Nghiên cứu tối ưu điều kiện thu nhận enzyme protease từ sò lụa và thử nghiệm thủy phân thịt cá

từ sò lùa là 55oC. Hình 7. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính của protease từ sò lụa Kết quả xác định pH ban đầu thủy phân thịt cá thích hợp bằng chế phẩm protease từ sò lụa Độ pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng của enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động tốt tại một trị số pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất enzyme mà pH enzyme hoạt động thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid [2]. Để xác định pH thích hợp để thủy phân thịt cá bằng CPE protease từ sò lụa, thực hiện phản ứng giữa CPE protease với thịt cá ở điều kiện pH ban đầu khác nhau từ 4÷9. Hình 8. Ảnh hưởng của pH phản ứng đến hoạt tính protease từ sò lụa Kết quả thí nghiệm cho thấy, pH thủy phân khác nhau thì khả năng thủy phân thịt cá của CPE protease từ sò lụa là khác nhau như Hình 8. Trong dãy pH khảo sát thủy phân thịt cá thì ở pH 6,0 CPE protease đạt được khả năng thủy phân cao nhất. Điều này, có thể do ở pH 6,0 thì enzyme và cơ chất ở trạng thái ion hóa thích hợp nhất cho sự kết hợp với nhau cho nên enzyme đạt hoạt độ xúc tác lớn nhất. Khi tiếp tục tăng pH thủy phân thịt cá lên thì khả năng thủy phân của CPE protease từ sò lụa giảm. Ở các giá trị pH ngoài vùng pH tối ưu, hoạt độ của protease giảm có thể do các 0.141 0.182 0.268 0.302 0.3890.404 0.340 0.283 0.121 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 30 35 40 45 50 55 60 65 70 H oạ t đ ộ p ro te as e (U I/ m l) Nhiệt độ (oC) 0.202 0.242 0.3650.387 0.3228 0.211 0.178 0.084 0.047 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 4,0 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 9,0 H oạt độ p ro te as e (U I/ m l) pH ban đầu Kỷ yếu Hội nghị khoa học 102 nguyên nhân sau: trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất còn thấp, mức độ kết hợp enzyme cơ chất thấp; pH cao hay thấp cũng có thể làm biến tính enzyme nên là giảm hoạt độ xúc tác của enzyme đó. Như vậy, pH thủy phân thịt cá thích hợp bằng CPE protease là 6,0. Kết quả xác định nồng độ chế phẩm enzyme protease thích hợp để thủy phân thịt cá Việc nghiên cứu nồng độ enzyme/cơ chất giúp thực hiện phản ứng thủy phân bằng enzyme một cách nhanh nhất với lượng enzyme phù hợp không thừa hay thiếu. Để xác định nồng độ CPE protease thủy phân thịt cá thích hợp, tiến hành thủy phân hỗn hợp thịt cá bằng chế phẩm protease với tỷ lệ hoạt độ CPE protease/thịt cá (UI/g) tăng dần từ 0,2 UI/g ÷1,6 UI/g với bước nhay là 0,2 UI. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ CPE protease ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân thịt cá dựa vào lượng tyrosin hình thành như Hình 9. Trong dãy nồng độ khảo sát thì nồng độ CPE protease là 1UI/g thịt cá là phù hợp vì lúc này sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất là cực đại. Khi tiếp tục tăng nồng độ CPE protease thì hiệu quả thủy phân không tăng. Điều này có thể do lượng cơ chất đã kết hợp hết với lượng enzyme cho vào nên khi tăng nồng độ enzyme thì vẫn không tăng lượng tyrosin hình thành. Do đó, có thể chọn nồng độ enzyme protease để thủy phân mẫu thịt cá là 1,0 UI/g thịt cá. Hình 9. Ảnh hưởng của nồng độ CPE protease đến khả năng thủy phân thịt cá Kết quả đánh giá mức độ thủy phân thịt cá bằng chế phẩm enzyme protease thu được từ sò lụa Việc nghiên cứu thử nghiệm khả năng thủy phân của enzyme là cần thiết cho việc ứng dụng hiệu quả về sau. Mức độ thủy phân là một trong các thông số đánh giá hiệu quả thủy phân cơ chất của enzyme. Mức độ thủy phân được xác định bằng tỷ lệ đạm acid amin trên hàm lượng đạm tổng số. Để xác định mức độ thủy phân thịt cá của CPE protease từ sò lụa, tiến hành thủy phân hỗn hợp thịt cá bằng CPE ở điều kiện thích hợp theo thời gian. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong Hình 10 và Bảng 3. Kết quả cho thấy, trong khoảng thời gian từ 0-4 giờ thủy phân, hàm lượng acid amin tạo thành khá nhanh từ 0÷2,225 mg/ml tương đương mức độ thủy phân là 30,77%. Khi tiếp tục kéo dài thêm thời gian thủy phân lên 5÷6giờ thì hàm lượng acid amin tăng chậm từ 2,414-2,438 mg/ml tương ứng với mức độ thủy phân là 33,38% ÷ 33,71%. Có thể thấy sự gia tăng hàm lượng acid amin lúc này là không đáng kể và có thể kết thúc phản ứng thủy phân ở thời điểm 4÷5 giờ. Hàm lượng đạm acid amin không tăng có thể do enzyme lúc này mất hoạt tính xúc tác. Như vậy, mức độ thủy phân thịt cá của CPE protease từ sò lụa đạt được khoảng 33% trong thời khoảng 4÷5 giờ. Bước đầu có thể ứng dụng enzyme này kết hợp với tác nhân thủy phân khác để đạt hiệu quả thủy phân cao hơn. Hình 10. Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin theo thời gian thủy phân hỗn hợp thịt cá bằng CPE protease từ sò lụa Bảng 3. Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin theo thời gian và hiệu quả thủy phân hỗn hợp thịt cá bằng CPE protease từ sò lụa Thời gian thủy phân (h) Hàm lượng đạm tổng số (mg/ml) Hàm lượng đạm acid amin (mg/ml) Mức độ thủy phân (%) 1 5,231 0,663 9,16 2 0,994 13,75 3 1,373 18,98 4 2,225 30,77 5 2,414 33,38 6 2,438 33,71 0 0.536 0.861 1.593 2.033 2.5172.5822.5042.558 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 0.5 1 1.5 2 H àm lư ợn g ty ro sin (µ M /m l) Nồng độ enzyme/thịt cá (UI/g) 0.663 0.994 1.373 2.225 2.414 2.438 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 1 2 3 4 5 6 hà m lư ợn g đạm a m in (m g/ m l) Thời gian thủy phân (h) Kỷ yếu Hội nghị khoa học 103 KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu này cho phép đi đến một số kết luận sau: So với sò lông và sò điệp thì sò lụa có chứa hệ protease có hoạt tính cao nhất. - Điều kiện tối ưu để chiết protease từ sò lụa là: dung môi chiết là đệm phosphat pH = 7 với tỷ lệ dung môi/mẫu là 1,8; nhiệt độ chiết là 31oC và thời gian chiết là 13 phút. - Điều kiện kết tủa thích hợp để thu hồi CPE protease là aceton 96% với tỷ lệ dịch enzyme/dịch aceton là 1/2 trong thời gian 15 phút. - Điều kiện hoạt động xúc tác phản ứng thủy phân thịt cá thích hợp của CPE protease từ sò lụa là: nhiệt độ thích hợp là 55oC, pH thích hợp 6,0 và thời gian thủy phân thích hợp là 5h. - Mức độ thủy phân thịt cá của CPE protease thu được từ sò lụa là là 33,4%. TÀI LIỆU THAM KHẢO Adinarayana. K, Ellaiah. P, Prasad. D. S. - Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis PE-11, AAPS Pharm. Sci. Tech. 2003, Article 56 (2003) 9p. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến - Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, 1998. Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng - Nguyên liệu chế biến thủy sản, tập 1, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, 2006. Nguyễn Lệ Hà - Một số enzyme từ động vật thủy sản, Tạp chí khoa học – Công nghệ thủy sản, Số 3/2013, Trang 183-189. Lâm Tuyết Hận – Nghiên cứu thu chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá chẽm (Lates calcarifer) và ứng dụng sản xuất bột cá thực phẩm, Luận văn thạc sĩ kỹ thuật, trường Đại học Nha Trang , 2009. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn - Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa (pangasius bocourti), Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, tập 9, số11/2006, trang 59-67. Nguyễn Quang Hùng - Đa dạng sinh học và nguồn lợi động vật thâm mềm hai mảnh vỏ (Bivalvia) vùng biển Cát Bà và Cô Tô, Viện nghiên cứu hải sản - Tuyển tập các công trình nghiên cứu nghề cá Biển (tập III), NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, 2005. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Lệ Hà - Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, 2016. Roe. S. - Protein purification techniques, Oxford University press (2001) 262p. Sriket, C - Proteases in fish and shellfish: Role on muscle softening and prevention, International Food Research Journal 21 (2014), 433-445. Lê Ngọc Tú, La Văn Chư, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thắng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Dững, Lê Đoàn Diên - Hóa sinh học công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Thangam. E. B. and Rajkumar. G. S - Purification and characterization of alkaline protease from Alcaligenes faecalis, Biochem 35 (2002), pp149-154. Wisuthiphaet, N, Klinchan, Kongruang, S. - Fish protein hydrolysate production by acid and enzymatic hydrolysis, KMUTNB Int J Appl technol, vol. 9, no. 4 (2016), pp 261-270.