Khảo sát tái sắp xếp 11q23 trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho b tại bệnh viện truyền máu huyết học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Huyết Học 237 KHẢO SÁT TÁI SẮP XẾP 11q23 TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP   DÒNG LYMPHO B TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC  Nguyễn Tấn Bỉnh*  TÓM TẮT  Đặt vấn  đề: Khảo sát tái sắp xếp (TSX) nhiễm sắc thể (NST) 11q23 trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng  lympho B (BCCDL‐B).   Phương pháp: Ứng dụng kỹ thuật  lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) với probe LSI MLL dual color,  break apart rearrangement để phát hiện bất thường NST 11q23 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ tháng  10/2012 đến 10/2013.  Kết quả: Trong 76 bệnh nhân được khảo sát, 6 bệnh nhân (7,89%) có TSX NST 11q23. Khi so sánh với kết  quả của RT‐PCR và NST đồ thì 5 bệnh nhân (6,58%) có chuyển vị t(4;11)(q21;q23) và trường hợp còn lại là tái  sắp xếp của NST 11q23 với NST khác ngoại trừ NST 4.  Kết luận: Kỹ thuật FISH với các đoạn dò đặc hiệu giúp phát hiện TSX NST 11q23 một cách nhanh chóng,  chính xác, giúp thêm dữ liệu cho việc phân nhóm nguy cơ và định hướng điều trị cho bệnh nhân BCCDL‐B.  Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng lympho B, FISH, tái sắp xếp NST 11q23.  ABSTRACT  DETECTION OF 11q23 REARRANGEMENT IN B CELL ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA  PATIENT AT BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL  Nguyen Tan Binh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 237 ‐ 241  Objective:  To  detect  chromosome  11q23  rearrangement  in  patients  with  B  cell  acute  lymphoblastic  leukemia.  Methods: The  fluorescent  in situ hybridization  (FISH)  technique with probe LSI MLL dual color, break  apart  rearrangement was  used  to  detect  chromosomal  abnormalities  of  11q23  at The Blood Transfusion  and  Hematology Hospital from October 2012 to October 2013.  Results:  Among  76  patient  samples  were  analyzed,  6  patients  (7.89%)  had  chromosome  11q23  rearrangement. Comparing with  the  result of RT‐PCR and karyotype, 5  cases  (6.58%) were  t(4;11)(q21;q23)  translocation  and  the  remaining  patient  was  translocation  of  11q23  with  other  chromosomes  except  for  chromosome 4 .  Conclusion:  The  interphase FISH with  specific  probes  can  detect  the  rearrangement  of  chromosome  11q23 quickly and exactly. The result of this study can give more data for risk classification in B cell acute  lymphoblastic leukemia.  Keywords: acute lymphoblastic leukemia, FISH, 11q23 rearrangement.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) là bệnh  lý  ác  tính  của  hệ  tạo máu  chiếm  khoảng  1/3  trong các loại bệnh ung thư ở trẻ em, gồm có hai  thể  là  BCCDL‐B  và  BCCDL‐T(1).  Trong  đó,  BCCDL‐B chiếm ưu thế với gần 90% trường hợp  được  chẩn  đoán BCCDL. BCCDL xuất phát  từ  một  tế  bào  tiền  thân  của  dòng  lympho  với  những  thay  đổi  gen  chuyên  biệt  dẫn  tới  sự  chuyển dạng  ác  tính và  tăng  sinh không kiểm  soát. Do  đó,  đánh  giá  tiên  lượng  BCCDL  dựa  * Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: PGS.TS.BS. Nguyễn Tấn Bỉnh   ĐT: 0913769173   Email: nguyentanbinhmd@gmail.com Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Nội Khoa 238 