Đức, Nam Tư v.v.. Một biến tướng của phương pháp này được dùng ở Thái Lan để trồng vườn giống Tếch là sắp xếp ngẫu nhiên hai lần. Thí dụ: Khi trồng khoảng cách 12m x 12m thì lần đầu để khoảng cách 24m x 24m và bố trí cây hoàn toàn ngẫu nhiên, lần thứ hai lại bố trí ngẫu nhiên trong khoảng còn lại để thành khoảng cách 12m x12m, đồng thời có điều chỉnh để tránh hai cây của một dòng vô tính nằm cạnh nhau. 15 PHỤ BIỂU 6: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG ĐẾN HSNC VÀ TLCHH 5.1. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến HSNC . Test of Homogeneity of Variances HSNC Levene Statistic df1 df2 Sig. 1.033 5 84 .404 ANOVA HSNC Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups .391 5 .078 9.062 .000 Within Groups .724 84 .009 Total 1.115 89 5.2. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig. HSNC 3.747 5 84 .074 TLCHH 2.211 5 84 .061 ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 4.426 5 .885 100.945 .000 Within Groups .737 84 .009 HSNC Total 5.162 89 Between Groups 1331.144 5 266.229 73.753 .000 Within Groups 303.216 84 3.610 TLCHH Total 1634.360 89 16 5.3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến HSNC và TLCHH Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig. HSNC .899 5 84 .486 TLCHH .239 5 84 .944 ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 3.648 5 .730 96.947 .000 Within Groups .632 84 .008 HSNC Total 4.281 89 Between Groups 1041.402 5 208.280 45.333 .000 Within Groups 385.936 84 4.594 TLCHH Total 1427.338 89 5.4. So sánh khả năng nhân nhanh giữa 5 dòng nghiên cứu. Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig. HSNC .414 4 85 .798 TLCHH .494 4 85 .740 ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups .268 4 .067 1.419 .235 Within Groups 4.013 85 .047 HSNC Total 4.281 89 Between Groups 20.567 4 5.142 .311 .870 Within Groups 1406.771 85 16.550 TLCHH Total 1427.338 89 17 HSNC Duncan Subset for alpha = 0.05 Dong N 1 2 Dòng 154 18 1.7389 Dòng 141 18 1.8517 1.8517 Dòng 136 18 1.8578 1.8578 Dòng 126 18 1.8656 1.8656 Dòng 122 18 1.9000 Sig. .114 .550 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. TLCHH Duncan Subset for alpha = 0.05 Dong N 1 Dòng 126 18 18.9944 Dòng 154 18 19.2278 Dòng 136 18 19.9500 Dòng 141 18 20.0333 Dòng 122 18 20.2000 Sig. .438 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 18 QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO CHO 5 DÒNG BẠCH ĐÀN CHỌN LỌC I. CẮT, BẢO QUẢN VÀ KHỬ TRÙNG MẪU CẤY. 1.1. Nguồn lấy mẫu. Mẫu có thể lấy từ các nguồn sau: - Chặt cây để tạo chồi: Phương pháp này tạo ra được rất nhiều chồi nhưng nhược điểm là phải chặt bỏ, để khắc phục nhược điểm này bằng cách bảo tồn và lưu giữ trong vườn dòng hoặc trong in vitro. Khi sử dụng phương pháp này cần lưu ý đến khả năng đâm chồi bất định của từng loài để quyết định chiều cao gốc chặt. Với các loài dễ mọc chồi bất định như bạch đàn, phi lao...thường để chiều cao gốc chặt 10 - 15 cm từ mặt đất. Với các loài khó mọc chồi như như các loài keo lá tràm, keo tai tượng...thường để chiều cao gốc chặt từ 0.7 - 1.2 m. - Khoanh vỏ: Từng loài cây khác nhau kỹ thuật khoanh vỏ khác nhau. Đối với bạch đàn thường được khoanh vở ở cách mặt đất 10 - 15 cm, vở được khoanh và cắt đi khoảng 2/3 đường chu vi. Dọn sạch, quanh gốc cây được tiến hành khoanh và tiến hành chăm sóc như làm cỏ, tưới nước, bón phân. Các chồi mọc lên từ chỗ khoanh vỏ được đưa vào làm vật liệu nuôi cấy. - Ghép cây: Ghép cành, mắt...của cây cần nhân giống lên gốc ghép non của cây cùng loài. - Ngoài ra còn có nhiều phương pháp khác như: giâm hom, triết cành, ươm rễ, ken cây.... 1.2. Kích thước mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấy càng to thì khả năng nhiễm khuẩn càng lớn vì vậy khi lấy mẫu nên chọn mẫu nhỏ (nhỏ đến mức tối thiểu cho phép). Nếu nuôi cấy chồi thì mẫu nuôi cấy phải lấy đủ 1 đoạn có chứa chồi nách hoặc chồi đỉnh. Lấy mẫu ở các vị trí khác nhau ảnh hưởng rất khác nhau đến kết quả nuôi cấy, vì vậy tuỳ từng loài cây và mục đích nuôi cấy mà chọn vị trí lấy mẫu cho thích hợp. Mẫu được lấy ở chồi từ 30-40 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non, toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá (cuống lá được cắt sát với chồi) . Mẫu cấy có chiều dài từ 1.5-3.0 cm, đường kính 19 mẫu cấy từ 1-2 mm, mang từ 2-3 nách lá trong đoạn từ lá thứ 3 đến lá thứ 6. 1.3. Tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy - Tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy. Tuổi sinh lý càng già thì khả năng phát sinh hình thái càng yếu. Theo thuyết phát triển giai đoạn thì gốc là phần non nhất của cây, nếu lấy mẫu ở phần này tỷ lệ mẫu đưa vào sẽ rất thành công. - Thời gian lấy mẫu: Nên lấy mẫu vào buổi sáng và không lấy vào thời điểm đang có nguy cơ bị nấm bệnh, tốt nhất là nên phun phòng nấm bệnh định kỳ cho nguồn mẫu định sử dụng. - Mùa cắt mẫu: Nên cắt vào cuối giai đoạn ngủ của cây. ở thời điểm này lượng auxin tập trung rất nhiều để chuẩn bị cho quá trình nảy chồi. Đối với bạch đàn nếu lấy mẫu nuôi cấy tháng 11 thì khả năng nảy chồi kém, tốt nhất là lấy vào tháng 3-4. 1.4. Bảo quản mẫu. - Sau khi cắt rời cây mẹ, mẫu lúc này bị mất cân bằng sinh thái, chủ yếu là lượng nước bị mất. Để khắc phục hiện tượng này cần làm như sau: Mẫu vật lấy song để ngay vào bình lạnh, nhiệt độ thấp sẽ làm giảm bớt khả năng thoát hơi nước. 1.5. Khử trùng mẫu cấy. Vô trùng mẫu cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay trong lần khử trùng đầu tiên. Tuy vậy nếu kiên trì tìm được nồng độ thích hợp và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả tốt. Mẫu nuôi cấy được lấy với kích thước vừa đủ, sơ bộ rửa sạch dưới vòi nước máy. Nếu vật liệu quá nhỏ có thể cho vào cốc lọc lưới và xịt mạnh dưới vòi nước. Nếu vật liệu cấy có nhựa bám hoặc dây bẩn tự nhiên cần rửa bằng bột xà phòng giặt thông thường với liều lượng khoảng 2 thìa cà phê/100 ml nước. Khuấy đều 5 phút, có thể dùng bút lông cọ rửa những vết bẩn rõ. Sau đó xối nước máy cho hết xà phòng, thấm khô mẫu cấy bằng giấy thấm. Bước tiếp theo là thanh trùng bằng hoá chất: bước này phải thực hiện trên tủ cấy vô trùng. 20 Đưa mẫu cấy vào cốc đong đã được thanh trùng. Dùng cồn 75oc để đẩy hết bọt khí ra ngoài mẫu nuôi cấy trong khoảng thời gian 1 - 2 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 4 - 6 lần. Khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 11 phút. Ngoài ra thời gian phụ thuộc vào độ non già của mẫu nuôi cấy ở từng thời điểm. Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 4 - 6 lần. Cuối cùng trước khi cấy cần thấm khô mẫu trên giấy thấm và cắt bỏ tất cả những vết cắt cũ để loại trừ phần mô đã bị thuốc sát trùng thấm sâu. Mức độ cắt nhiều ít tuỳ thuộc chủng loại thuốc và đặc điểm giải phẫu của mẫu. Cần chú ý là trong toàn bộ quá trình sát trùng và tráng rửa cần đảm bảo đủ lượng để làm ngập mẫu nuôi cấy. II. CẤY MẪU. Mẫu được cấy vào môi trường trong ống nghiệm, kỹ thuật cấy như sau: - Dùng panh gắp mẫu và dùng kéo cắt bỏ những phần không cần thiết như cuống lá, đoạn thân không có nách lá... - Thả mẫu vào ống nghiệm hoặc bình tam giác - Dùng kim cấy cấy phần gốc của mẫu vật vào trong môi trường - Mẫu cấy xong phải gói kín và được bảo quản lạnh 72 giờ Chú ý: Khi lấy mẫu về phải cấy ngay trong ngày. III. CẤY CHUYỂN MẪU. 3.1. Cấy chuyển