Protein Array Technology
• - Protein ñoùng vaitroø to lôùn trong caùcdöôïcphaåm
chuyeânbieät.
• Tuynhieân,
• - NghieâncöùuDNA -> Heädi truyeànvaøñieàuhoaøphieân
maõ, khoânghöôùngñeánvaitroø cuûa caùc Protein ñöôïc
bieåuhieän.
• - Ñieàu hoøaôûmöùcñoämRNA chælaømoätkhíacaïnhcuûa
quaùtrìnhñieàuhoaøsinhhoïctreâncôsôûñaùpöùngveàchöùc
naêngsinhhoïc.
• -Caùcprotein chöùcnaêngtrongmoätcôtheå>>> soágen.
• Ñeåhieåu ñöôïctaùcñoänggiöõavieäc bieåuhieän Protein vaø
moáiquanheähoåtöôngvôùichöùcnaêngcaànthi
85 trang |
Chia sẻ: Mr Hưng | Lượt xem: 1015 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang nội dung tài liệu Kỹ thuật phân tíchprotein theo phương pháp protein array protein array technology, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Kyõ thuaät Phaân tích Protein Theo
Phöông phaùp Protein Array
Protein Array Technology
Ñaïi Hoïc Noâng Laâm, TP. Hoà Chí Minh
Thaùng 10, 2007
Protein Array Technology
• - Protein ñoùng vai troø to lôùn trong caùc döôïc phaåm
chuyeân bieät.
• Tuy nhieân,
• - Nghieân cöùu DNA -> Heä di truyeàn vaø ñieàu hoaø phieân
maõ, khoâng höôùng ñeán vai troø cuûa caùc Protein ñöôïc
bieåu hieän.
• - Ñieàu hoøa ôû möùc ñoä mRNA chæ laø moät khía caïnh cuûa
quaù trình ñieàu hoaø sinh hoïc treân cô sôû ñaùp öùng veà chöùc
naêng sinh hoïc.
• - Caùc protein chöùc naêng trong moät cô theå >>> soá gen.
• Ñeå hieåu ñöôïc taùc ñoäng giöõa vieäc bieåu hieän Protein vaø
moái quan heä hoå töông vôùi chöùc naêng caàn thieát phaûi coù
nhöõng nghieân cöùu tröïc tieáp vaán ñeà naøy.
Protein Array Technology
Ñaëc ñieåm protein vaø heä thoáng bieåu hieän
• Protein ñöôïc hình thaønh coù nhieàu daïng caáu truùc vaø
nhieàu ñaëc tính chi phoái chöùc naêng cuûa chuùng.
• Caáu truùc khoâng gian 3 chieàu ñöôïc xaùc ñònh thoâng
qua caùc trình töï axit amin vaø caùc traïng thaùi xung
quanh.
• Caùc thay ñoåi trong quaù trình dòch maõ taùc ñoäng ñeán
söï gaén keát vaø chöùc naêng cuûa moät soá protein.
+ Söï Glycosyl hoùa aûnh höôûng ñeán tính tan, tuoåi thoï vaø
hoaït tính cuûa moät soá protein nhö khaû naêng cuûa
khaùng theå gaén vôùi boå theå.
+ Söï phosphoryl hoùa ñieàu hoøa caùc hoaït ñoäng enzyme
vaø cho pheùp xaûy ra caùc töông taùc pro-pro thoâng qua
caùc thuï theå nhaän bieát caùc phaân töû P.
+ Caùc thay ñoåi trong dòch maõ phuï thuoäc raát nhieàu vaøo
quaù trình bieåu hieän cuûa teá baøo chuû. Neáu moät protein
taùi toå hôïp ñöôïc bieåu hieän trong teá baøo vi khuaån
thöôøng khoâng ñöôïc Glycosyl hay Phosphoril hoaù,
nhöng teá baøo S. cerevisea laïi coù khaû naêng G-hoùa caùc
protein tieát ra töø teá baøo ñoäng vaät coù vuù.
Caùc protein caàu coù chöùa caùc phaàn kî nöôùc quay vaøo
beân trong vaø beân ngoaøi, neáu söû duïng caùc dung moâi
höõu cô hay caùc chaát coù tính chaát taåy röûa, caùc phaàn
kî nöôùc beân trong seõ quay ra ngoaøi, laøm maát hoaït
tính cuûa protein.
Vieäc taùi taïo laïi protein ñaõ bieán tính in vitro laø moät
coâng vieäc khoù khaên, ñoøi hoûi phaûi coù caùc phöông
phaùp linh hoaït vaø khoù ñaït ñöôïc trong ña soá tröôøng
hôïp.
