Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong chẩn đoán bệnh da

Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong chẩn đoán bệnh da Đại cương: Miễn dịch huỳnh quang ( Immunofluorescence: IF) là một kỹ thuật hoá mô cần thiết để phát hiện kháng nguyên và vị trí khu trú của các kháng nguyên đó. Kháng thể đặc hiệu được gắn với phức hợp huỳnh quang (Fluorescein Isothiocyanate: FITC ), giúp chúng ta dễ dàng quan sát thấy được các phản ứng miễn dịch, đồng thời không làm thay đổi các phản ứng miễn dịch. Phức hợp khỏng thể huỳnh quang được thờm vào mụ tổ chức và sẽ gắn chặt vào kháng nguyên, sẽ tạo nên một phức hợp miễn dịch bền vững. Không một kháng thể nào bị mất trong quá trình rửa, và kết quả được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Bộ điều hoà của kính hiển vi chứa nguồn ánh sáng có cường độ lớn, kích thích kính lọc để tạo ra bước sóng có khả năng gây hoạt hoá huỳnh quang, tấm chắn của kính lọc có tác dụng loại bỏ các bước sóng gây nhiễu của ánh sáng. Khi quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang phải quan sát dưới với nền tối, kháng nguyên gắn đặc hiệu với kháng thể huỳnh quang có thể được phát hiện bởi màu xanh lục sáng. Có 3 loại kỹ thuật MDHQ cơ bản dùng trong chuyên ngành da liễu: - MDHQ trực tiếp ( Direct Immunofluorescein : DIF ) - MDHQ gián tiếp ( Indirect Immunofluorescein : IIF ) - MDHQ gián tiếp bổ thể ( Complement Indirect immunofluorescein : CIIF ) MDHQ trực tiếp là kỹ thuật xét nghiệm để xác định kháng thể ở da của người bệnh. MDHQ gián tiếp là kỹ thuật xác định kháng thể ở trong huyết thanh, huyết tương, dịch bọng nước hoặc các dịch khác. MDHQ gián tiếp bổ thể là sự biến đổi của kỹ thuật MDHQ gián tiếp để xác định kháng thể có gắn bổ thể ở trong dịch của người bệnh. Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp ( Viết tắt: DIF ) DIF là phương pháp nhuộm hóa mô để xác định kháng thể hoặc các protein khác của tổ chức mô. Trong da liễu, DIF để xác định sự lắng đọng của các Globulin miễn dịch ( IgG, IgM, IgA ), Bổ thể ( C3 ) và Fibrinogen ở tổn thương da của người bệnh. Mảnh cắt lạnh được ủ với các FITC gắn kháng thể. Để thu được huỳnh quang đặc hiệu tốt nhất cần pha thật chính xác các phức hợp huỳnh quang và nên nhuộm tiêu bản chứng . Đối với DIF, mảnh sinh thiết nên được cắt lạnh, chia làm 5 lam và mỗi lam có ít nhất 2 lát cắt có độ dày 4 àm, sau đó để khô bằng quạt gió trong 10 phút, rửa bằng PBS có pH 7,4 trong 10 phút, Lần rửa đầu tiên này có tác dụng loại bỏ OCT xung quanh mảnh cắt và cũng loại bỏ các Protein không đặc hiệu khác có trong mảnh cắt, mảnh cắt lại tiếp tục được làm khô bằng quạt gió, mỗi lam được phủ với 1 loại Globulin miễn dịch gắn với FITC và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Những kháng huyết thanh không phản ứng sẽ được rửa bỏ bằng PBS trong 10 phút ( 5phút /lần). để khô bằng gió quạt lần nữa, gắn lam men bằng 1 giọt Buffer glycerol, đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kháng thể kháng Ig lát cắt sinh thiết có gắn các marker huỳnh quang Hình 1: kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Chọn vị trí tổn thương : Để đạt kết quả phản ứng MDHQ trực tiếp, thì chọn vị trí tổn thương thích hợp để chích thủ là cực kỳ quan trọng vỡ chất phản ứng miễn dịch có thể ở vùng này mà không ở vùng khác như trong bệnh LE và DH, đôi khi phải tiến hành cắt