MỘT SỐYẾU TỐCẦN THIẾT TRONG KỸTHUẬT GEN

CHƯƠNG 4 I.MỘT SỐ YẾU TỐ CẦN THIẾT TRONG KỸ THUẬT GEN 4.VECTƠ TÁCH DÒNG 4.1.Khái niệm: Vectơ tách dòng ( cloing vectơ) là các phân tử AND có kích thước nhỏ cho phép cài(gắn) các đoạn AND cần thiết ,có khả năng tái bản không phu thuộc vào sự phân chia của tế bào ,tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gen của tế bào vật chủ. Vectơ tách dòng phải có nhiều điểm cắt đặc biệt duy nhất cho các loại enzim giới hạn khác nhau, đồng thời mang các gen tín hiệu (gen chỉ thị màu hoặc chỉ thị kháng sinh) để dễ dàng nhận biết các tế bào mang vectơ tái tổ hợp.Vectơ tách dòng được sử dụng như một “phương tiện vận chuyển gen” nhằm tạo số lượng lớn các bản sao của mộth gen hoặc một trình tự AND trong các tế bào chủ.Vectơ tách dòng có vai trò quan trọng trong tách dòng gen,giải trình tự gen, hoặc xây dựng các bản đồd gen… 4.2. Các đặc tính của một vectơ : - Vectơ phải có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào sự sao chép bộ gen tế bào chủ. - Vectơ phải có kích thước càng nhỏ càng tôt để có thể thu nhận lượng AND tối đa. Hơn nữa, kích thước vectơ càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và hiệu quả. - Vectơ phải cónhững đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa chúng; các đặc tính này được mã hóa bằng các gen chọn lọc. Thông thường đó là các đặc tính kháng với kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vectơ sống được trên môi trường có kháng sinh hoặc là có khả năng sản sinh một enzim chuyển hóa một cơ chất tạo màu phát hiện được trên môi trường thạch. - Vectơ phải tồn tại trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và phải ít gây xáo trộn nhất cho tế bào chủ. - Vectơ phải mang những vị trí nhận biết duy nhất ( nghĩa là chỉ tồn tại một vị trí nhận biết cho mỗi enzim ) của một số lượng tối đa enzim giới hạn( RE).Điều này mở rộng khả năng xây dựng các vectơ tái tổ hợp.Do mối RE tạo một dạng đầu sole riêng, có khả năng gắn nối với một đoạn AND mang đầu sole tương ứng.Các đâu sole càng đa dạng thì các trình tự AND gắn vào cũng càng đa dạng hơn. Hơn nữa các vị trí cũng sẽ xen vào chính giữa gen và làm bất hoạt gen ấy. 4.3 Các loại vectơ tách dòng : Có nhiều loại vectơ :plasmid,phage,cosmid,YAC,…Người ta chọn sử dụng một loại vectơ dựa vào vào kích thước của đoạn AND cần tạo dòng và mục đích tạo dòng: a. Vectơ tách dòng là Plasmid: - Plasmid là các phân tử AND xoắn kép dạng vòng,có kích thước nhỏ,trong tế bào chất của tế bào vi khuẩn hoặc tế bào nấm men. Kích thước trung bình của plasmid từ 1-5kb,plasmid có khả năng tự tái bản độc lập với sự phân chia tế bào.Plasmid cho cài gắn các đoạn AND lạ, không gây ảnh hưởng tới chức năng và hoạt động của tế bào.Plasmid ở vi khuẩn mang một số ít gen như các gen xác định giới tính F,gen kháng chất kháng sinh,gen sinh độc tố..Mỗi loài vi khuẩn có các loại plasmid đặc trưng riêng. - Qui ước: Cách gọi tên plasmid:Chữ p viết thường là plasmid.Một,hai hoặc ba chữ cái viết in hoa là chữ đầu tiên tên tác giả tạo nên plasmid hoặc tên vi khuẩn có plasmid đó.Ví dụ : pBR322 - Các loại vectơ tách dòng và kích thước đoạn AND insert Loại vectơ Kích thước AND insert Plasmid