----> Caàn thieát phaûi coù moät phöông phaùp thích hôïp
trong nghieân cöùu protein veà chöùc naêng cuõng nhö laø
moái töông quan veà caáu truùc.
Protein Array Technology
• Laø kyõ thuaät tieân tieán vaø hieäu quaû cao trong saøng
loïc söï bieåu hieän protein teá baøo.
• Coù theå duøng moät slide kính hieån vi hay caùc giaù
theå daïng haït coù chöùa maãu khaùc nhau.
• Nhuoäm slide hay haït ñeå phaùt hieän haøng ngaøn
bieåu hieän khaùc nhau trong cuøng moät böôùc phaân
tích töï ñoäng.
• Phaùt hieän: töông taùc Pro-Pro, khaùng nguyeân-
khaùng theå, Enzyme-cô chaát, DNA-Pro, Ligand-
receptor.
Protein Array Technology
Kyõ thuaät array ñöôïc aùp
duïng ñeå giaùm saùt cô cheá gen
noäi baøo vaø bieåu hieän protein.
DNA array: phaân tích di
truyeàn cuõng nhö bieåu hieän ôû
möùc mRNA.
Protein Array: phaân tích ôû
möùc ñoä protein vaø caùc töông
taùc.
Phaân tích so saùnh vaø ñònh löôïng Protein
Phaân tích so saùnh vaø ñònh löôïng Protein
• a) Phaân tích so saùnh genome vaø Proteome: caùc thaønh phaàn töông
töï cuûa protein töø nhieàu nguoàn khaùc nhau ñöôïc phaân laäp vaø phaân
tích. Caùc phaân töû ñöôïc ñaùnh daáu phaân bieät baèng ñoàng vò phoùng xaï
hay nhuoäm huyønh quang. Caùc phaân töû ñích ñöôïc ñaùnh daáu ñaïi dieän
cho caùc phenotype khaùc nhau trong hai maøu rieâng bieät. Söï khaùc
bieät veà trình töï hay bieåu hieän coù theå ñöôïc kieåm tra nhôø söï phaân
tích so saùnh khi söû duïng moät hoãn hôïp caùc phaân töû ñích ñöôïc ñaùnh
daáu khaùc nhau.
• b) Phaân tích ñònh löôïng ñoàng thôøi protein: Caùc protein ñöôïc ñaùnh
daáu fluorochrome coù theå ñöôïc phaùt hieän ñoàng thôøi theo kyõ thuaät
microarray. Caùc khaùng theå chuyeân bieät coá ñònh töông taùc vôùi caùc
protein ñích töông öùng vôùi chuùng coù trong dung dòch. Maät ñoä tín
hieäu coù ñöôïc töông öùng vôùi löôïng maãu ñöôïc gaén keát. Trong moãi
array, coù theå coù caùc ñieåm ñoái chöùng khaùc nhau, nhö chöùng döông
hay chöùng aâm, hoaëc caùc ñieåm hieäu chuaån. Ñieàu naøy cho pheùp ñònh
löôïng chính xaùc caùc tín hieäu.
Protein Array Technology
• Caùc ñaëc tính cuûa caùc vaät lieäu laø pha raén hay loûng
nhö ñieän tích, ñoä nhôùt, kích thöôùc loå maøng, pH, khaû
naêng keát noái chuyeân bieät hay khoâng chuyeân bieät. . .,
coù vai troø raát quan troïng trong vieäc taïo ra moät
protein array.
• Thaùch thöùc lôùn nhaát laø giöõ ñöôïc hoaït tính protein.
Ñieàu naøy ñöôïc giaûi quyeát deã daøng neáu gaén ñònh
höôùng protein leân moät vuøng coá ñònh, thoâng qua moät
vuøng chuyeân bieät (nhö histidin tag) vaø cho pheùp
vuøng hoaït tính hoaït ñoäng töï do thöïc hieän caùc töông
taùc.
Protein Array Technology
• Protein array thöôøng ñöôïc phaân tích vaø quan
saùt treân caùc thieát bò töï ñoäng hieän ñaïi. Thoâng
thöôøng laø caùc heä thoáng döïa treân nguyeân lyù gaén
keát. Söï gaén keát treân beà maët raén thöôøng khoâng
nhaïy caûm ñoái vôùi söï bieán ñoåi ñoä nhôùt cuûa maãu.
