Một số ứng dụng chủ yếu của công nghệ gen - Chương VIII: Ứng dụng kỹ công nghệ gen trong y học và chẩn đoán

PHẦN IIIMỘT SỐ ỨNG DỤNG CHỦ YẾU CỦA CÔNG NGHỆ GENCHƯƠNG VIIIỨNG DỤNG KỸ CÔNG NGHỆ GEN TRONG Y HỌC VÀ CHẨN ĐOÁNI. Kỹ thuật gen trong sản xuất chế phẩm sinh họcSản xuất insulin tái tổ hợp1.1 Lược sử nghiên cứu insulinDo các tế bào beta của tuyến tụy sản xuất, đóng vai trò chuyển hóa đườngBệnh tiểu đường (Diabetes) do thiếu hụt insulin. Từ năm 1922 đã tách chiết insulin từ tụy bò và lợn để điều trị tiểu đường Cấu trúc phân tử insulin người được phát hiện vào năm 1926. Năm 1955 Sanger và cộng sự đã giải trình tự và sắp xếp acid amin1963-1965 đã tổng hợp nhân tạo bằng con đường hóa học  đắt, không phù hợp1967, phát hiện cấu trúc proinsulin1969, phát hiện 3 dạng cấu trúc1978, sản xuất insulin tái tổ hợp trong E.coli1982, insulin được phép lưu hành ở châu Ậu. Bán ở Mỹ năm 19831.2 Cấu trúc gen mã hóa insulin ở ngườiGen mã hóa insulin (IND) nằm trên NST số 11, trên cánh ngắn (11p)Vùng không mã hóa chia làm 3 cụm gen ký hiệu I, II và IIIVùng mã hóa có kích thước 1430 bp. Trong vùng mã có 2 intron.Đoạn gen mã hóa cho 4 peptid của phân tử insulin: Chuỗi peptid tín hiệu (leader), chuỗi B, chuỗi C và chuỗi APreproinsulin is difficult for E.coli to produceContains a signal sequence + A,B, C sections of proteinSignal sequence is removed after targeting to RERTranslation continues on RER (forming proinsulin)Removal of 33 amino acids at Golgi and S-S joining of A and B chains to form insulinInsulinInsulin is made up of 2 chains = 51 amino acids totalA chain = 21 amino acidsB chain = 30 amino acidsIn reality both chains are present in the same protein 1.3 Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợpNguyên lý chung bao gồm:Tách chiết và tính sạch RNA thông tin mã hoá preproinsulinThực hiện kỹ thuật phiên mã ngượcSử dụng enzym giới hạn loại bỏ gen mã hóa chuỗi C, tách dòng riêng từng đoạn gen mã hóa chuỗi A và BTạo vector biểu hiện gen đoạn A và B- Biến nạp riêng mỗi loại vector trong E.coliThực hiện quá trình lên men thu protein chuỗi A-lacZ và B-lacZThu riêng từng loại protein lai và thực hiện phản ứng cắt với cyanur bromid giữa a.a cuối cùng của insulin và a.a của -galactosidaseTách và tinh sạch chuỗi A và B, sau đó tạo hỗn hợp chuỗi A và B, hình thành cầu nối disulfit và thu insulin thành phẩmSản xuất insulin tái tổ hợpHuman Insulin Production by Bacteria6) join the plasmid and human fragmentand cut with a restriction enzymeHuman Insulin Production by BacteriaMix the recombinant plasmid with bacteria.Screening bacterial cells to learn which contain the human insulin gene is the hard part.Route to the Production by Bacteria of Human InsulinA fermentor used to grow recombinant bacteria.This is the step when gene cloning takes place.The single recombinant plasmid replicates within a cell. Then the single cell with many recombinant plasmids produces trillions of like cells with recombinant plasmid – and the human insulin gene. One cell with the recombinant plasmidRoute to the Production by Bacteria of Human InsulinThe final steps are to collect the bacteria, break open the cells, and purify the insulin protein expressed from the recombinant human insulin gene.Route to the Production by Bacteria of Human InsulinOverview of gene cloning.Cloning animation2. Sản xuất hormon sinh trưởng tái tổ hợp2.1 Lịch sử nghiên cứu hormon sinh trưởngHormon sinh trưởng người (hGH – Human Growth Hormone) phát hiện năm 1920. Năm 1950 đã tách chiết hGH từ tuyến yên người.1956, hGH tách từ não bò, cừu, dùng để chữa bệnh lùn ở trẻ em.1972, cấu trúc phân tử của hGH được xác định1985, hãng Genetech sản xuất thành công hGH có tên Protropin.Hormon sinh trưởng người hiện nay chủ yếu sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp gen. Có nhiều sản phẩm thương mại giúp điều trị bệnh hay giúp cho phát triển cơ bắp.hGH là protein nhỏ, có 191 a.a. Trong phân tử có 2 liên kết disulfitCác gen mã hóa hGH của người, bò chuyển vào động vật như cá, lợn,tạo động vật chuyển gen phát triển