Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong chẩn đoán bệnh da

Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong chẩn đoán bệnh da (Kỳ 1) Ths Trần Mẫn Chu Trưởng khoa xét nghiệm P. Viện trưởng Viện Da liễu Quốc gia Đại cương: Miễn dịch huỳnh quang ( Immunofluorescence: IF) là một kỹ thuật hoá mô cần thiết để phát hiện kháng nguyên và vị trí khu trú của các kháng nguyên đó. Kháng thể đặc hiệu được gắn với phức hợp huỳnh quang (Fluorescein Isothiocyanate: FITC ), giúp chúng ta dễ dàng quan sát thấy được các phản ứng miễn dịch, đồng thời không làm thay đổi các phản ứng miễn dịch. Phức hợp kháng thể huỳnh quang được thêm vào một tổ chức và sẽ gắn chặt vào kháng nguyên, sẽ tạo nên một phức hợp miễn dịch bền vững. Không một kháng thể nào bị mất trong quá trình rửa, và kết quả được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Bộ điều hoà của kính hiển vi chứa nguồn ánh sáng có cường độ lớn, kích thích kính lọc để tạo ra bước sóng có khả năng gây hoạt hoá huỳnh quang, tấm chắn của kính lọc có tác dụng loại bỏ các bước sóng gây nhiễu của ánh sáng. Khi quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang phải quan sát dưới với nền tối, kháng nguyên gắn đặc hiệu với kháng thể huỳnh quang có thể được phát hiện bởi màu xanh lục sáng. Có 3 loại kỹ thuật MDHQ cơ bản dùng trong chuyên ngành da liễu: - MDHQ trực tiếp ( Direct Immunofluorescein : DIF ) - MDHQ gián tiếp ( Indirect Immunofluorescein : IIF ) - MDHQ gián tiếp bổ thể ( Complement Indirect immunofluorescein : CIIF ) MDHQ trực tiếp là kỹ thuật xét nghiệm để xác định kháng thể ở da của người bệnh. MDHQ gián tiếp là kỹ thuật xác định kháng thể ở trong huyết thanh, huyết tương, dịch bọng nước hoặc các dịch khác. MDHQ gián tiếp bổ thể là sự biến đổi của kỹ thuật MDHQ gián tiếp để xác định kháng thể có gắn bổ thể ở trong dịch của người bệnh. Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp( Viết tắt: DIF ) DIF là phương pháp nhuộm hóa mô để xác định kháng thể hoặc các protein khác của tổ chức mô. Trong da liễu, DIF để xác định sự lắng đọng của các Globulin miễn dịch ( IgG, IgM, IgA ), Bổ thể ( C3 ) và Fibrinogen ở tổn thương da của người bệnh. Mảnh cắt lạnh được ủ với các FITC gắn kháng thể. Để thu được huỳnh quang đặc hiệu tốt nhất cần pha thật chính xác các phức hợp huỳnh quang và nên nhuộm tiêu bản chứng . Đối với DIF, mảnh sinh thiết nên được cắt lạnh, chia làm 5 lam và mỗi lam có ít nhất 2 lát cắt có độ dày 4 àm, sau đó để khô bằng quạt gió trong 10 phút, rửa bằng PBS có pH 7,4 trong 10 phút, Lần rửa đầu tiên này có tác dụng loại bỏ OCT xung quanh mảnh cắt và cũng loại bỏ các Protein không đặc hiệu khác có trong mảnh cắt, mảnh cắt lại tiếp tục được làm khô bằng quạt gió, mỗi lam được phủ với 1 loại Globulin miễn dịch gắn với FITC và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Những kháng huyết thanh không phản ứng sẽ được rửa bỏ bằng PBS trong 10 phút ( 5phút /lần). để khô bằng gió quạt lần nữa, gắn lam men bằng 1 giọt Buffer glycerol, đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kháng thể kháng Ig lát cắt sinh thiết có gắn các marker huỳnh quang Hình 1: kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Chọn vị trí tổn thương : Để đạt kết quả phản ứng MDHQ trực tiếp, thì chọn vị trí tổn thương thích hợp để chích thủ là cực kỳ quan trọng vỡ chất phản ứng miễn dịch có thể ở vùng này mà không ở vùng khác như trong bệnh LE và DH, đôi khi phải tiến hành cắt lại mảnh sinh thiết khác để có được chẩn đoán đúng. Mảnh sinh thiết có đường kính 4 – 5 mm, vị trí sinh thiết nên lấy tại: 1. Đối với tổn thương là bọng nước : mảnh sinh thiết nên lấy ở bờ, 1/2 là da lành, 1/2 là tổn thương bọng nước, vì cấu trúc của thượng bì bị biến đổi ở vùng có tổn thương bọng nước nên xác định vị tri khu trú của các kháng nguyên bất thường khó khăn. 2. Các loại tổn thương khác : mảnh sinh thiết đúng vào vị trí của tổn thương 3. Những tổn thương nghi ngờ là tổn thương của viêm mao mạch nên cắt các tổn thương sớm < 12 giờ Vị trí cắt sinh thiết Bọng nước Xq bọng nước Da lành