• Haàu heát caùc heä thoáng ghi hình aûnh cho Protein
Array laø döïa treân söï phaùt quang, söû duïng quaù
trình ñaùnh daáu tröïc tieáp leân ligand hay giaùn tieáp
thoâng qua caùc khaùng theå ñöôïc ñaùnh daáu.
Caùc phaân töû gaén keát duøng trong phaân tích protein array
Ñeå phaân tích caùc töông taùc
chuyeân bieät, nhieàu loaïi phaân töû
ñöôïc coá ñònh treân beà maët phaúng
ñeå phaûn öùng nhö laø caùc phaân töû
gaén keát.
a) Töông taùc khaùng nguyeân- khaùng theå.
b) Mieãn dòch Sandwich.
c) Töông taùc pro-pro.
d) Caùc phaân töû aptamer toång hôïp.
e) Enzyme-Cô chaát: cô chaát cho kinase
ñöôïc coá ñònh vaø ñöôïc phosphoryl hoùa
nhôø Kinase.
f) Thuï theå-ligand: hôïp chaát toång hôïp coù
phaân töû thaáp ñöôïc coá ñònh nhö laø phaân
töû gaén keát.
Taïi sao söû duïng kyõ thuaät naøy?
• 1. Löôïng maãu caàn ít:
–Moät soá maãu raát hieám: beänh phaåm, huyeát thanh
chuoät..
2. Löôïng thoâng tin thu nhaän ñöôïc raát lôùn töø moät
maãu:
- Giaûm ñaùng keå caùc thí nghieäm.
- Thu ñöôïc toaøn boä thoâng tin töø moät thí nghieäm phaân
tích.
3. Giaûm löôïng hoùa chaát söû duïng, nhaân coâng
4.Taïo ra ñöôïc nhieàu thoâng tin hoå töông giöõa caùc
chaát caàn phaân tích.
Kyõ thuaät Luminex Bead-based
• Heä thoáng hoaït ñoäng nhö theá naøo?
• - Phaûn öùng xaûy ra treân beà maët cuûa caùc haït
polystyrene.
• - Moãi haït được nhuộm với hai loaïi thuoác nhuoäm coù
chöùa noàng ñoä khaùc nhau: ñoû vaø hoàng ngoaïi
• - Haøng traêm haït ñöôïc ñaùnh daáu maøu rieâng: moãi
maøu ñöôïc duøng cho moät phaûn öùng rieâng bieät.
• Æ DÖÏA TREÂN MAØU CUÛA CAÙC HAÏT.
Kyõ thuaät Luminex Bead-
based
• Heä thoáng hoaït ñoäng nhö theá
naøo?
• - Phaûn öùng xaûy ra treân beà
maët cuûa caùc haït
polystyrene.
Kyõ thuaät Luminex Bead-based
• Heä thoáng hoaït ñoäng nhö theá
naøo?
• - Moãi haït coù chöùa noàng ñoä
khaùc nhau cuûa hai loaïi thuoác
nhuoäm: ñoû vaø hoàng ngoaïi
• - Haøng traêm haït ñöôïc ñaùnh
daáu maøu rieâng: moãi maøu ñöôïc
duøng cho moät phaûn öùng rieâng
bieät.
• Æ DÖÏA TREÂN MAØU CUÛA
CAÙC HAÏT.
Kyõ thuaät Luminex Bead-based
vaø Kyõ thuaät ELISA thoâng thöôøng
• Kyõ thuaät ELISA thoâng
thöôøng phaân tích cuøng
luùc treân nhieàu gieáng moät
chæ tieâu.
• Ñöôïc thöïc hieän treân caùc
plaque 96 gieáng.
Kyõ thuaät Luminex Bead-based
vaø Kyõ thuaät ELISA thoâng thöôøng
• Kyõ thuaät Bead Arrays cho
pheùp phaân tích cuøng luùc
nhieàu chæ tieâu treân cuøng
moät gieáng hay moät oáng
nghieäm.
• Ñöôïc thöïc hieän treân caùc
haït nhuoäm maøu coù gaén keát
caùc thuï theå ñaëc hieäu.
Kyõ thuaät Luminex Bead-
based
• Kyõ thuaät Bead Arrays
duøng caùc haït ñöôïc maõ hoùa
bôûi maøu baèng caùch söû duïng
moät daõy caùc tín hieäu huyønh
quang khaùc nhau cuûa hai
maøu nhuoäm.
Kyõ thuaät Protein Array
100 maøu ñaùnh daáu = 100 pheùp thöû ñoàng thôøi
Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array
(Bead-based assay)
Söû duïng moät loaïi haït hình caàu (hay slide) ñeå xaùc ñònh
ñoàng thôøi nhieàu phaûn öùng trong cuøng moät oáng nghieäm
hay gieáng nhoû coù chöùa maãu.