nhanh.Human Growth Hormone (HGH) (somatotropin)HGH promotes overall body growth by increasing amino acid uptake by cells, protein synthesis and fat utilization for energyInsufficient production of HGH by the pituitary gland = dwarfismChubby face“Baby fat” around waistUnusual body properties as an adult~ 4 feet tall onlyIQ = NormalHGH helps undersized children reach their normal height and size Cấu trúc gen mã hóa hormon sinh trưởng ngườiHọ gen có 5 gen mã hóa, nằm trên cánh dài NST thứ 17, kích thước 66 kbGen mã hóa hGH bị đột biến hoặc rối loạn, dẫn đến thiếu hụt hormon sinh trưởng, gây hội chứng lùn bẩm sinhGen hGH có đoạn trình tự mã hóa chuổi peptid tín hiệu không tương thích promoter của E.coli, do đó biểu hiện gen hGH tái tổ hợp trong E.coli rất yếu hoặc không hoạt động2.3 Công nghệ sản xuất hormon sinh trưởng người TTHBao gồm các bướcTách chiết và tinh sạch mRNA từ tế bào thùy trước tuyến yên và thực hiện kỹ thuật phiên mã ngượcSử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gen mã hóa 23-24 a.a của chuỗi peptid tín hiệuChuyển gen mã hóa hGH vào vector biểu hiện thích hợpBiến nạp vector TTH vào E.coli, nuôi cấy, thu sinh khối, tách chiết và tinh sạch hGHTế bào biểu hiện: vi khuẩn, baculovirus, nấm men, tế bào trứng chuột Pressure to use HGH to stimulate growth in youngsters who have no deficiency but whose parents want them to grow up tall. In the summer of 2003, the U.S. FDA approved the use of human growth hormone (HGH) for boys predicted to grow no taller than 5′3″ and for girls, 4′11″ even though otherwise perfectly healthy. If adult suffers with hypopituitarism, HGH therapy is also available as normally payable under an insurance policy. Pre-recombinant era of HGH productionHGH could be purified from cadaver (tử thi) pituitary glands8 cadavers/year for 8 – 10 years per patientCreutzfeldt-Jacob Disease (CJD) is one of the risk of using brain tissue24 cases reported by 1993 in France from cadaver HGHProtropin (Genentech) and Humatrope (Eli Lilly) Native human GH contains signal peptide needed to direct nascent polypeptide to RER in eukaryotesSignal peptide is bad for E.coli (it can not synthetize this protein)Signal sequence removed be EcoRI cleavageCoding sequence for first 24 aa also lost in the process of removal24 amino acids added back by synthetic DNA linkerExpressed in E. coli successfullyhGH therapy is very expensive, costing anywhere from $800 to $2,500 a month3. Sản xuất interferon tái tổ hợp3.1 Lược sử nghiên cứu interferon- Năm 1930, phát hiện gia súc nhiễm bệnh do một loại virus này, ít bị nhiễm loại virus khác. Isaacs và Linderman (1957) khi nuôi cấy phôi gà đã phát hiện 1 loại protein mới gây ức chế tái bản virus, gọi là interferon (IFN)- Trước năm 1980, sản xuất IFN từ tế bào bạch cầu người, lây nhiễm virus, sau đó nuôi trong phôi gà để tế bào bạch cầu sinh IFN  Giá thành đắtTháng 1 năm 1980 thành công sản xuất IFN bằng con đường TTH trong E.coliInterferon là protein hoặc glycoprotein, TLPT – 16-45 kDa. Có tác dụng ngăn cản sự xâm nhiễm của virus hoặc kìm hãm phát triển khối u.Interferon chia làm 2 nhóm:Nhóm 1: IFN α, IFN β, IFN ωNhóm 2: IFN γ kém bền trong acid Interferons are small proteins released by macrophages, lymphocytes, and tissue cells infected with a virus. When a tissue cell is infected by a virus, it releases interferon. Interferon will diffuse to the surrounding cells. When it binds to receptors on the surface of those adjacent cells, they begin the production of a protein that prevents the synthesis of viral proteins. This prevents the spread of the virus throughout the body. General Action of Interferons Three types of interferons: alpha, beta and gamma.Type I Interferons Type I: alpha and beta Alpha interferons are produced by leukocytes Beta interferons are produced by fibroblasts Both bind to interferon cell receptors type 1 and both encoded on chromosome 9They have different binding affinities but similar biological effectsViral infection is the stimulus for alpha and beta expression Used to mobilize our 1st