Luận văn Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại hoàng (rheum officinale baill.)

MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm cây cối phát triển quanh năm. Đó là nguồn tài nguyên vô cùng phong phú và quý giá. Theo các nhà thực vật học, nước ta có khoảng 12000 loài cây thuộc 2500 chi và 300 họ [3], [4]. Trong dân gian có rất nhiều cây thuốc và bài thuốc quý có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo đảm sức khỏe của con người. Các loài cây được con người sử dụng làm thuốc, một số cây còn sử dụng làm thực phẩm phục vụ đời sống con người, làm hương liệu cho ngànhh mỹ phẩm. Để sử dụng cây cỏ làm thuốc, người ta có thể bào chế để làm các vị thuốc hoặc tách ra những tinh chất có hoạt tính sinh học cao để bào chế thành các loại thuốc viên, tiêm truyền khác nhau. Hiện nay, việc nghiên cứu thành phần, phân lập thành phần có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc, tìm hiểu cơ chế tác dụng của chúng, làm tăng hoạt tính sinh học của cây bằng phương pháp tổng hợp là vấn đề luôn được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Cây đại hoàng (Rheum sp.) thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) là một loại thuốc quý trong cả Đông y lẫn Tây y. Ở trên thế giới đặc biệt là Trung Quốc và nước ta đã dùng làm vị thuốc chữa một số bệnh như: sỏi thận, vàng da, ứ huyết, đau bụng, ăn không tiêu…. Gần đây, các nhà khoa học Trung Quốc đã tìm ra chất emodin trong rễ cây đại hoàng có hoạt tính chống virus SARS. Tuy nhiên việc nghiên cứu về cây đại hoàng chưa đầy đủ và hệ thống đặc biệt là ở nước ta.Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành "Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại hoàng (Rheum officinale Baill.)" nhằm góp phần tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính sinh học cao dùng làm thuốc chữa bệnh. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ RAU RĂM (Polygonaceae) [9] 1.1.1. Họ rau răm (Polygonaceae) [9] Họ Rau răm hay còn gọi là họ Nghể, họ Kiều mạch có danh pháp khoa học là Polygonaceae, là một nhóm thực vật 2 lá mầm chứa khoảng 50 chi và 1.120 loài cây. Nó là thân thảo, cây bụi và cây thân gỗ nhỏ với các cơ quan sinh sản đơn tính xuất hiện trên cùng một cây hay hai cây khác nhau. Họ này được đặt tên theo hình dạng của hạt: chẳng hạn hạt của cây đại hoàng có tiết diện ngang là một hình tam giác. Trong hệ thống Cronquist thì họ Polygonaceae được đặt trong bộ chính của nó, nhưng các hệ thống phân loại mới hơn lại coi họ này như là một phần của bộ Caryophylales. Họ này có mặt rộng khắp trên thế giới trong các khu vực ôn đới. Còn ở trong các khu vực nhiệt đới có số lượng loài ít hơn. 1.1.2. Phân loại [9] Họ này được chia làm 2 phân họ là Polygonoideae và Eriogonoideae: * Phân họ Polygonoideae được đặc trưng bởi sự thiếu vắng của tổng bao và sự có mặt của bẹ chìa (các bao (vỏ, mang bọc)) phát triển từ các lá kèm ở gốc lá đính kèm. Một số bẹ chìa có các tua lông. Phân họ này bao gồm khoảng 330 chi và 800 loài. * Phân họ Eriogonoideae với khoảng 330 loài, chỉ tìm thấy tại khu vực tân thế giới. Như vậy ở Việt Nam chỉ có phân họ Polygonoideae. 