Böôùc ñaàu tieân:
- Taùc nhaân doø ñöôïc gaén treân beà
maët cuûa caùc haït polystyrene.
- Bio-Plex söû duïng khaùng theå
(antibody), Oligonucleotides.
laøm taùc nhaân doø
Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array
(Bead-based assay)
Sau ñoù troän laãn taát caû
caùc loaïi haït vôùi nhau:
-Moãi haït maøu ñöôïc gaén loaïi
taùc nhaân doø khaùc nhau.
- Ñaây goïi laø Multiplexing.
Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array
(Bead-based assay)
Gaén keát vôùi caùc phaân töû doø vôùi maãu baèng caùch troän
vôùi maãu caàn phaân tích
Böôùc thöù hai:
- Troän caùc haït coù ñaàu doø vôùi
maãu.
- Caùc maãu ñích seõ gaén vôùi
ñaàu doø vaø ñöôïc ñính treân caùc
haït.
Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array
(Bead-based assay)
Böôùc thöù ba:
- Boå sung maãu doø thöù
hai đặc hiệu coù gaén ñuoâi
(tag) huyønh quang.
Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array
(Bead-based assay)
Böôùc thöù tö:
Phaùt hieän caùc haït trong
doøng löu chaát qua heä
thoáng ñoïc keát quaû (Array
Reader)
Moät heä löu chaát cho pheùp
caùc haït ñi qua trình töï, vaø
ñi qua caùc aùnh saùng laser.
vaø phaùt hieän treân doøng chaûy
Phaùt hieän qua Flow fluorescence
- Caùc haït ñöôïc ñöa vaøo dung dòch loûng
- Töøng haït ñöôïc chaïy qua aùnh saùng Laser
- AÙnh saùng phaân taùn vaø phaùt ra huyønh
quang.
- AÙnh saùng huỳnh quang ñöôïc haáp thu vaø loïc.
- Tín hieäu saùng ñöôïc chuyeån thaønh giaù trò soá
hoïc.
- Löu tröõ treân maùy tính.
Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array
(Bead-based assay)
Phaùt hieän: Tags ñöôïc
kích thích
- Döõ lieäu ñöôïc thu thaäp laø
Ñoä nhaïy huyønh quang
(Fluorescent Intensity-FI)
- Ñoä nhaïy cuûa tín hieäu
bieåu thò cho löôïng maãu
ñích coù trong maãu.
Kyõ thuaät Bio-Plex Protein Array
(Bead-based assay)
Phaùt hieän: Caùc chaát
nhuoäm coù trong haït caàu
ñöôïc kích thích.
- Soá löôïng cuûa moãi thuoác
nhuoäm ñöôïc ñònh löôïng.
- Caùc haït ñöôïc ñöa vaøo caùc
vuøng khaùc nhau döïa treân
maøu (Classification).
-Moãi keát quaû huyønh quang
cuûa haït ñöôïc phaân loaïi
(Classification).
Kyõ thuaät Protein Array
100 maøu ñaùnh daáu chæ laø böôùc khôûi ñaàu
Neáu söû duïng 3, 4, 5, maøu ???
Thu thaäp döõ lieäu
• Array Reader (Bio-Plex Reader) thu nhaän döõ
lieäu:
• - Döõ lieäu ñöôïc chuyeån sang daïng baûng Excel.
• - Bao goàm döõ lieäu phaân tích vaø döõ lieäu xaùc nhaän
tính chính xaùc.
Kỹ thuật BioPlex
và các kỹ thuật truyền thống
• Hiện nay kỹ thuật Bio-Plex assays dùng nguyên lý mễn dịch,
tương tự như ELISA để giảm thiểu khả năng phản ứng chéo bởi
vì để phát hiện kháng thể thừ 2 phải nhận biết được epitope thứ
hai trên target.
• Vì vậy kỹ thuật Xmap bead assays chuyên biệt hơn các kỹ thuật
phương pháp bắt giữmột kháng thể đơn (Westerns)
Kỹ thuật BioPlex
và các kỹ thuật truyền thống
• Tuy nhiên kỹ thuật xMAP có độ khỏang hoạt động lớn hơn kỹ
thuâậ ELISA rất nhiều.
• Và có thể phân tích đến hàng trăm chỉ tiêu cùng lúc trong một
mẫu trên một ống nghiệm.
Bio-Plex là kỹ thuật Multiplex ELISA
• N/c các đáp ứng viêm nhiễm (cytokine research)
• Cho phép phát hiện cùng lúc hàng trăm chỉ tiêu trong
cùng một giếng mẫu.