line of defense against invading organisms Largest group and are secreted by almost all cell typesType II Interferon (gamma) Bind to type 2 receptors and its genes are encoded on chromosome 12Initially believed that T helper cell type 1 lymphocytes, cytotoxic lymphocytes and natural killer cells only produced IFNg, now evidence that B cells, natural killer T cells and professional antigen-presenting cells secrete IFNg also. Gamma production follows activation with immune and inflammatory stimuli rather than viral infection. This production is controlled by cytokines secreted by interleukin 12 and 18.IFN tái tổ hợp Interferons are broken down into recombinant versions of a specific interferon subtype and purified blends of natural human interferon. Many of these are in clinical use and are given intramuscularly or subcutaneously Recombinant forms of alpha interferon include:Alpha-2a drug name RoferonAlpha-2b drug name Intron AAlpha-n1 drug name WellferonAlpha-n3 drug name AlferonNAlpha-con1 drug name InfergenRecombinant forms of beta interferon include:Beta-1a drug name AvonexBeta-1b drug name BetaseronRecombinant forms of gamma interferon include:Gamma-1b drug name AcimmuneHow Does It Prevent Viral Replication?viruscells(Other stimuli:exogenous ds RNA,LPS, bacterial components)How Does It Prevent Viral Replication? virusinterferonHow Does it Prevent Viral Replication?virusInhibitoryproteinsNo replication3.2 Gen mã hóa ở người và cơ chế sinh IFNTrong tế bào người IFN-α mã hóa bởi 22 gen nằm trên cánh ngắn của NST số 9, gen mã hoá IFN-β nằm trên NST số 2Gen mã hóa IFN-γ nằm trên NST số 12, gồm 4 exon. Sản xuất trong tế bào lympho T Vai trò của IFN trong trị bệnh do nhiễm virusĐiều trị viêm gan và ứng dụng trong điều trị ung thưInfected MacrophageT cell/NK cellIFNgIL-12IL-12Rb1Tuberculosis susceptibility genesNRAMP1VDRSTAT1Shown to be linked or associated with TB in more than one populationConflicting studies –both +ve and –ve associations with TB reportedSingle study shows association with TBNegative studies not shown – mostly not published!IL-1b TNFIL-10HLA-DR2 YIFNgR1IFNgR2IL-12Rb2iNOSYP2X7YYYMBL3.3 Công nghệ sản xuất interferon tái tổ hợpSản xuất IFN-α: gây nhiễm nhân tạo virus vào tế bào bạch cầu. Sử dụng một số loại virus như Sendal, Newcastle, λSản xuất IFN-β: từ nguyên bào sợi4. Sản xuất yếu yếu tố VIII và IX tái tổ hợpCác chất có ảnh hưởng đến sự đông máu: từ I đến XII. Trong đó yếu tố VIII và IX đóng vai trò quan trọng.5. Sản xuất vaccin tái tổi hợp và vaccin DNA5.1 Lược sử nghiên cứu và ứng dụng Năm 1780 Edward Jenner phát hiện phương pháp phòng bệnh đậu mùa bằng chủng đậu với virus gây bệnh đậu bò giảm độc lựcLuis Pasteur phát minh vaccin chữa bệnh dạiCó thể chia vaccin làm 2 nhóm: truyền thống và tái tổ hợpựSmallpox - đậu mùaVaccination Jenner 1796 : Cowpox/Swinepox 1800’s Compulsory childhood vaccination 1930’s Last natural UK case 1940’s last natural US case 1958 WHO program October 1977: Last case (Somalia)Smallpox No animal reservoir Lifelong immunity Subclinical cases rare Infectivity does not precede overt symptoms One Variola serotype Effective vaccine Major commitment by governmentsVaccin truyền thống: là vi khuẩn hoặc virus sống đã làm giảm độc lực. Nhược điểm: thời gian bảo quản ngắn, khó bảo đảm an toàn → tính độc hồi lạiVaccin TTH: protein kháng nguyên nhờ kỹ thuật DNA. Ưu điểm: giá thành rẻ, sử dụng rộng rãi chống các bệnh do vi khuẩn, ký sinh trùng, viêm gan do virusVaccin DNA có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh hiểm nghèo (ung thư, AIDS,)5.2 Vaccin tái tổ hợp5.2.1 Vaccin TTH phòng chống viêm ganKháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBV) được sản xuất trong nấm men S.cerevisae từ năm 1981. Bắt đầu sử dụng từ năm 1986Một số sản phẩm vaccin phòng chống HBV: Recombivax HB, Engeris B, Genhevac B, được sản xuất trong tế bào nấm men và vi khuẩnThe growth cycle of Hepatitis B virusChu trình sinh trưởng của HBVFrom Murray et. al., Medical Microbiology 5th edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby Philadelphia,, Figure 66-5HBV vaccin sử dụng gen mã hóa protein vỏ. Protein kháng nguyên HBsAg có khả năng tạo kháng thể miễn dịch mạnh nhất.Gen mã hóa protein vỏ gồm 3 gen: Pre-S1mã hóa chuỗi peptid gồm 128 a.a, Pre-S2 mã peptid có 55 a.a và gen S mã hóa chuỗi peptid có 226 a.aNgười ta tách riêng hoặc tổ hợp S, Pre-S1 và Pre-S2 để tạo tổ hợp vaccin khác nhauViệt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV ở mức cao, viêm gan cấp tính 37-49 %, xơ gan có HBV 47-87 %, ung thư gan có HBV 57-80%Transcription of Hepatitis B virus From Murray et. al., Medical Microbiology 5th edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby Philadelphia,, Note: HBeAg (E) is encoded in C region using different start codons and is not shownFigure 66-6New Methods Recombinant DNASingle gene (subunit)S-antigen mRNAcDNAExpress plasmidS-antigen mRNA proteinHepatitis B vaccineraised in yeast5.2.2 Vaccin tái tổ hợp chống bệnh sốt rét300-500 nhiễm bệnh hàng năm, tử vong 1-3 triệu người. Kí sinh trùng do 4 loài có vòng đời và quá trình lây nhiễm phức tạpVaccin từ gen kháng nguyên Pfs-25 đang được thử nghiệm. Gen Pfs-25 được tách dòng từ Plasmodium falciparum mã hóa cho protein có TLPT 25 kDaĐã sử dụng vaccin phòng chống viêm não, cúm gà. Đang phát triển vaccin phòng chống sốt xuất huyết, HIV/AIDS5.3 Vaccin DNA5.3.1 Lược sử nghiên cứu và vai trò của vaccin DNA1990 Wolff và cs thử nghiệm gắn một đoạn DNA vào vector biểu hiện, sau đó đưa trực tiếp vào tế bào sống  Mở ra triển vọng mới phòng chống bệnh truyền nhiễmBệnh Gumboro do virus gây bệnh trên gà. Năm 1996 nhiều nghiên cứu TTH gen kháng nguyên VP2 hoặc đoạn gen VP3, VP4 tạo vaccin DNA.Vaccin DNA gồm 2 loại: vaccin tập hợp gen kháng nguyên và vaccin tập hợp gen sinh kháng thểVaccin có nhiều ưu điểm: dễ dàng thiết kế, sản xuất, bảo quản DNA Vaccines and HIV HIV could be prevented using DNA Vaccines-By isolating the gene for a protein produced by HIV, a DNA Vaccine could be created and immunity for the protein and thus HIV could be established. People would then be able to be immune to HIV.Many experiments have been done -Researchers have attempted to create many varying DNA Vaccines, but none have been entirely successful in humans.Envelope gene-A specific gene of HIV that could be used to create a DNA Vaccine for HIV.www.wellesley.edu4II. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán và điều trịSử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán và điều trị ung thư do virus- Ung thư vòm họng do virus RBV (Epstein-Barr virus)- Phát hiện 6 loại virus gây viêm gan nguyên phát (HAV, HBV, HCV, HDBV, HEV và HGV)1.2 Kỹ thuật gen và ứng dụng trong điều trị ung thưPhương pháp phổ biến điều trị ung thư dùng vector liệu pháp gen từ Paramyxovirus và kết hợp xạ trịHơn 50% trường hợp ung thư ở người liên quan đến hoạt tính gen p53Gen p53 có kích thước 23 kb, nằm trên NST 17.Gen p53 sản xuất protein có TLPT 53 kDa, điều hòa quá trình phân chia tế bào và kích hoạt hiện tượng chết theo chu trình (apoptosis)Naked DNATarget CellTherapeutic ProteinAAVRetrovirus/LentivirusAdenovirusNucleusGene Therapy Principles2. Chẩn đoán một số bệnh nhiễm trùng bằng PCRChẩn đoán sớm ký sinh trùng sốt rét: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale và P.malariae. Chẩn đoán nhiễm vi khuẩn lao Mycobacteria tuberculosisChẩn đoán virus Dengue gây sốt xuất huyết4. Sử dụng kỹ thuật microarray trong chẩn đoán bệnhMảng (thủy tinh, nhựa) có kích thước nhỏ chứa mẫu dò (300 ngàn – hàng triệu) cho phép chẩn đoán nhanh các bệnh liên quan vật chất di truyền (DNA, RNA)Applicationto signaling:Fibroblastsstimulatedwith serum:8600 genes.Principle:DNA microarrayExperimental approaches5. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng ở vật nuôiChẩn đoán một số bệnh thường gặp trên tôm: bệnh đốm trắng do WSSV, còi do MBV, đầu vàng (YHV)The Asian pandemic WSSV19931991/2199319931993199419996. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán bệnh cây trồng và thực phẩm chuyển genBệnh héo xanh do Xanthomonas Phát hiện bắp, ngô chuyển gen