1.1.3. Các chi [9] Sau đây chúng tôi xin giới thiệu sơ bộ một số chi thuộc phân họ Polygonoideae: . Afrobrunnichia . Antigonon: Ti gôn . Aristocapsa . Atraphaxis . Brunnichia . Calligonum . Centrostegia . Chorizanthe . Coccoloba . Dedeckera . Dodeahema . Emex . Eriogonum . Fagopyrum: Kiều mạch . Fallopia: Hà thủ ô đỏ . Pterostegia . Rheum: Đại hoàng . Rumex: Chút chít (dương đề) . Ruprechtia . Stenogonum . Symmeria . Systenotheca . Gilmania . Goodmania . Gymnopodium . Harfordia . Hollisteria . Knorringia . Koenigia . Lastarriaea . Leptogonum . Muconea . Muehlembeckia . Nemacsulis . Neomillspaughia . Oxygonum . Oxyria . Oxytheca . Parapteropyrum . Persicaria . Podopterus . Polygonella . Polygonum: Nghể, Rau răm, Cốt khí . Pteropyrum Như vậy, đại hoàng (Rheum sp.) thuộc chi Rheum của phân họ Polygonoideae. 1.1.4. Một số cây cỏ thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) và tác dụng của chúng [3]. Chúng tôi xin giới thiệu một số cây điển hình và một số dược lý của chúng: *Rumex acetosella L. (Toan thảo) là loại cây có lá ăn được, mát, lợi tiểu. *Rumex crispus L. (Dương đề nhăn) là vị thuốc có tác dụng bổ, lọc máu, lá chứa crisophanol chống vi khuẩn và nepodin chống nấm chứa Fe trị cholesterol. *Rheum officinale Baill. (Đại hoàng dược dụng) là loại cây dùng làm thuốc trị ăn không tiêu, đau bụng... *Polygonum odoratum cloru. (Rau răm) là loại cây dùng làm gia vị BTN, làm tinh dầu, tê liệt ruột và tử cung. *Polygonum multiflorum Thunb. (Hà thủ ô) được sử dụng làm thuốc, củ ăn được, bổ, làm giảm đau, trị đau đầu, trị bướu, làm đen tóc…. 1.2. CÂY ĐẠI HOÀNG VÀ CÔNG DỤNG CỦA NÓ TRONG ĐỜI SỐNG [2] 1.2.1. Cây đại hoàng (Rheum sp.)[2] Cây đại hoàng có tên khoa học là Rheum sp.. Còn gọi là xuyên đại hoàng, tướng quân, mã đế hoàng, nó thuộc họ Rau răm (Polygonaceae). Vị thuốc đại hoàng là thân rễ phơi hay sấy khô của nhiều loại đại hoàng như: chưởng diệp đại hoàng (Rheum tanguticum L.), đường cổ đặc đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim. ex Reegl) hoặc dược dụng đại hoàng (Rheum officinale Baill.) hoặc một vài Rheum khác như: Rhubarb, Rheum emodi, Rheum pulmatum, Rheum rhabarbarum, Rheum palaestinum… Tất cả chúng đều thuộc loài cây đại hoàng và họ Rau răm (Polygonaceae). * Vị thuốc đại hoàng này có màu rất vàng cho nên gọi là đại hoàng (đại là lớn, hoàng là vàng). Nó có khả năng tống cái cũ và thay cái mới rất nhanh chóng như dẹp loạn cho nên người ta gọi là cây tướng quân. Hình 1.1: Cây Đại Hoàng (Rheum officinale Baill.) 1.2.1.1. Mô tả cây [2] Đại hoàng bao gồm rất nhiều cây khác nhau như: *Chưởng diệp đại hoàng (Rheum palmatum L.) là một cây sống lâu năm, rễ thô, to, thân cao tới 2m, giữa rỗng, mặt thân nhăn. Lá ở dưới to dài, có cuống dài, phiến lá hình tim cắt thành 3-7 mép, thùy hơi có răng cưa hoặc hơi cắt, lá ở phía trên thân nhỏ hơn. Cụm hoa mọc thành chùm khi còn non, hoa có màu tím đỏ. Cây này chủ yếu mọc hoang và một phần được trồng ở Tứ Xuyên, Cam Túc (Trung Quốc). *Đường cổ đặc đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim. ex Reegl) cũng là một cây sống lâu năm cao tới 2m, lá có phiến cắt rất sâu thành thùy. Cây này mọc hoang ở Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc. Tại Cam Túc có trồng một số cây. *Cây dược dụng đại hoàng (Rheum officinale Baill.) cũng là một cây sống lâu năm nhưng thấp hơn, chỉ cao chừng 1,5 m. Lá mọc so le, cuống dài. Phiến lá hình trứng phía cuống hình tim, đường kính 40-70 cm, phiến không chia thùy mà chỉ cắt sâu chừng 1/4. Hoa màu xanh nhạt hay màu vàng trắng nhạt. 1.2.