Phage Phagemid Cosmid BAC( thiết kế từ một phần AND E.coli và các plasmid) TAC (thiết kế từ một phần đoạn vir gen của Ti-plasmid) BiBAC (thiết kế từ một phần AND bộ gen Agrobacterium) PAC (bộ gen của phage P1 + plasmid) YAC( thiết kế từ một phần AND bộ gen của nấm men) … 1-5 kb 15-25 kb 20-30 kb 30-50 kb 100-300 kb 100-300 kb 100-500 kb 100-300 kb 2.000 kb - Một số loại plasmid thông dụng: +Plasmid tự nhiên được tách chiết được từ vi khuẩn như pSC101,ColE1. +Plasmid nhân tạo ( thế hệ 2 và thế hệ 3) được tạo nên bằng cách tập hợp các đặc tính quí của của nhiều plasmid tự nhiên và thêm các gen chỉ thị và đoạn đa cắt nối MCS tạo nên các plasmid mạnh.Ví dụ :pBR322,pUC18,pSP64,Gemini..pCR2.1,pET.. b. Vectơ tách dòng là Phage: - Phage ( Bacteriophage) bao gồm nhiều loại thực khuẩn thể có bộ AND mạch đơn hoặc mạch kép được sử dụng làm vectơ tác dòng gồm nhiều loại khác nhau:f1,M13,fd,λ EBML3, λ GEM 11..Các vectơ tách dòng là phage thường được tạo nên từ sự cải biến bộ gen phage. -Ưu điểm của phage:Dùng vectơ phage có thể cài đoạn ADN lớn hơn plasmid,phage có hệ thống gen giúp xâm nhiễm và tạo nên số bản sao rất cao trong tế bào vi khuẩn, có hiệu quả cao ở cả tế bào prokaryote và eukaryote c. Vectơ tách dòng là Phagemid - Phagemid cấu tạo gồm một số gen của plasmid ( các gen chỉ thị,đoạn ori…) và một phần gen của phage ( đoạn ori, các gen cần thiết cho sự đống gói). Ví dụ: vectơ pEMBL8 là plasmid cấu tạo từ một đoạn của M13,mang các gen chỉ thị kháng sinh AmpR và lacZ lấy từ plasid. d. Vectơ tách dòng là Cosmid - Vectơ tách dòng cosmid được thiết kế từ một đoạn của plasmid và đoạn cos của phage.Các vectơ cosmid mạnh có thể được gắn thêm đoạn đa cắt nối (MCS), đoạn khởi đầu tái bản (ori) của vi rut.. - Ví dụ, vectơ SuperCos kích thước 7,9 kb có cấu trúc gồm 2 đoạn cos của bộ gen phage,2 gen chỉ thị kháng sinh (ampicilin và neomycin),đoạn ori của virus SV40 và đoạn cắt nối(MCS). Vectơ cosmit cho cài gắn AND insert có kích thước lớn tới 50 kb. e. Vectơ tách dòng là Nhiễm sắc thể nhân tạo: - Bộ gen của sinh vật bậc cao có kích thước rất lớn nên khi chuyển gen bằng các vectơ thông thường tạo nên số lượng dòng rất lớn gây khó khăn trong tách dòng.Các nhiễm sắc thể nhân tạo được thiết kế làm vectơ tách dòng cho phép cài gắn các đoạn AND insert có kích thước rất lớn từ 100 kb đén hàng nghìn kb,tạo thuận lợi trong tách dòng và lập ngân hàng bộ gen. Mỗi loại vectơ tách dòng là nhiễm sắc thể có đặc trưng riêng,cho phép cài đoạn AND có kích thước khác nhau. - Ví dụ:Vectơ tách dòng là nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn BAC được thiết kế từ một phần AND bộ gen của vi khuẩn gồm các đoạn ori,các gen chỉ thị đặc hiệu, đoạn đa cắt nối MCS và promoter đặc hiệu.Vectơ này cho phép cài đoạn AND kích thước 100- 300kb.và được ứng dụng trong việc lập ngân hàng gen của cả tế bào prokaryote và eukaryote g. Vectơ tách dòng là Ti plasmid: - Ti plasmid là plasmid có kích thước lớn hơn tới 200kb trong tế bào vi khuẩn Agobecterium tumefacien. Ti plasmid có một đoạn T-AND kích thước khoảng 10- 20kb mang các gen tổng hợp opin,auxin..gây nên các khối u ở thực vật hai lá mầm, Ti plasid được cải biến cấu trúc làm