vào di  truyền học góp  thêm 1 dữ  liệu đáng  tin  cậy để lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp. Hơn  75%  trường  hợp  BCCDL  được  đánh  giá  tiên  lượng hay phân nhóm điều trị và theo dõi điều  trị dựa  trên số  lượng NST, các kiểu  tái sắp xếp  (TSX) nhiễm sắc  thể  (NST) chuyên biệt hay các  thay  đổi  di  truyền  ở  mức  độ  phân  tử  như  t(12;21),  t(9;22),  t(1;19),  t(4;11),  t(8;14),  t(8;22) và  t(2;8) tạo ra các tổ hợp gen TEL/AML1, BCR/ABL,  E2A/PBX1,  MLL/AF4,  cMYC/IgH,  cMYC/IgL  và  IgK/cMYC  tương  ứng  và  các  bất  thường  khác  liên quan đến 11q23(2). Các rối loạn phân tử quan  trọng trên lâm sàng ở BCCDL‐B giai đoạn tiền tế  bào B bao gồm BCR/ABL, TEL/AML1, E2A/PBX1  và các TSX gen MLL  (11q23) và các bất  thường  NST này rất có ý nghĩa trong tiên lương và điều  trị(6,9,).  Bất thường liên quan đến 11q23 được nhận  thấy có hơn 30 chuyển đoạn khác nhau, được  tìm  thấy  trên bệnh BCCDL precursor‐B, bạch  cầu cấp dòng tủy, hội chứng loạn sinh tủy, vài  trường hợp BCCDL‐T, và  trong bệnh ung  thư  máu  thứ  phát(1,7).  Chuyển  vị  t(4;11)  chiếm  khoảng 50‐70% những ca BCCDL nhũ nhi, và  khoảng  5%  những  ca  trẻ  em  và  người  lớn(5).  Một số  tác giả  thấy  trong các bất  thường  liên  quan  đến  11q23  thì  t(4;11)  là  xấu  nhất,  còn  Katz thấy tất cả bệnh nhân có bất thường  liên  quan 11q ở trẻ em dưới 11 tuổi đều tiên lượng  xấu,  tái  phát  sớm  và  có  xâm  lấn  thần  kinh  trung ương(2). Các tác giả như Negrin, Larson,  Hoffbrand đều cho rằng những bệnh nhân có  t(4;11)  là những bệnh nhân có  tiên  lượng xấu  trong điều trị hóa chất và có chỉ định ghép tủy  xương  nhưng  phải  ghép  ngay  đợt  lui  bệnh  đầu(3).  Bên  cạnh  đó,  theo  Young  và  Godley,  bệnh nhân BCCDL  có  chuyển  đoạn  t(4;11)  có  tiên  lượng xấu với  tỷ  lệ đáp ứng điều  trị ban  đầu cao nhưng thời gian lui bệnh ngắn dưới 1  năm(10).  Hiện nay, có 3 kỹ  thuật  được  sử dụng  để  phát hiện các bất  thường  liên quan đến 11q23  là NST đồ, lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH)  và PCR.Trong 3 kỹ thuật thì PCR là kỹ thuật có  độ nhạy cao nhưng chỉ có  thể phát hiện được  tổ  hợp  gen MLL/AF4  tương  ứng  với  t(4;11).  NST  đồ  và  FISH  thì  có  thể  giúp  phát  hiện  nhiều kiểu chuyển  đoạn khác nhau  liên quan  đến  11q23  nhưng  FISH  thì  có  độ  nhạy  cao  hơn.Vì  vậy,  trong  nghiên  cứu  này  chúng  tôi  ứng  dụng  kỹ  thuật  FISH  bước  đầu  khảo  sát  TSX  11q23  trên  BN  BCCDL‐B  tại  Bệnh  viện  Truyền  máu  Huyết  học  (BV.TMHH),  để  góp  thêm  dữ  liệu  giúp  các  bác  sĩ  lâm  sàng  phân  nhóm  tiên  lượng và  định hướng  điều  trị  được  hiệu quả hơn.  ĐỐI  TƯỢNG ‐ PHƯƠNG  PHÁP  NGHIÊN  CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Các BN được chẩn đoán BCCDL‐B bằng tủy  đồ  và  dấu  ấn miễn  dịch  có  chỉ  định  làm  xét  nghiệm FISH tại BV.TMHH Thành phố Hồ Chí  Minh từ tháng 10/2012 đến 10/2013.  Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế nghiên cứu  Mô tả loạt ca.  Phương pháp tiến hành  Thu hoạch trực tiếp 2 ml mẫu tủy xương của  BN BCCDL‐B trong chống đông heparin để thu  nhận tế bào bạch cầu và cố định tế bào trên tiêu  bản. Tiêu bản có thể sử dụng ngay hoặc lưu trữ  trong 6 tháng.  