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến Sự phân bố của cây đại hoàng là rất rộng rãi và phong phú: *Những loài đại hoàng đã và đang được di thực vào nước ta. Cây mọc tốt, ưa khí hậu mát ẩm và ở độ cao trên 1000m thì thích hợp hơn. Hiện nay, vị thuốc đại hoàng ta phải nhập của Trung Quốc, trước kia nhập của một số nước Châu Âu. Người ta thường hái thân rễ của những cây đã sống trên 3 năm, đào vào các tháng 9-10. Đào về, rửa sạch đất cát, cắt bỏ phần ở trên mặt đất, rễ nhỏ, cạo vỏ ngoài. Củ to quá có thể bổ làm 2 hoặc làm 4 mà phơi cho dễ, dùng lạt xâu treo trong trần nhà để cho khô là dùng được (nếu dùng trong nước) hoặc cạo bỏ vỏ ngoài rồi đánh bóng nếu để xuất khẩu. *Một số cây đại hoàng khác nhau phân bố ở những nơi khác nhau tùy theo địa hình và khí hậu: + Rhabarb phân bố ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản… + Rheum emodi phân bố ở Ân Độ… + Rheum pulmatum thường phân bố ở Inđônêsia… + Rheum rhabarbarum thường phân bố ở Đức… + Rheum palaestinum ở Tây Ban Nha… 1.2.2. Công dụng của cây đại hoàng *Đại hoàng có ý nghĩa về mặt y học: Đại hoàng có vị đắng, tính lạnh, có tác dụng làm tăng tiết mật, kháng khuẩn, lợi niệu. Với liều lượng vừa phải (0,5-2 g) nó chữa được các bệnh như: hạ lị, ứ huyết, thấp nhiệt gây vàng da. Và gần đây, cây đại hoàng còn được dùng để làm thuốc giúp tiêu hóa, chữa kém ăn, ăn không tiêu, đau bụng, ung thư phổi… và một số bệnh khác. *Một số bài thuốc chữa bệnh có sử dụng cây đại hoàng ở Việt Nam. + Chữa đau bụng, bí đại tiện, nôn mửa: (bài thuốc của Trương Trọng Cảnh) có tên là đại hoàng cam thảo thang: đại hoàng 7g, cam thảo 4g, nước 300 ml sắc còn 100 ml. Uống lúc đói [2]. + Chữa sỏi mật: (Bài thuốc của Đỗ Trung Hàm, Nguyễn Thị Dung, Nguyễn Văn Tường) có: Kim tiền thảo 40g, uất kim 12g, mộc hương 12g, nhân trần 12g, chỉ sát 12g, đại hoàng 12g [2]. + Bảo vệ gan: (Bài thuốc bảo vệ gan của Trần Văn Hiền): diệp hạ châu đắng 24g, nhân trần 6g, mã đề 6g, rau má 6g, ngũ vị tử 12g, uất kim 6g, đại hoàng 4g [12]. + Viêm gan, vàng da, vàng mắt: Nhân trần 30g, dành dành 12g, vỏ đại hoàng 10g [12]. + Huyết ứ biểu hiện mất kinh, bế sản dịch sau đẻ, đau bụng sau đẻ, khối ở bụng và ngoại thương. Liều lượng 3-12 g. Chống chỉ định dùng trong thời kỳ kinh nguyệt và khi có thai. *Theo y thuật cổ truyền Trung Quốc, cây đại hoàng có khả năng khử độc trong cơ thể người. Các nghiên cứu gần đây của tiến sĩ Luo cho biết "Các chiết suất từ cây đại hoàng có khả năng khống chế sự sinh sản của virus corona gây bệnh SARS bằng cách vô hiệu hóa protease 3CL - thành phần không thể thiếu trong tác nhân gây bệnh" [9]. Nhóm của Luo cũng phát hiện ra chiết suất từ cây đại hoàng có thể khử hoạt tính của virus cúm và 1 loại virus chuyên gây các bệnh ở đường hô hấp ở trẻ em và người già. *Đại hoàng có ứng dụng về cả mĩ phẩm: Người ta có thể nhuộm tóc bằng thảo mộc để chống bệnh ung thư da đầu do nhuộm hóa chất độc hại. Cho 200g chồi đại hoàng đã phơi khô vào 0,5 lít rượu rồi đun đến khi còn một nửa, để nguội, lọc rồi bôi lên tóc [9]. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY ĐẠI HOÀNG (RHEUM SP.) 1.3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại hoàng (Rheum sp.) Nhìn chung các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây đại hoàng nói riêng và về cây đại hoàng nói chung ở Việt Nam còn chưa đáng kể. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cây đại hoàng, sau đây là một số nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại hoàng đã được công bố: 1.3.1.1. Phân tách và tinh chế galloyl và hydroxycinamoyglucozo từ cây đại hoàng (Rhubarb) [19]. Rhubarb được tìm thấy ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản. Nhóm các tác giả: Yhosiki Kashiwada, Gen-Ichiro Nonaka, Itsuo Nishika, Takashi Yamagishi đã phân tách được 5 hydroxynamoyglucozo và galloyl và cấu trúc của chúng được xác nhận dựa vào số liệu các loại phổ MS và 13C-NMR. STT R1 R2 R3 Tên chất 1 G(β) H Cinn 1-O-galloyl-6-O-cinamoyl-β-D-glucose 1a H H Cinn 6-O-cinnamoylglucose 2 G(β) G Cinn 1,2-di-O-galloyl-6-O-cinnamoyl- β-D-glucose 3 G(β) H Coum 1,2-di-O-galloyl-6-O-P-coumaroyl- β-D-glucose 3a H H Coum 6-O-P-coumaroylglucose 4 G(β) Coum G 1,6-di-O-galloyl-6-O-P-cinnamoyl- β-D-glucose 4a H Coum H 2-O-P-coumaroylglucose 5 G(β) Coum H 1-O-galloyl-2-O-P-coumaroyl- β-D-glucose 6 G(β) Coum H 1-O-galloyl-2-O-cinamoyl- β-D-glucose 7 G(β) Cinn G 1,6-di-O-galloyl-6-O-cinnamoyl- β-D-glucose 8 G(β) H H 1-O-galloyl- β-D-glucose(β-glucogallin) 9 H G H 2-O-galloylglucose 10 H H G 6-O-galloylglucose 11 G(β) H G 1,2-di-O- galloyl- β-D-glucose 12 G(β) H G 1,6-di-O- galloyl- β -D-glucose 13 H G G 2,6-di-O- galloylglucose 14 G(β) G G 1,2,6-tri-O- galloyl- β-D-glucose Các chất 1; 2; 6 ->8; 10->14 được tìm thấy trong đại hoàng của Trung Quốc, 4->12; 14 trong đại hoàng ở Triều Tiên và 2; 3; 7->12; 14 cũng được tìm thấy trong đại hoàng Nhật Bản. 1.3.1.2. Phân tách galloysuccozo từ những cây đại hoàng ở Trung Quốc và Triều Tiên [20] Với phương pháp chạy sắc ký cột và phân tích cấu tạo dựa vào phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, các tác giả Yhoshiki Kashiwada, Gen-Ichiro Nonaka, Itsuo Nishika đã tìm được ra 5 chất Galloysuccozo [10]. STT R1 R2 R3 R4 R5 Tên 1 H H H H G 6’-O-monogalloysucorozo 2 H H H G H 6’-O-monogalloysucorozo 3 H G H H H 6’-O-monogalloysucorozo 4 H H G H H 6’-O-monogalloysucorozo 5 G H H H H 6’-O-monogalloysucorozo 1.3.1.3. Những thành phần hóa học chống vi khuẩn từ phần thân rễ của cây đại hoàng mang tên Rheum emodi [14] Rheum emodi là cây thuốc quan trọng được tìm thấy ở vùng Wealth của ấn Độ. K. Suresh Babu, P. V. Srinivas, B. Praveen, K. Hara Kishore, U. Suryanarayana Murty, J. Madhusudana Rao đã tách chiết xuất được 4 chất sạch có cấu trúc sau: 1.3.1.4. Phân tách những cytotoxic antraquinone từ cây đại hoàng (Rheum Pulmatuml L.) ở Indonesia. [21] Người ta phát hiện ra thành phần trong rễ của cây đại hoàng có tên khoa học là Rheum Pulmatuml L. được trồng ở Indonesia