lần đầu: Mẫu được cấy ở môi trường đổ trong bình tam giác 250ml hoặc 500ml. Sau khi cấy mẫu được 28 ngày thì tiến hành cấy chuyển sang môi trường nhân chồi. Dùng panh để lấy chồi và dùng kéo cắt bỏ bớt lá, đoạn thân khô, phần gốc bị già. Dùng kim ấn nhẹ cho phần gốc nằm trong môi trường. Nên chuyển mỗi mẫu sang một bình mới để giảm nguy cơ nấm khuẩn và cứ tiến hành cấy chuyển như vậy cho đến khi mật độ mẫu trong bình đủ tiêu chuẩn một bình giống gốc. 3.2. Cấy chuyển bình gốc. Mục đích là càng tạo ra nhiều chồi càng tốt nên mỗi loài cây khác nhau có cách cấy khác nhau. Nếu muốn tạo chồi từ chồi đỉnh và chồi bên thì cắt 21 chồi ra thành từng đoạn, mỗi đoạn mang theo 1 - 2 nách lá. Dùng kim cấy dàn đều và ấn nhẹ trên bề mặt môi trường. IV. ĐIỀU KIỆN VẬT LÝ 4.1. Ánh sáng Ánh sáng là nhân tố cần thiết cho quang hợp vì vậy trong quá trình nuôi cấy ánh sáng dữ một vai trò rất quan trọng. Cây trong ống nghiệm có thể sử dụng được ánh sáng tự nhiên hoặc ánh sáng nhân tạo. Nếu sử dụng ánh sáng tự nhiên thì phòng nuôi dưỡng được thiết kế theo kiểu nhà kính bát giác. Nếu sử dụng ánh sáng đèn thì phải có hệ thống đèn chiếu sáng với chủng loại ánh sáng đèn phù hợp. Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn nêon với cường độ ánh từ 1000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày. 4.2. Nhiệt độ Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất 23-270C đối với nhân chồi và thúc chồi. 4.3. Độ ẩm. Độ ẩm tương đối của không khí cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng nảy chồi và ra rễ của các loài thực vật. Vì vậy trong nuôi cấy mô khi chúng ta tạo ra nền nuôi cấy cũng cần phải nghiên cứu độ ẩm phải đạt độ ẩm tương đối của không khí trong bình nuôi cấy như ở ngoài là 85-90% sẽ thuận lợi cho cây phát triển. Độ ẩm của phòng nuôi lại hoàn toàn ngược lại. Độ ấm của phòng nuôi không cho phép vượt quá 60 %. V. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung thành phần các chất như sau: 30g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5 mg/l NAA, pH =6. Pha môi trường theo phương pháp truyền thống, thành phần môi trường MS như sau. 22 Các chất đa lượng CaCl2 332.02 mg/l 2.99 mM KH2PO4 170.00 1.25 mM KNO3 1900.00 18.79 mM MgSO4 180.54 1.50 mM NH4NO3 1650.00 20.61 MM Các chất vi lượng CoCl2.6H2O 0.025 mg/l 0.11 µM CuSO4 0.025 0.10 µM FeNaEDTA 36.700 0.10 mM H3BO3 6.200 0.10 mM KI 0.830 5.00 µM MnSO4. H2O 16.900 0.10 mM Na2MoO4.2 H2O 0.250 1.03 µM ZnSO4.7 H2O 8.600 29.91 µM Các chất vitamin Glycine 2.00 mg/l 26.64 µM Myo-Inositol 100.00 0.564 mM Nicotinic acid 0.50 4.06 µM Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0.50 2.43 µM Thiamine HCl (vitamin B1) 0.10 0.30 µM 23 * Thao tác khi cấy. - Cồn 950 dùng để đốt đèn cồn - Cồn 750dùng để sát trùng dụng cụ - Nước rửa khử trùng (do Trung quốc sản xuất có tên là LiqunrBenzalkoni Bromidi) dùng để vệ sinh buồng cấy và sát trùng tay. - Sau khi hoàn tất công tác vệ thì mới bắt đầu các thao tác cấy - Châm đèn cồn, cắm dụng cụ cấy vào lọ cồn 750 - Đặt ống nghiệm, bình cấy, bình gốc... lên bàn - Mở nút bình gốc, hơ miệng bình lên ngọn đèn cồn - Hơ panh kéo lên ngọn đèn cồn, hơ lần lượt cho đến khi cháy hết cồn trên panh kéo - Khi panh kéo nguội bắt đầu cấy chuyển. - Sau khi cấy hết một mẻ từ 7-8 ống nghiệm hoặc một bình gốc thì dọn dẹp, vệ sinh mặt bàn cấy. Panh kéo cắm trở lại lọ đựng cồn 75o - Dùng kim cấy để dằm mẫu vật xuống nền nuôi cấy. Kim cấy trước khi đưa vào để dằm mẫu vật cũng được hơ lên ngọn đè cồn, khi sử dụng xong cắm trở lại vào lọ đựng cồn 750 - Hơ nút bông trên ngọn lửa đèn cồn sau đó đậy nút, bao giấy và buộc dây. Nếu tiếp tục cấy thì thao tác lặp lại như trên.