• Cần lượng mẫu bệnh phẩm ít hơn
• Khỏang họat động rộng
• Gia tăng độ nhạy
Bio-Plex là kỹ thuật Multiplex Western Blot
• Cho phép phát hiện cùng lúc hàng trăm chỉ tiêu trong
cùng một giếng mẫu.
• Độ lập lại cao
• Không cần nhiều mẫu
• Chuyên biệt cao hơn Western Blot
Kyõ thuaät Protein Array
• CAÙC ÖÙNG DUÏNG TRONG NGHIEÂN CÖÙU:
• 1. Laäp hoà sô bieåu hieän Protein (Protein Expression Profile)
– Truyeàn tín hieäu trong teá baøo.
– Phaùt hieän tín hieäu Cytokine noäi vaø ngoaïi baøo.
2. Nghieân cöùu caùc thay ñoåi sau dòch maõ (Postranslational
modifications)
– Quaù trình phosphoryl hoùa.
3. Ñònh löôïng protein.
4. Xét nghiệm các bệnh, SNPs, đột biến, marker ung thư
.
Kyõ thuaät Protein Array
• THIEÁT BÒ HIEÄN ÑAÏI
DUØNG TRONG
PROTEIN ARRAY
Bio-Plex Workstation
Bio-PlexWorkstation
1. Protein Array reader
- Ñöôïc xaùc ñònh ñoä chính xaùc vôùi coâng cuï Validation.
2. Microplate Platform
3. Maùy tính
- Pentum 4, windows 2000, office 2000, XP, XP pro
- Maøn hình phaúng NEC
4. Heä thoáng HTS (High Throughput fluidics)
5. Thanh load maãu
6. Ñóa MCV (Maintenance, Calibration, Validation)
Bio-Plex Workstation
6. Ñóa CMV
- Ñóa chuyeân duïng ñaëc bieät 96 gieáng
- Duøng cho baûo döôõng, hieäu chuaån, xaùc nhaän ñoä
chính xaùc ñònh kyø
Moät soá öùng duïng thöïc teá cuûa
Protein Array Technology
1. Genomics
2. Proteomics
3. Chaån ñoaùn laâm saøng (Clinical diagnostics)
Moät soá öùng duïng thöïc teá cuûa
Protein Array Technology
1. Genomics
-Xaùc ñònh kieåu di truyeàn (Genotyping)
* Ña hình (Gene polymorphism)
* Ñoät bieán gene (Gene mutation)
-Bieåu hieän gene (Gene expression)
* Chæ thò beänh (Disease markers)
*Quaù trình phaùt trieån (Developmental Processes)
* Ñieàu hoøa gene (Gene regulation)
Moät soá öùng duïng thöïc teá cuûa
Protein Array Technology
2. Proteomics
-Laäp hoà sô protein (Protein profiling)
* Multiplex Cytokine assays: cell culture, serum, plasma, hay
dòch trích töø moâ, coù ñoâ nhaïy vaø chuyeân bieät töông ñöông ELISA.
-Caùc thay ñoåi sau dòch maõ (Posttranslational modifications)
* Protein truyeàn tín hieäu (Signal transduction proteins)
-Töông taùc vaø chöùc naêng protein (Protein function and interaction)
* Gaén keát thuï quan vaø ligand
* Hoaït tính enzyme
* Töông taùc Protein-Protein
* Epitope mapping
Moät soá öùng duïng thöïc teá cuûa
Protein Array Technology
3. Chaån ñoaùn laâm saøng (Clinical diagnostics)
-Chaån ñoaùn phaân töû (Molecular diagnostic)
* Kieåu di truyeàn SNP (SNP Genotyping)
* Phaùt hieän caùc ñoät bieán gaây beänh (Detection of diseases-related
mutations)
* Kieåm tra HLA (HLA testing)
-Mieãn dòch chaån ñoaùn multiplex (Multiplex diagnostic immunoassays)
* Laäp ngaân haøng maùu (Blood banking)
* Kieåm tra caùc beänh laây nhieãm (Infectious disease testing)
* Kieåm tra hieäu löïc vaccine (Vaccine efficacy testing)
* Kieåm tra töï mieãn dòch (Autoimmune testing)
* Kieåm tra dò öùng (Allergic testing)
* Phaùt hieän caùc chæ thò sinh hoïc (Biomarker detection)
Bio-Plex Protein Assays
• 1. Cytokine Assays
• 2. Phosphoprotein Assays
• 3. HLA Testing
• 4.