có khả năng chống bệnh ung thư da. Đó là những hợp chất cytotoxic và các tác giả Isao Kubo, Yoshihiro Murai. Iwang Soediro, Soediro Soetarno, Soelaksono Sastrođihardjo đã tách được: Pulmatin, chrysophanein, Physcionis, 4’-O-metypeiceid, rhapontin và cấu trúc của chúng đã được xác định bằng các phương pháp phổ 1H-NMR, 13C-NMR, UV, MS. STT R1 R2 R3 Tên 1 Glc H H Pulmatin 2 H Glc H Chrysophaein 3 H Glc OMe Physcionis STT R Tên 1 H 4’-O-metylpiceid 2 OH Rhapontin 1.3.1.5. Phân tách, tinh chế thành phần hóa học của cây đại hoàng (Rheum rhabarbarun) [22] Từ cây đại hoàng (Rheum Rhabarbarun) tại Đức các tác giả Jurgen Schmidt, Uwe Himmelreich, Gunter Adam đã dùng phương pháp tách chiết, phương pháp sắc ký ngược dòng, chạy bản mỏng …thu được 3 chất. Cấu trúc của chúng được xác định bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, IR, LC-MS. STT R1 R2 Tên 1 H H Lup-20(29)-en-2α,3β,28-triol 2 Ac Ac Lup-20(29)-en-2α,3β,28-triol-triaxetat 3 H Palmitoyl 3,28-di-palmitoyl-Lup-20(29)-en-2α,3β,28-triol 1.3.1.6. Sự phân tách những dẫn xuất của stinben từ cây đại hoàng ở Tây Ban Nha (Rheum palaestium) [23] Đại hoàng có tên khoa học là rheum palaestium có mặt ở Tây Ban Nha. Nó là cây thuốc lâu năm, thân dài từ 15-40 cm leo lên trên mặt đất, lá tròn to đường kính từ 20-50 cm, bề mặt lá nhăn. Hoa màu xanh nhạt, quả hình tam giác. Nó có tác dụng nhuận tràng, Tác giả: Talal A. Aburjai đã phân tách được 2 dẫn xuất của stinben từ phần gốc của thân cây. STT R R1 Tên 1 H H Trans-reveratrol-3-O- β-D-glucopyranozo 2 CH3 OH Rhapontisin 1.3.1.7. Phân tách và tinh chế hydroxyantraquinon và axit xinamic từ cây đại hoàng Trung Quốc (Rheum officinale Baill.) [24] Y học Trung Quốc phát hiện ra phần chiết xuất từ rễ cây đại hoàng được dùng làm thuốc chữa bệnh lỵ, bệnh tả, chứng tăng urê huyết, bệnh bạch cầu, ung thư phổi. Hợp chất có hoạt tính lớn trong cây là hydroxyantraquinon. Sắc ký ngược dòng với tốc độ cao (HSCCC) là một loại sắc ký cột của hệ chất lỏng - chất lỏng được phát minh bởi ITO. Trong công nghệ phân tách tiên tiến, nó được sử dụng rộng rãi để tách những hợp phần có hoạt tính từ những cây thuốc Trung Quốc và những sản phẩm tự nhiên khác. Ưu điểm của HSCCC có thể làm tinh khiết ankaloit, hydroxyantraquinon, flavononit, saponin... Nhóm chức của axit cacboxylic và các hydroxylphenol trong hydroxyantraquinon được xác định bằng tính chất đặc trưng là độ axit - bazơ. Các phân tử hydroxyantraquinon khác nhau thì có độ axit khác nhau, do đó chúng được phân tách bằng phương pháp sử dụng thang pH. Việc tinh chế được điều chỉnh từng bước theo thang pH bởi HSCCC chỉ tinh chế được 4 hydroxyantraquinon (emodi, aloe-amodin, chrysophanol và physcion) còn tinh chế rhein rất chậm. Với nghiên cứu gần đây, việc sử dụng thang pH vẫn được phát triển trong HSCCC. Điều chỉnh nhiệt độ trong điều kiện tốt nhất, các tác giả [15] đã phân tách được 5 hydroxyantraquinon và axit xinamic từ dịch chiết thô của cây đại hoàng: STT R1 R2 Tên 1 H COOH Rhein 2 CH3 OH Emodin 3 H CH2OH Aloe-emodin 4 H CH3 Chrysophanol 5 CH3 OCH3 Physcion 1.3.2. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây đại hoàng (Rheum sp.) *Cây đại hoàng thuộc loại cây thuốc của y học dân gian Việt Nam kết hợp với một số cây thuốc khác làm thang thuốc chữa được rất nhiều loại bệnh. Ở Việt Nam đã chiết xuất được axit chrysophanic từ cây đại hoàng (Rheum pulmatuml L.) để điều chế ra cream chrysophanic có khả năng chống nấm [6]. *Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc từ rễ cây đại hoàng (Rheum officinale Baill.) các nhà khoa học đã phân lập được 5 hợp chất hydroxyantraquinon có khả năng chống vi khuẩn: Rhein > emodin > aloe-emodin> chrysophanola> physicion. Trong đó emodi là tác nhân chống virus SARS [17]. 1.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC HOẠT TÍNH CỦA CÂY ĐẠI HOÀNG (Rheum sp.) [2] Trong cây đại hoàng có 2 chất có tác dụng trái ngược nhau là hợp chất thu liễm và hợp chất có tác dụng tẩy. 1.4.1. Loại hợp chất có tính thu liễm - Là hợp chất có tannin (rheotanno glucozit). Thành phần chủ yếu trong các rheotanno glucozit là glucogalin. Khi thủy phân glucogalin sẽ cho axit galic và glucoza. Ngoài ra còn có axit galic, catechin và tetrain. Khi tetrain chịu tác động của axit loãng sẽ cho glucozareosmin (rheomin), axit xinamic và axit galic. 1.4.2. Loại hoạt chất có tác dụng tẩy Reoantragucozit có các chất chủ yếu sau đây: Chrysophanol : C15H10O4 Aloe - emodin : C15H10O5 Rhein : C15H10O6 Emodin hay Rheum emodin : C15H10O5 Emodin - monometyl ete : C16H12O5 Tỉ lệ các antraglucozit toàn bộ trong cây đại hoàng vào chừng khoảng 2 - 4.5%, trong đó một phần tồn tại ở trạng thái tự do, một phần ở trạng thái kết hợp. Ở đại hoàng tươi (theo Wasicky và Hein) chỉ có antraglucozit ở dạng kết hợp. Chương 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là rễ của cây đại hoàng được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam. Mẫu được cung cấp bởi tiến sĩ Lê Thị Thu Nhạn - Viện Y học Cổ truyền Trung Ương vào tháng 7 năm 2006. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 2.1.2.1. Xác định tên khoa học của cây đại hoàng Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định cây đại hoàng nghiên cứu có tên khoa học là Rheum officinale Baill. và gọi là dược dụng đại hoàng. 2.1.2.2. Định tính các hợp chất có trong rễ cây đại hoàng. 2.1.2.3. Phân lập và nhận dạng một số cấu tử có trong rễ cây đại hoàng.Tách bằng phương pháp ngâm chiết, sắc ký cột, sắc ký lớp bản mỏng, tinh chế. Sử dụng một số phương pháp vật lý hiện đại để xác nhận cấu trúc hợp chất tách được. 2.1.2.4. Thử hoạt tính sinh học đối với một số chất phân lập được từ các dịch chiết. 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu + Sử dụng phương pháp ngâm chiết để tách chất khỏi rễ cây. + Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân tích, phân tách hỗn hợp và phân lập các hợp chất như: Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS), Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS), sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, tinh chế bằng dung môi... + Sử dụng các các phương pháp vật lý hiện đại để xác định công thức phân tử, công thức cấu tạo của các hợp chất như: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ 1H-NMR, 13C-NMR và 2D-NMR + Xác định hoạt tính sinh học đối với