lại mảnh sinh thiết khác để có được chẩn đoán đúng. Mảnh sinh thiết có đường kính 4 – 5 mm, vị trí sinh thiết nên lấy tại: 1. Đối với tổn thương là bọng nước : mảnh sinh thiết nên lấy ở bờ, 1/2 là da lành, 1/2 là tổn thương bọng nước, vì cấu trúc của thượng bì bị biến đổi ở vùng có tổn thương bọng nước nên xác định vị tri khu trú của các kháng nguyên bất thường khó khăn. 2. Các loại tổn thương khác : mảnh sinh thiết đúng vào vị trí của tổn thương 3. Những tổn thương nghi ngờ là tổn thương của viêm mao mạch nên cắt các tổn thương sớm < 12 giờ Vị trí cắt sinh thiết Bọng nước Xq bọng nước Da lành Cách bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm Mảnh sinh thiết dùng để làm phản ứng MDHQ không nên cố định bằng bất kỳ một loại hoá chất nào. Để tránh cho mảnh sinh thiết bị khô, nên gói bệnh phẩm trong gạc tẩm ướt bằng nước muối 9 ‰. và để ngay bệnh phẩm vào ni tơ lỏng càng sớm càng tốt. Trong trường hợp không có Ni tơ lỏng, thì nên giữ bệnh phẩm trong môi trường vận chuyển Michel ở nhiệt độ 4°c và chuyển đến phòng xét nghiệm trước 24 giờ Cách làm đông lạnh nhanh: Có nhiều phương pháp làm đông lạnh bệnh phẩm nhanh. nếu đông lạnh trong Ni tơ lỏng, thì nên để bệnh phẩm trong một ống khô, sạch hoặc trong ống nhựa, ống tráng nhôm hoặc để trong nang gelatin trước khi cho vào Ni tơ lỏng. Tuyết của đá khô hoặc Aceton hoặc cồn Ethanol cũng có thể là chất làm lạnh để bảo quản bệnh phẩm, nhưng bệnh phẩm nên để trong ống để tránh tiếp xúc với chất làm tan mô. Một phương pháp làm đông lạnh tạm thời khác là dùng cốc 15mm có tráng nhôm. Hoặc vùi bệnh phẩm vào chất vùi gọi là OCT rồi làm đông nhanh và giữ bệnh phẩm ở - 70°C cho tới khi đem ra làm phản ứng. Môi trường vận chuyển bệnh phẩm: Khi vận chuyển bệnh phẩm cần để bệnh phẩm trong một môi trường vận chuyển gọi là dung dịch cố định Michel, dung dịch này cho phép vận chuyển bệnh phẩm một cách dễ dàng ở điều kiện nhiệt độ xung quanh, môi trường này tránh cho mảnh mô không bị thoái hoá, không ức chế các men của phản ứng miễn dịch. Khi lấy bệnh phẩm ra khỏi môi trường vận chuyển, cần rửa mảnh mô trong dung dịch Buffer ( PBS) 30 phút và làm đông lạnh và giữ mô ở nhiệt độ – 70 °C cho đến khi làm phản ứng. Huỳnh quang không đặc hiệu và tự huỳnh quang: Để đánh giá kết quả DIF đúng, chúng ta cần phân biệt huỳnh quang đặc hiệu và huỳnh quang không đặc hiệu. Nền huỳnh quang xanh lá cây nhạt của thượng bì và trung bì bình thường phản ảnh sự kết hợp không đặc hiệu của kháng thể kháng huyết thanh – huỳnh quang với tổ chức. Lý tưởng thì nền huỳnh quang chỉ rất ít, không làm trở ngại trong việc xác định huỳnh quang đặc hiệu, đó là màu lục nhạt huỳnh quang. Có thể hạn chế nền huỳnh quang bằng cách pha đúng nồng độ kháng thể kháng huyết thanh có gắn huỳnh quang. Huỳnh quang không đặc hiệu dạng hạt: do sự kết tụ của các Globulin miễn dịch có trong kháng huyết thanh huỳnh quang, khắc phục hiện tượng này có thể bằng cách ly tâm với tốc độ cao các khang huyết thanh đó. Loại khác của huỳnh quang không đặc hiệu có thể tìm thấy ở lớp sáng ở giữa lớp sừng và lớp hạt. loại này cũng có màu lục nhạt là do sự kết hợp của các Ig huỳnh quang với bề mặt thượng bì. Một vài cấu trúc của da có thể phát ra màu xanh vàng của tự huỳnh quang. Ví dụ, bào tương chất ở tuyến mồ hôi, ở đại thực bào… Đánh giá kết quả: Nên mô tả một cách kỹ lưỡng các hình thức lắng đọng