vectơ tách dòng và vectơ chuyển gen có hiệu quả ở thực vật. - Ti plasmid kích thước quá lớn, gây khó khăn trong tách dòng gen do đó người ta sử dụng một phần AND của Ti plasmid,gắn thêm gen chỉ thị và các đoạn AND chức năng tạo nên các loại vectơ nhị thể, vectơ lien hợp. Ví dụ ,pTiC58,pTiAch5 h. Vectơ tách dòng ở tế bào sinh vật eukaryote - Đối với tế bào động vật bậc cao và thực vật người ta sử dụn vectơ tách dòng là các loại virus được cải biến bộ gen, cắt bỏ các gen độc lực và cài thêm các gen chỉ thị đặc hiệu - Ví dụ ,các loại virus SV40 cải biến bộ gen được sử dụng làm vectơ tách dòng,vectơ chuyển gen ở sinh vật bậc cao . 5. Vectơ biểu hiện gen: 5.1.Đặc điểm cấu trúc vectơ biểu hiện gen: - Vectơ biểu hiện gen ( expression vectơ) là những vectơ tác dòng mang các promoter mạnh,cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng tạo nên các protêin lai( fusion protein). - Cấu trúc :promoter mạnh,trình tự khởi đầu sao chép(ori),vị trí khởi đầu phiên mã,vị trí bám của riboxom, tín hiệu kết thúc dịch mã,các trình tự đa cắt nối ( MCS) và các gen chỉ thị… - Vectơ biểu hiện mạnh là các vectơ có đặc điểm :có khả năng tạo số lượng lớn bản sao trong tế bào vật chủ,promoter hoạt động mạnh,dịch mã tạo nhiều protein lai,đoạn trình tự MCS có nhiều vị trí cắt đặc hiệu của nhiều loại enzim giới hạn, vectơ vẫn giữ được hoạt tính khi cài gắn gen tách dòng kích thước lớn, hoạt động của vectơ không ảnh hưởng hoặc gây ức chế tế bào chủ, gen chỉ thị dễ dàng nhận biết.. 5.2 Các loại promoter thường sử dụng trong vectơ biểu hiện gen: - Trong tế bào prokaryote :vectơ biểu hiện gen thường sử dụng là promoter mạnh của thực khuẩn thể hoặc của vi khuẩn..là những loại promoter thích hợp với nhiều loại ARN polymerase. Ví dụ: T7 promoter kiểm soát sự biểu hiện của gen muộn ở bacteriophage T7. - Trong tế bào eukaryote thường sử dụng các vectơ biểu hiện gen có các promoter mạnh của virus CMVpromoter, SV40 promoter, PGK promoter,ADHI promoter,GAL promoter , AOXI promoter…. - Vị trí cài gắn đoạn DNA tách dòng có thể ở ngây sau promoter hoặc ở trước vị trí kết thúc phiên mã của gen chỉ thị. Tùy cấu trúc đặc trưng của đoạn gen tách dòng và loại promoter để lựa chọn vị trí gắn gen tách dòng thích hợp . 6.Các hệ thống biểu hiện gen ( Expression systems) Biểu hiện gen tạo sản phẩm protein tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng, quyết định sự thành bại của kỹ thuật gen 6.1. Biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn: *) Vi khuẩn E.coli là tế bào chủ được ưa chuộng nhất trong biểu hiện gen, do mang nhiều ưu điểm hơn so với các tế bào khác: - Tốc độ sinh trưởng nhanh, kha năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8h nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp. khả năng tạo sản phẩm gen cao từ 50mg/lít đến 500 mg/lit - Giảm chi phí cho công nghệ và hóa chất, nên giá thành sản phẩm hạ - Cấu trúc bộ gen E.coli và các đặc điểm di truyền đã được biết tương đối đầy đủ nên thuận lợi khi biểu hiện protein tái tổ hợp. Chủng vi khuẩn E.coli BL 21 được ưa chuộng và sử dụng rộng rãi nhất. * ) Hạn chế khi sử dụng E.coli: - Các gen mã hóa các loại protein có kích thước lớn hơn 