Đoạn dò được sử dụng để lai hóa là LSI MLL  dual  color,  break  apart  rearrangement  probe  (Vysis, Hoa Kỳ)  có  cấu  trúc  như Hình  1. Tiêu  bản tế bào và đoạn dò được biến tính bằng máy  ThermoBrite  (Abbott, Hoa Kỳ)  ở  75oC  trong  5  phút,  sau  đó  ủ  ở 37oC qua  đêm  (khoảng  từ 18  đến 20 tiếng đồng hồ).   Sau  khi  ủ,  tiêu  bản  được  rửa  để  loại  bỏ  những mẫu  dò  bắt  cặp  không  đặc  hiệu  bằng  dung  dịch  0,3% NP‐40  /  0,4  x  SSC  ở  nhiệt  độ  75oC  trong 2 phút, kế  tiếp  rửa bằng dung dịch  0,1 % NP‐40 / 2 x SSC ở nhiệt độ phòng trong 1  phút. Tiêu bản được để khô và phủ bằng 15 μL  dung dịch DAPI II counterstain (Vysis) trước khi  quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Huyết Học 239 Hình 1: Cấu trúc đoạn dò 11q23 sử dụng trong kỹ thuật FISH. Đoạn dò gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm  tại vùng từ exon 6 hướng về tâm trải dài 350kb, đoạn dò gắn chất phát huỳnh quang màu đỏ nằm tại vùng từ exon 6 hướng  về vùng đầu tận trải dài 190kb, điểm gãy nằm tại exon 6 của gen MLL.  KẾT QUẢ  Trong  nghiên  cứu  này,  76  BN  BCCDL‐B  được khảo  sát bất  thường NST 11q23. Kết quả  được  xác  định  khi  phân  tích  200  tế  bào  dưới  kính  hiển  vi  huỳnh  quang.  BN  có  bất  thường  NST 11q23 khi kết quả thể hiện có một tín hiệu  vàng  (của NST  11  bình  thường), một  tín  hiệu  xanh và một tín hiệu đỏ (của NST 11 bị gãy tại vị  trí 11q23)  theo như Hình 2A. BN không có bất  thường NST 11q23 khi kết quả thể hiện có hai tín  hiệu màu vàng (Hình 2B). Tỷ lệ bất thường NST  11q23 được nhận diện dựa vào số  lượng tế bào  có tín hiệu một xanh, một đỏ và một vàng trên  200 tế bào.  Hình 2: Kết quả FISH khảo sát bất thường NST 11q23 trên BN BCCDL‐B. Có tái sắp xếp NST 11q23 (2A) và NST  11q23 bình thường (2B). Trong đó, tín hiệu vàng là của NST 11q23 bình thường, tín hiệu xanh và đỏ là của NST 11q23 bị  gãy.  B A Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Nội Khoa 240 Trong 76 BN BCCDL‐B được khảo sát, có 6  BN có TSX NST 11q23, chiếm tỷ lệ 7,89%. Trong  6 trường hợp có TSX NST 11q23 thì 5 BN có tỷ lệ  bất  thường cao,  trên 90%  tế bào được khảo sát  và 1 BN có tỷ lệ bất thường NST 11q23 thấp hơn  (43,5%) (Bảng 1).  Bảng 1: Kết quả FISH, RT‐PCR và NST đồ của BN BCCDL‐B có bất thường NST 11q23  STT MÃ NGHIÊN CỨU NĂM SINH Kết quả FISH Kết quả RT-PCR Kết quả NST NAM NỮ 1 11q23-F01 1946 11q23 pos 96% (+) MLL/AF4 2 11q23-F11 2001 11q23 pos 97,5% (+) MLL/AF4 3 11q23-F36 2012 11q23 pos 97% (+) MLL/AF4 46,XY,t(4;11)(q21;q23)/46XY 4 11q23-F46 1976 11q23 pos 43,5% (+) MLL/AF4 5 11q23-F64 2011 11q23 pos 96,5% (-) MLL/AF4 6 11q23-F76 1995 11q23 pos 93% (+) MLL/AF4 46,XX,t(4;11)(q21;q23/46XX BÀN LUẬN  Trong  6  BN  có  TSX NST  11q23  được  phát  hiện bằng kỹ  thuật FISH  thì  có 2 BN  được  chỉ  định  làm  xét  nghiệm NST  đồ  và  kết  quả  cho  thấy  2  BN  này  có  chuyển  vị  t(4;11)(q21;q23)  (Hình  3B).  Điều  này  cho  thấy  sự  tương  đồng  giữa kết quả FISH và NST đồ trong khảo sát bất  thường NST 11q23. Đồng thời, khi chúng tôi đối  chiếu kết quả FISH của 6 BN có biểu hiện TSX  NST 11q23 với kết quả RT‐PCR thì có 5 BN biểu  hiện  tổ  hợp  gen MLL/AF4  và một  bệnh  nhân  không biểu hiện MLL/AF4. Như vậy, trong số 6  BN phát hiện có TSX NST 11q23 thì có 5 trường  hợp  (6,58%)  là  có  chuyển vị  t(4;11)(q21;q23) và  một  trường  hợp  là  chuyển  vị NST  11q23  với  NST khác, có thể là t(11;19), t(9;11),...  A B C  Hình 3: Kết quả FISH, NST đồ và RT‐PCR khảo sát bất thường NST 11q23 trên BN mã số 11q23‐F76.  