của huỳnh quang miễn dịch ở trên da như: vị trí lắng đọng, kiểu và sự phân bố của lắng đọng miễn dịch và loại protein. - Thứ nhất là vị trí lắng đọng của phức hợp miễn dịch : ở da thường lắng đọng ở các vị trí lớp sừng, khoảng gian bào của các tế bào biểu mô gai, nhân tế bào gai, màng đáy, trung bì, thành mạch, nang lông, tuyến mồ hôi và kết hợp nhiều vị trí. - Thứ hai là sự phân bổ phức hợp huỳnh quang miễn dịch ở trên mảnh sinh thiết có thể là khu trú, có thể là lan toả. - Thứ ba là kiểu lắng đọng có thể là thành dải, thành hạt nhỏ, hạt thô, thành búi, hoặc đồng đều. ở màng đáy nên xác định kiểu lắng đọng là dải hay hạt. dưới kính huỳnh quang miễn dịch huỳnh quang thành dải khi huỳnh quang là liên tục, đều, mảnh mai. Ngoài ra, những kiểu lắng đọng khác là thể hạt, hạt có thể là hạt nhỏ, đều, có thể là hạt lớn, kích thước không đều, hoặc hạt to hình tròn hay bầu dục tạo thành búi. Đôi khi các hạt này có kích thước cực kỳ nhỏ và đứng sát vào nhau tạo thành hình ảnh của giả dải hoặc hạt nhỏ. để phân biệt với thể hạt nhỏ với kiểu dải dọc màng đáy là rất khó, lúc này cần làm thêm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp ( IIF ) để có chẩn đoán xác định cuối cùng. - Thứ tư là loại Ig nào lắng đọng, hầu hết các trường hợp là sự kết hợp của các Ig với bổ thể, chủ yếu là C3. Khi đưa ra kết quả phải dựa vào vị trí của lắng đọng miễn dịch. Với các bệnh khác nhau có thể lắng đọng miễn dịch ở cùng một vị trí nhưng khác nhau về kiểu lắng đọng ( kiểu hạt hoặc kiểu dải ), loại Ig lắng đọng ( IgG, Ig M, IgA ) và có sự lắng đọng ở mạch máu kèm theo hay không ? Lắng đọng ở khoảng gian bào của tế bào biểu mô : Sự lắng đọng huỳnh quang của IgG và bổ thể C3 ở vị trí này chỉ gặp ở bệnh nhân Pemphigus, đặc biệt ở những bệnh nhân pemphigus chưa điều trị, không phải tất cả các vị trí của da đều có sự lắng đọng này. Lắng đọng ở vùng màng đáy: Sự lắng đọng ở vùng này rất phức tạp, vì sự lắng đọng này gặp ở nhiều bệnh như : bệnh da có bọng nước, bệnh mạch máu, bệnh Collagen và một số bệnh khác. Nên chú ý tới kiểu lắng đọng ( hạt, dải ) loại Ig lắng đọng ( IgG, IgA, IgM ) và kèm theo lắng đọng ở mạch máu hay không để phân biệt các bệnh khác nhau. - Dạng dải: Dạng này gợi ý nhóm bệnh pemphigoid, Ly thượng bì bọng nước bẩm sinh, Viêm da bọng nước do lắng đọng IgA thành dải, hoặc porphyrias. + IgG và/hoặc IgM, không có IgA: Gợi ý bệnh Pemphgoid, IgG và IgM cùng lắng đọng gặp ở 80% trường hợp, nhưng cũng có khi lắng đọng ở da bình thường( hiếm). Lắng đọng thành dải của IgG ở bệnh pemphigoid cũng có thể gặp trong ly thượng bì bọng nước mắc phải, để phân biệt hai bệnh cần quan sát vị trí bọng nước dưới kính hiển vi điện tử hoặc dùng kỹ thuật muối bão hoà làm tách màng đáy để xác định vị trí lắng đọng của huỳnh quang miễn dịch tại vùng nào của màng đáy, trong pemphigoid huỳnh quang miễn dịch sẽ lắng đọng ở phía trên laminar densa, còn ly thượng bì bọng nước mắc phải sẽ lắng đọng ở phía dưới laminar densa. + Chỉ có IgA : Gặp trong viêm da bọng nước do lắng đọng của IgA và viêm da bọng nước mạn tính trẻ em. + IgA cùng với IgG và/ hoặc IgM : khi IgA kết hợp với các Ig khác thì không chẩn đoán được các bệnh + IgG thành dải và/ hoặc IgM ở vùng màng đáy và quanh các huyết quản: gặp trong Porphyrias ( 90 %) + Bổ thể: Lắng đọng thành dải của bổ thể có thể đơn độc, cũng có thể kết hợp với các