vi sinh vật kiểm định. 2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 2.2.1. Thiết bị + Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi đặt ở bộ môn Hóa hữu cơ. + Phổ hồng ngoại FT-IR ghi trên máy IMPACT-410 dưới dạng viên nén với KBr đo tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. + Sắc ký khí ghép khối phổ liên hợp GC- MS 196D + Thiết bị đo cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance 500 MHz (1H-NMR; 13C-NMR; DEPT; HMBC;HSQC). + Các kết quả đo được phân tích dựa theo các tài liệu [8], [15]. 2.2.2 Dụng cụ +) Sắc ký cột (Ø = 25mm, d=600mm), (Ø = 28mm, d=800mm) chất hấp phụ là silicagel (hãng Merck-60), kích thước hạt 40-60(µm). Hệ dung môi rửa giải là: n-hexan-etyl axetat, n-hexan-axeton tăng dần độ phân cực. +) Sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silicagel (Merck). Hệ dung môi dùng cho sắc ký lớp mỏng là n-hexan-etyl axetat, n-hexan-axeton, etyl axetat-metanol với tỉ lệ phù hợp để khả năng tách tốt nhất. +) Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm. 2.2.3. Hóa chất +) Dung môi: Metanol, n-hexan, etyl axetat (EtOAc), axeton, butanol... +) Thuốc hiện hình: Vanilin trong H2SO4 đặc. +) Hóa chất khác: H2SO4, NaOH, FeCl3 5%, bột Mg, dung dịch HCl đặc, dung dịch CH3COOH 5%, anhidrit axetic, thuốc thử Dragendorf... 2.3. THỰC NGHIỆM 2.3.1. Thu nhận dịch chiết Rễ cây sau khi thu mua được làm sạch và sấy khô ở 400C, đập nhỏ và ngâm chiết bằng metanol công nghiệp. Dịch thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn chiết tổng. Cặn chiết tổng được xử lý theo sơ đồ sau đây: Sơ đồ 2.1: Thu nhận các chiết phẩm từ mẫu khô. Mẫu khô Ngâm trong Metanol Dịch tổng 1.Cất đuổi dung môi 2.Lọc hút chân không Kết tủa A Dịch chiết B Chiết với nước và n-hexan Dịch nước 1 Cất đuổi dung môi Cặn n-hexan(C) Chiết với Clorofom Cất đuổi dung môi Cặn clorofom(D) Dịch nước 2 Chiết với etyl axetat Cất đuổi dung môi Cặn etyl axetat(E) Dịch nước 3 Chiết với Butanol Cất đuổi dung môi Cặn butanol(F) Dịch nước 4 Chúng tôi lấy 1kg mẫu khô, sau khi lấy được dịch tổng, cất quay chân không thu được dung môi và dịch cất quay (không cần đến khô kiệt). Để kết tinh, đem lọc hút chân không thu được dịch chiết B và 16,341 g kết tủa A. Đối với dịch chiết B: + Dịch chiết B đem chiết với nước và n-hexan (Vnước: Vn-hexan = 1:1) thu được dịch nước 1 và dịch n-hexan (chiết đến khi n-hexan không xuất hiện màu). + Dịch nước 1 đem đi chiết với clorofom (Vnước: Vclorofom = 1:1) thu được dịch nước 2 và dịch clorofom (chiết đến khi clorofom không xuất hiện màu). + Dịch nước 2 đem đi chiết với etyl axetat (Vnước: Vetyl axetat = 1:1) thu được dịch nước 3 và dịch etyl axetat (chiết đến khi etyl axetat không xuất hiện màu). + Dịch nước 3 đem đi chiết với butanol (Vnước: Vbutanol = 1:1) thu được dịch nước 4 và dịch butanol (chiết đến khi butanol không xuất hiện màu). 