Kết quả FISH có 3 tín hiệu, gồm một tín hiệu vàng là của NST 11 bình thường, 1 tín hiệu xanh và 1 tín hiệu đỏ của NST 11  bị gãy tại vị trí 11q23 (3A); chuyển vị t(4;11)(q21;q23) trên NST đồ (3B.); kết quả RT‐PCR thì cho thấy có sự biểu hiện của  tổ hợp gen MLL/AF4, do chuyển vị t(4;11)(q21;q23) tạo ra (3C).   Trong nghiên cứu này, tỷ lệ BN BCCDL‐B có  TSX  NST  11q23  là  7,89%.  Kết  quả  này  cũng  tương đồng với nghiên cứu của một  số  tác giả  khác, như trong nghiên cứu của Soszynska K và  cộng  sự  cho  thấy  tỷ  lệ  bất  thường NST  11q23  trên BCCDL Ba Lan  là  7,14%  (8). Theo kết quả  của Bảng 1, có đến 5/6 BN TSX 11q23 là chuyển  vị  t(4;11)  và  kết  quả  này  nhận diện  được dựa  vào kết quả khảo sát tổ hợp gen MLL/AF4 với kỹ  thuật  RT‐PCR  giúp  chúng  ta  biết  chính  xác  chuyển vị NST. BN BCCDL‐B có TSX 11q23 và  đặc  biệt  chuyển  vị NST  thường  gặp  là  t(4;11)  được chứng minh  là yếu  tố  tiên  lượng xấu nên  việc  xác  định TSX  11q23  có  giá  trị  quan  trọng  trong việc xếp nhóm điều trị cho BN.  KẾT LUẬN  BV.TMHH đã xây dựng thành công kỹ thuật  FISH  sử  dụng  các  đoạn  dò  đặc  hiệu  giúp  xác  định  các  bất  thường  NST,  trong  đó  có  bất  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Huyết Học 241 thường NST 11q23 một cách nhanh chóng, chính  xác,  trên một  lượng mẫu nhỏ giúp  ích cho việc  phân  nhóm  tiên  lượng  và  lựa  chọn  phương  pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân.   TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Harrison CJ, Cuneo A, Clark R, et al  (1998). Ten novel 11q23  chromosomal  partner  sites.  European  11q23  Workshop  participants. Leukemia, 12 (5), 811‐22.  2. Kaushansky K, Beutler E, Seligsohn U, et al  (2010). Neoplastic  Lymphoid  Diseases.  Chapter  93:  Acute  Lymphoblastic  Leukemia.Williams Hematology.  3. Negrin  R,  Storb  R,  Forman  S  (1998).  Bone  marrow  tranplantation in malignant disease Hematology, 342‐357.  4. Nguyễn  Bích  Trân,  Huỳnh  Thị  Bích  Huyền,  Huỳnh  Nghĩa  (2007). Nghiên cứu ứng dụng điều trị tấn công bệnh bạch cầu  cấp lympho cho trẻ em bằng phác đồ FRALLE 2000. Đề tài cấp  cơ sở. BV Truyền máu Huyết học TP.HCM.  5. Pui  CH,  Robison  LL,  Look  AT  (2008).  Acute  lymphoblastic  leukaemia. Lancet, 371 (9617), 1030‐43.  6. Rubnitz  JE,  Pui  CH  (1997).  Childhood  acute  lymphoblastic  leukemia. The Oncologist; 2, 374‐380.  7. Secker‐Walker  LM,  Moorman  AV,  Bain  BJ,  et  al  (1998).  Secondary acute leukemia and myelodysplastic syndrome with  11q23  abnormalities.  EU  Concerted Action  11q23 Workshop.  Leukemia, 12 (5), 840‐4.  8. Soszynska K, Mucha B, Debski R, et al (2008). The application of  conventional cytogenetics, FISH, and RT‐PCR to detect genetic  changes in 70 children with ALL. Ann Hematol: 991‐1002.  9. Võ Thị Thanh Trúc (2010). Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bạch  cầu  cấp dòng  lympho  ở  trẻ  em bằng phác  đồ FRALLE‐2000.  Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú, Đại học Y Dược Tp. HCM.  10. Young  DB  (2002).  Molecular  cytogenetics  of  leukemia.  Leukemia.  7th  edition.  In: Henderson  SE, Lister AT, Greaves  FM(Eds). Sauders, USA, 69‐84.  Ngày nhận bài báo:       18/11/2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   30/11/2013  Ngày bài báo được đăng:   05/01/2014