Ig. - Lắng đọng kiểu hạt: Lắng đọng kiểu hạt gặp ở nhiều bệnh, đặc biệt ở Lupus ban đỏ, viêm mao mạch dị ứng, viêm da dạng herpes. + IgG và/ hoặc IgM, không có IgA gặp chủ yếu ở lupus ban đỏ hệ thống và mạn tính (90%). IgM thường gặp trong bệnh phong, viêm mao mạch dị ứng. Lắng đọng của IgG dạng hạt ở mô da bình thường được gọi là Lupus band test. + Chỉ có IgA: gặp trong viêm da dạng herpes, đây là xét nghiệm rất nhạy và đặc hiệu cho bệnh viêm da dạng herpes, lắng đọng ở các nhú trung bì. + Bổ thể: có thể chỉ có bổ thể C3, cũng có thể kết hợp với các Ig khác trong các bệnh trên. nếu chỉ có lắng đọng của bổ thể C3 thì không có giá trị chẩn đoán bệnh. Lắng đọng miễn dịch ở khoảng gian bào và vùng màng đáy: - Lắng đọng dạng hạt của Ig và /hoặc bổ thể C3 ở vùng màng đáy cùng với lắng đọng ở thượng bì thường gặp trong bệnh pemphigus da mỡ. Lắng đọng ở mạch máu: Lắng đọng của Ig và / hoặc bổ thể C3 cùng với hoặc không fibrin ở quanh các huyết quản của trung bì gặp ở khoảng 1/3 đến 2/3 bệnh nhân bị bệnh viêm mao mạch dị ứng: Henoch – schonlein, viêm mao mạch mạng lưới, hồng ban đa dạng, lupus ban đỏ…, lắng đọng này chỉ gặp trong giai đoạn sớm của bệnh < 12 giờ và có thể ở da bình thường của người tiêm Histamine. Sự lắng đọng này chỉ có thể chẩn đoán bệnh chứ không có giá trị chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh, tuy nhiên nếu lắng đọng IgA thì nhiều khả năng hướng tới bệnh Henoch- schonlein. Lắng đọng huỳnh quang miễn dịch ở nhân tế bào biểu mô gai: Lắng đọng Ig ở nhân tế bào, kết hợp với kháng thể kháng nRNP hướng tới bệnh Mixed connective tissue hay SLE. Lắng đọng ở các thể Cytoid : Lắng đọng của các Ig ở các thể cytoid, là những thể tròn, hoặc hình Oval ở trung bì nông, ngay sát thượng bì hoặc ở lớp sâu của thượng bì (thể Civatte), gặp trong bệnh viêm da dạng lichen, đặc biệt ở bệnh lichen phẳng. Bảng hình ảnh DIF không bình thường ở một số bệnh da STT Bệnh DIF 1 Pemphigus vulgaris P. vảy lá P. sùi Lắng đọng của bổ thể C3 và Ig ở khoảng gian bào ( IgG 80 -100%, IgA/IgM 20%, C3 khi bệnh nặng) 2 P. da mỡ Lắng đọng của IgG/C3 ở khoảng gian bào và ở vùng màng đáy ( dạng hạt) 3 Pemphigoid Bullous Lắng đọng của các Ig thành dải ở vùng màng đáy: IgG/C3 80%, IgA/IgM 27% 4 Pemphigoid cicatricial Lắng đọng của Ig thành dải ở vùng màng đáy: IgG/C3 80%, IgA 40% 5 Ly thượng bì bọng nước mắc phải Lắng đọng của IgG thành dải ở vùng màng đáy ở 100% trường hợp 6 Herpes gestationis Lắng đọng thành dải ở vùng màng đáy của C3 100%, IgG 40% 7 Viêm da dạng Herpes có lắng đọng thành dải của IgA Lắng đọng thành dải ở vùng màng đáy của IgA 80%, IgG/IgM/C3 10% 8 Duhring – Broq Lắng đọng dạng hạt ở vùng nhú trung bì của IgA 100%, Fibrinnogen/C3 40% 9 Hồng ban đa dạng Lắng đọng của các IgG, IgM, C3 và Fibrinogen ở mạch máu của trung bì nông 10 Leukocytoclastic vasculitis Lắng đọng của các IgG, IgM, C3 và Fibrinogen ở mạch máu của trung bì nông và trung bì sâu 11 Schonlein – Henoch Lắng đọng của các IgA, C3 và Fibrinogen ở mạch máu của trung bì nông và trung bì sâu 12 Lichen Planus Lắng đọng của các IgG, IgM, IgA, C3 ở các thể Civatte và Fibrinogen thành dải ở màng đáy 13 Mixed connective tissue IgG ở nhân của tế bào gai ( không đặc hiệu), disease và IgG, IgM ở màng đáy 14 Lupus Erythematous IgG,IgM, IgA, C3 dạng hạt ở màng đáy 15 Porphyria Cutanea tarda IgG ở vùng màng đáy và huyết quản