2.3.2. Định tính các lớp chất trong cặn chiết 2.3.2.1. Định tính Sterol Lấy 0,01 g cặn tổng thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thủy đến khô. Hòa tan cặn trong 3ml CHCl3, lấy dịch clorofom để làm phản ứng với các Sterol bằng thuốc thử Liebeman-Bourchardt (hỗn hợp gồm 1ml anhydrit axetic + 1ml clorofom để lạnh ở 00C sau đó thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử dung dịch xuất hiện màu xanh bền trong một thời gian là dương tính. 2.3.2.2. Phát hiện ankaloit Lấy 0,01 g cặn tổng thêm 5 ml H2SO4 5%, khuấy đều lọc qua giấy lọc, lấy vào ba ống nghiệm mỗi ống 1 ml nước lọc axit: Ống 1: 1-2 giọt dung dịch silicostungtich axit 5%, nếu có kết tủa trắng và nhiều là dương tính. Ống 2: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorf, xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. Ống 3: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính. Ở đây chúng tôi chỉ dùng thuốc thử Dragendorf. 2.3.2.3. Phát hiện Flavonoit Lấy 0,01 g cặn tổng thêm 10ml CH3OH đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thủy vài phút đến khi xuất hiện kết tủa màu đỏ nâu hoặc hồng là dương tính với Flavonoit. 2.3.2.4. Phát hiện Cumarin Dịch thử định tính chuẩn bị như mục 2.3.2.3. Lấy vào ống nghiệm mỗi ống 2ml dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ống không có kiềm có thể coi là dương tính. Nếu đem axit hóa ống có kiềm bằng một vài giọt axit HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong suốt mất màu vàng, xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính. 2.3.2.5. Định tính Saponin Chuẩn bị dịch thử như mục 2.3.2.3. Lấy 2ml dịch thử vào ống nghiệm rồi thêm 5ml nước cất. Bịt miệng ống nghiệm và lắc trong 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3-4 cm và bền vững 15 phút là có dấu hiệu dương tính. 2.3.2.6. Định tính Tanin Lấy 0,01 g cặn tổng thêm 10ml nước cất quấy đều cho tan, nhỏ 2-3 giọt FeCl3 5%, nếu xuất hiện màu xanh hoặc lục đen là dương tính. 2.3.2.7. Định tính glucozit trợ tim Phản ứng Keller-Kilial: thuốc thử gồm 2 dung dịch: Dung dịch 1: 100ml CH3COOH loãng + 1ml dung dịch FeCl3 5%. Dung dịch 2: 100ml H2SO4 đậm đặc + 1ml dung dịch FeCl3 5%. Cách tiến hành: Lấy 0,01 g cặn tổng cho vào ống nghiệm, thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết. Nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện màu đỏ nâu giữa các lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu đỏ nâu là phản ứng âm tính với các glucozit trợ tim, vì glucozit luôn luôn có mặt của các deoxysacarit. 2.3.3. Xử lý phần kết tinh A Phần kết tủa A rửa sạch, sấy khô với áp suất thấp ở khoảng 40oC thu được m = 16,341 g. Chúng tôi tiến hành kiểm tra chất kết tủa A trên sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi sau: + Hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 8:2 thì nhận thấy trên bản mỏng cho 7 chấm tròn với 6 chấm màu vàng có độ đậm nhạt khác nhau và có giá trị Rf là Rf x 100 = 75; 66; 63; 51; 49; 36. Một chấm phát hiện bằng đèn tử ngoại có giá trị Rf là Rf x 100 = 79. +Hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 1:1, chúng tôi không thu được chấm tròn nào. + Hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 9:1, chúng tôi thấy có những chấm màu không thể phân tách, chiếu bằng đèn tử ngoại thấy có một chấm sáng tách ra hẳn với những chấm màu với giá trị Rf là Rf x 100 = 88. Như vậy quá trình chiết tách được thực hiện theo sơ đồ 2.2: (Để thuận tiện chúng tôi ký hiệu n-hexan là