Bio-Plex Cytokine Assay
• Cytokine:
• - Nhoùm roäng caùc protein vaø peptide tan coù lieân quan
ñeán quaù trình ñieàu hoøa heä mieãn dòch.
• - Coù raát ít trong cô theå picogam/ml.
• - Ñöôïc tieát ra do moät soá teá baøo nhaát ñònh (do stress)
vaø gaây neân moät soá bieán ñoåi trong teá baøo khaùc
(imflammation-söï vieâm nhieãm).
• - ÔÛ möùc ñoä naøo ñoù, Cytokine raát gioáng hormon nhöng
hormon chæ taùc ñoäng teân teá baøo chuyeân bieät, coøn Cyt.
coù aûnh höôûng treân nhieàu teá baøo khaùc nhau.
Bio-Plex Cytokine Assay
• Hai lyù do ñeå quan taâm ñeán Cytokine:
• 1. Hieåu cô cheá caùc beänh (nhö chöùng thaáp khôùp. . .).
• 2. Hieåu caùc taùc ñoäng cuûa caùc taùc nhaân beân ngoaøi
(lieäu phaùp thuoác) leân caùc teá baøo ñích ñeå ñaûm baûo
phaûn öùng inflammatory khoâng xaûy ra.
Bio-Plex Cytokine Assay
Ñöôïc thieát keá ñeå xaùc ñònh ñònh löôïng nhieàu loaïi
Cytokine
Coù trong huyeát thanh, dòch nuoâi caáy teá baøo.
Coù theå profile möùc ñoä ña daïng cytokine trong voøng 3
giôø
Duøng kyõ thuaät kieåm tra treân ñóa 96 gieáng
12µl huyeát thanh hay 50µl dòch nuoâi caáy teá baøo
Nguyeân lyù
Bio-PlexCytokine Assays
Laøm theá naøo thöïc hieän?
1. Hoaøn nguyeân maãu chuaån ñeå xaây döïng ñöôøng chuaån
2. Cho caùc bead, chuaån vaø maãu caàn phaân tích vaøo ñóa
96 gieáng.
3. UÛ, röûa vaø boå sung khaùng theå phaùt hieän
4. UÛ, röûa vaø boå sung streptavidine-phycoerythrin, röûa
5. Ñoïc keát quaû treân heä thoáng Array Reader.
Cytokine Assay vs. ELISA
1. Nguyeân lyù töông töï nhö ELISA
- ELISA, khaùng theå gaén keát coá ñònh treân ñaùy cuûa
ñóa.
- Bio-Plex, treân haït polystyrene trong dung dòch.
2. Khaùc nhau trong phaùt hieän
- ELISA, duøng enzyme coäng hôïp ñeå phaùt hieän
khaùng theå vaø cô chaát laø dung dòch phaûn öùng.
- Bio-Plex, ñuoâi huyønh quang treân Streptavidine,
phaùt huyønh quang tröïc tieáp. Khoâng coù cô chaát vaø
yeâu caàu khoâng coù caùc taùc duïng phuï töø cô chaát
Cytokine Assay vs. ELISA
3. Cytokine Assay cho nhieàu keát quaû hôn
- Ñoä nhaïy töông ñöông hay cao hôn
- Keát quaû tin caäy hôn
* Huyønh quang tröïc tieáp
* ELISA duøng enzyme vaø cô chaát, töøng cô chaát
trong moãi laàn saûn xuaát????
- Moãi maãu ñöôïc thöïc hieän nhieàu laàn, duøng ít maãu
vôùi Bio-Plex ñeå coù keát quaû mong muoán
Cytokine Assay vs. ELISA
3. Cytokine Assay töông ñoàng vôùi ELISA
- Keát quaû töông töï nhöng khoâng gioáng hoaøn toaøn
* ELISA khaùc nhau theo töøng lot, do moãi
khaùng theå laø khaùc nhau.
* Bio-Plex cuõng laø moät phöông phaùp kieåm döïa
treân khaùng theå nhöng coù ñoä tin caäy cao khi coù caùc
coâng cuï calibration vaø validation.
Bio-Plex Cytokine Assay
Ñöôïc thieát keá ñeå xaùc ñònh löôïng nhieàu loaïi Cytokine
coù trong huyeát thanh, dòch nuoâi caáy teá baøo.