50kD, protein giàu cystein hoặc những sản phẩm protein có sưn hình thành nhiều liên kết disunfua( S-S) rất khó biểu hiện - Tế bào E.coli có thể cho biểu hiện tốt các loại protein không biến đổi cấu trúc phân tử sau dịch mã và không có quá trình glycosyl hóa. - Một số chủng vi khuẩn E.coli có thể gây bệnh,hoặc tạo các độc tố khi biểu hiện gen của sinh vật bậc cao. - Khả năng tạo và tiết protein ngoại bào của các chủng vi khuẩn E.coli tương đối thấp *) Ngoài ra vi khuẩn Bacillus cũng có 1 số ưu điểm để sử dụng làm tế bào biểu hiện gen 6.2. Biểu hiện gen trong Baculovius nuôi trong tế bào côn trùng - Baculovius là nhóm virus ký sinh hơn 600 loài côn trùng khác nhau, có thể biểu hiện các gen mã hóa proein có kích thước lớn hơn 50kD, thậm chí protein người. - Đặc điểm: Baculovius cho phép biểu hiện các protein có phản ứng glycosyl chính xác và có phản ứng cắt chuỗi peptit tín hiệu, cho hiệu quả cao, giá thành sản phẩm protein tái tổ hợp giảm - Hạn chế: Sự tạo thành protein tái tổ hợp giảm,thường sau 4-5 ngày nuôi cấy mới có sản phẩm,thời gian nuôi cấy lâu( sau 10-15 ngày) . mặt khác,điều kiện thực hiện công nghệ và môi trường nuôi cấy phức tạp 6.3.Biểu hiện gen trong tế bào nấm men: - Nấm men được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gen ở sinh vật bậc cao do có ưu điểm:cho phép sử dụng cả 2 loại vectơ biểu hiện prokaryote và eukaryote, biểu hiện protein kích thước lớn hơn 50 kD, cấu trúc bộ gen nấm men đã được nghiên cứu đầy đủ, không gây bệnh, cho sản phẩm nhanh (sau 8h nuôi cấy đã cho sản phẩm protein tái tổ hợp) ,hiệu suất biểu hiện gen tương đối cao ( 50mg đến 5000mg/lit dịc nuôi cấy) - Các vectơ biểu hiện gen trong tế bào nấm men thường có promoter AOX rất mạnh,khả năng kiểm soát gen cần biểu hiện cao.. - Nấm men S.Cceseivisiae và Pichia Pastoris là các tế bào biểu hiện gen được ứu chuộng nhất trong các hệ thống biểu hiện gen. 6.4 Biểu hiện gen trong tế bào động vật bậc cao: Trong sản xuất vaccine tái tổ hợp và nhiều loại protein có hoạt tính sinh học như interferon, hGH,factor VIII,..người ta thường dùng hệ thống biểu hiện gen là các tế bào S2 của ruồi giấm và tế bào trứng chuột đất vàng Trung Quốc. - Ưu điểm: Biểu hiện các protein kích thước lớn hơn 50kD, có các promoter mạnh SV40,CMV cho phép thực hiện các phản ứng glycosyl hóa,hoặc cắt chuỗi tín hiệu chính xác.Ví dụ ,tế bào trứng chuột đất vàng Trung Quốc được ứng dụng sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp cho con người,do khả năng tạo thành các protein có cấu trúc không gian thích hợp.. - Hạn chế:Chỉ có thể biến nạp bằng xung điện, thời gian sang lọc rất lâu,nuôi cấy phức tạp,giá thành cao. * Chú ý: Mối loại hệ thống biểu hiện có đặc điểm đặc trưng riêng, do đó cần căn cứ vào đặc điểm của gen biểu hiện, bản chất protein tách dòng và protein lai( fusion protein) điều kiện cụ thể của phòng thí nghiệm để lựa chọn hệ thống biểu hiện gen thích hợp.Thông thường nếu biểu hiện protein có kích thước dưới 30 kD thường chọn hệ thống biểu hiện trong tế bào vi khuẩn.Các protein kích thước lớn hơn có quá trình biến đổi sau dịch mã,hoặc glycosyl hóa có thể chọn hệ thống biểu hiện là nấm men, baculovirus hoặc thế bào CHO..