Coù theå profile möùc ñoä ña daïng cytokine trong voøng 3
giôø
Duøng kyõ thuaät kieåm tra treân ñóa 96 gieáng
12µl huyeát thanh hay 50µl dòch nuoâi caáy teá baøo
Bio-Plex
Phosphoprotein Assays
• Pheùp kieåm caùc protein bò
Phosphoryl hoùa
Bio-Plex
Phosphoprotein Assays
1. Caùc phöông phaùp coå ñieån
- Kieåm tra caùc enzyme kinase in vitro
* Immunoprecipitation (keát tuûa mieãn dòch?)
* ñaùnh daáu phoùng xaï P32
* SDS-PAGE
- Western Blot
2. Kyõ thuaät hieän ñaïi (Multiplex)
- Bio-Plex Protein Array system
Bio-Plex
Phosphoprotein Assays
• Quaù trình phosphoryl hoùa ñoùng vai troø quan
troïng trong con ñöôøng truyeàn tín hieäu ôû nhieàu
möùc ñoä khaùc nhau, töø vieäc hoaït hoùa caùc thuï theå
beà maët ñeán vieäc hoaït hoùa caùc yeáu toá phieân maõ.
• Trong nghieân cöùu quaù trình truyeàn tín hieäu noäi
baøo, ñieàu quan troïng laø phaùt hieän ñöôïc tình
traïng phosphoryl hoùa cuûa caùc protein ñích, coù
lieân quan tröïc tieáp ñeán hoaït tính cuûa chuùng.
Bio-Plex
Phosphoprotein Assays
Khi quan taâm ñeán quaù trình truyeàn tín hieäu:
- quan taâm ñeán vieäc laøm theá naøo caùc phaân töû
töông taùc vôùi nhau trong vaø ngoaøi teá baøo,
- ñeå phaùt hieän ñieàu gì kích thích hay öùc cheá chöùc
naêng cuûa protein, vaø
- ñeå ñuùc keát laïi raèng laøm theá naøo maø caùc phaân töû
ñöôïc keát noái trong caùc con ñöôøng truyeàn tín
hieäu.
Bio-Plex
Phosphoprotein Assays
Kinase:
- Moät nhoùm protein tín hieäu coù beân trong teá baøo
- >500 kinase ñaõ ñöôïc khaùm phaù ñeå maõ hoùa cho boä gene
ngöôøi
- Khi K nhaän ñöôïc tín hieäu kích thích töø phaân töû tröôùc ->
hoaït hoùa->phosphoryl hoùa protein tieáp theo. Ñieàu naøy gaây
neân “doøng thaùc” caùc töông taùc phaân töû beân trong teá baøo.
=> Cô cheá naøy coù lieân quan ñeán haàu heát caùc maët trong sinh
lyù teá baøo bao goàm caû taêng tröôûng, bieät hoùa vaø söï cheát cuûa
teá baøo.
Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa
Moãi TKR coù moät ñuoâi kinase (phosphoryl
hoùa protein treân tyrosine), moät ñaàn gaêùn
hormon, vaø moät ñoaïn coù ñuoâi carboxyl coù
nhieàu tyrosines ñeå töï phosphoryl hoùa
Khi hormon gaén vaøo phaàn beân ngoaøi teá
baøo, caùc thuï theå seõ tuï taäp laïi.
Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa
Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa
Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa
Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa
Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa
Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa
Cô cheá cuûa söï Phosphoryl hoùa
Bio-Plex
Phosphoprotein Assays
Caùc baát thöôøng trong truyeàn tín hieäu gaây neân nhieàu
loaïi beänh nhö ung thö, imflammatory.
-> Caàn nghieân cöùu caùc aûnh höôûng cuûa quaù trình
phosphoryl hoùa.
Coù theå ño ñöôïc laøm theá naøo moät tín hieäu ñöôïc chuyeån
töø moät K cho moät phaân töû khaùc.
Nhu caàu thöïc teá laø toái ña hoùa thoâng tin thu nhaän ñöôïc
töø moät maãu
⇒CaÀn thieát giaùm saùt laøm theá naøo coù nhieàu K ñaùp
öùng vôùi moät kích thích hay öùc cheá trong cuøng moät maãu
Bio-Plex
Phosphoprotein Assays
• Nguyeân lyù
Haït gaén keát khaùng theå coäng
hôïp ñöôïc uû vôùi dòch trích teá baøo
Protein gaén keát treân haït ñöôïc uû
vôùi khaùng theå phaùt hieän chuyeân
bieät cho biotinylate-phospho
Phöùc hôïp mieãn dòch ñöôïc ñöôïc
ñaùnh daáu vôùi streptavidin-PE
vaø ñöôïc phaùt hieän bôûi heä thoáng
Bio-Plex
Bio-Plex
Phosphoprotein Assays
• Phöông phaùp
Raát gioáng Cytokine assay
- Phospho ñöôïc uû qua ñeâm
* thôøi gian daøi hôn!
- Phospho khoâng coù chuaån ñeå hoøa tan hay kieåm chöùng
* Khoâng coù ñöôøng cong ñònh löôïng nhö ôû Cytokine
* Tính theo tæ leä vaø theo nhoùm treân ñóa ñaõ caøi ñaët
Bio-Plex
Phosphoprotein Assays
Xét nghiệm HLA Human Lymphocyte Antigens
• HLA là một hệ thống chỉ thị được tìm thấy trong
hầu hết các tế bào trong cơ thể trợ giúp cho hệ
miễn dịch trong quá trình nhận dạng các kháng
thể tự thân và không tự thân.
• Các gene mã hóa cho HLA được tìm thấy trong
vùng gene nằm trên cánh ngắn của
Chromosome số 6. Sự khác biệt trên các gene
này chính là tính đa hình đại diện cho hàng
ngàn bắt cặp của các allele.
Xét nghiệm HLA Human Lymphocyte Antigens
• HLA được kiểm tra dựa trên huyết thanh học
bằng cách xác định các kháng nguyên tương
tác với các kháng thể đã biết.
• Các phương pháp trước kia sử dụng các đọan
đa hình giới hạn, nhưng kể từ khi kỹ thuật PCR
ra đời đã nhanh chóng thay thế.
• Thuận lợi của kỹ thuật phân tử đã cung cấp một
cách nhìn ở mức độ DNA phân tử để xác định
các mã di truyền của HLA.
HLA Typing bằng chẩn đoán phân tử
• Cải thiện tính ổn định của mẫu xét nghiệm vì không
cần thiết phải có các lymphocyte nguyên vẹn.
• Gia tăng độ chính xác: rất ít các antigens bị mất đi
hay xác định nhầm (mistyped) hay cho kết quả
không rõ ràng.
• Cho kết quả tốt đối với các lọai HLA khó: Các xét
nghiệm dùng các hóa chất tổng hợp và có thể phát
hiện đựơc trong trường hợp có các antisera hiếm.
• Gia tăng tính lập lại giữa các thí nghiệm
• Kiểm tra chất lượng tốt hơn: Các mẫu chuẩn DNA
được dùng trong thống kê tính chính xác.
Xét nghiệm HLA bằng kỹ thuật phân tử trên hệ thốngBio-Plex
• Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sinh
học phân tử khác.
• Sử dụng kỹ thuật Tem-PCR (Target Enriched
Multiplex PCR và kỹ thuật xMAP để phát hiện
đồng thời hàng trăm HLA đích trên cùng một
phản ứng.
Các thuận lợi của xét nghiệmHLA trên hệ thống Bio-Plex
• Multiplexing: Trong mỗi lần xét nghiệm chỉ cần sử dụng
một lượng rất nhỏ mẫu bệnh phẩm nhưng cho phép
phát hiện đến 100 chỉ tiêu.
• Nhanh chóng: Toàn bộ xét nghiệm có thể hoàn tất trong
trong thời gian < 3 giờ, một kỹ thuật viên có thể làm
hàng trăm mẫu/ ngày.
• Chuyên biệt và độ nhạy cao: Sự kết hợp của 2 kỹ thuật
PCR và xMAP làm gia tăng vượt trội tính chuyên biệt và
độ nhạy trong phát hiện.
• Giảm giá thành trên mỗi test: Nhân lực và hóa chất
giảm đáng kể nhờ khả năng phát hiện hàng loạt và hệ
thống tự động.
SNP site
Ligase
Capture Probe Reporter
Probe
A
T T
T
Oligonucleotide Ligation Assay (OLA)
ZipCode
cZipCode
Spacer
DNA polymerase
Capture Probe 1 labeled ddNTP
3 unlabeled ddNTPs
ZipCode
cZipCode
Spacer
SNP site
A
T
A
G
C
T
T
The labeled base that is
incorporated identifies SNP
Single Base Chain Extension (SBCE) / Minisequencing
Capture Probe
DNA polymerase
1 labeled dNTP
3 unlabeled dNTPs
ZipCode 1
ZipCode 2
cZipCode 1
cZipCode 2
Spacer
SNP site
A
T
C C
T
C
T
Allele-Specific Primer Extension (ASPE)
The capture probe has specificity
for SNP site; no basepair match
at the last base Æ no extension
Protein Array Technology
• Kieán thöùc caàn nhôù!
• Things to remember!
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- proteinarraytechnologyk06_6929.pdf