Khảo sát các phương pháp trích ly dưỡng chất từ nấm mèo

Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 170 KHẢO SÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY DƯỠNG CHẤT TỪ NẤM MÈO *Phạm Thị Mộng Trinh; Trần Thị Minh Hà Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM Email: *phamtrinh.ft@gmail.com TÓM TẮT Nấm mèo là loại nguyên liệu giàu giá trị dinh dư�ng như xơ hòa tan, protein, khoáng chất, ít chất béo. Polysaccharide trong nấm mèo là thành phần có hoạt tính sinh học cao, có khả năng kháng ung thư, điều hòa tim mạch, chống lão hóa.... Trong nghiên cứu này nấm mèo được phá v� thành tế bào bằng sóng siêu âm và xử lý enzyme Pectinase nhằm tăng cường khả năng trích ly các chất dinh dư�ng ra bên ngoài. Kết quả cho thấy, phương pháp trích ly bằng dung môi nước được hỗ trợ bởi enzyme Pectinase ở nồng độ 2.0% (v/w) trong thời gian 90 phút đạt hiệu suất trích ly 12.16%. Phương pháp trích ly được hỗ trợ bằng sóng siêu âm đạt hiệu suất 17.35%, với điều kiện công suất siêu âm là 300W, trong thời gian 25 phút. Từ khóa: Nấm mèo, trích ly, siêu âm, enzyme Pectinase. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là nước khí hậu nhiệt đới gió mùa nên rất thuận lợi cho việc trồng nấm, đặc biệt là nấm mèo. Đây là loại nấm rất tốt cho sức khỏe, có nhiều giá trị dinh dư�ng như glucid, protid, các hợp chất phenol, đặc biệt là hàm lượng chất xơ cao. Polysaccharide của nấm mèo là thành phần có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng phòng chống ung thư, tăng cường khả năng miễn dịch, giảm stress, giảm cholesterol và chống phóng xạ. Tuy nhiên, cơ thể con người không đủ các loại enzyme để phá v� hoàn toàn thành tế bào của nấm mèo mà chủ yếu nhờ vào tác dụng cơ học khi nhai, nên nhiều chất dinh dư�ng chưa được thoát ra bên ngoài dẫn đến khả năng hấp thụ các chất dinh dư�ng từ nấm mèo rất thấp. Nhằm nâng cao khả năng hấp thụ các chất dinh dư�ng từ nấm mèo, chúng tôi đã nghiên cứu phá v� thành tế bào, trích ly các chất dinh dư�ng ra bên ngoài và tạo thành sản phẩm dạng trà hòa tan. VẬT LIỆU/PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Nguyên liệu nấm mèo ở dạng sấy khô với độ ẩm 9.8%, được mua tại Công ty TNHH Thế Giới Dinh Dư�ng (Địa chỉ: số 20, đường Hồ Thị Hương, huyện Thống Nhất, tỉnh Đồng Nai). Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 171 Hóa chất và thiết bị Enzyme Pectinex Ultra SP-L, sản phẩm của công ty Novozymes, được mua tại Công ty Cổ Phần Phát Triển Khoa Học Công Nghệ Mỹ Úc (Địa chỉ: 783/40, Cách Mạng Tháng Tám, phường 6, quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh) Các hóa chất như acid citric, natri carbonate được mua tại Công ty TNHH Bách Khoa (Địa chỉ: khối 6-334, Tô Hiến Thành, phường 14, quận 10, thành phố Hồ Chí Minh). Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu là: máy ly tâm hiệu Hermale của Đức (tốc độ tối đa 6000 vòng/phút), máy tạo sóng siêu âm hiệu Sonics của Mỹ (tần số: 20kHz, công suất: 0 – 750W), tủ ủ ấm hiệu Incucell của Đức, máy đo pH hiệu 7110 của Đức. Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu và quy trình sản xuất Nguyên liệu nấm mèo được loại tạp chất và nghiền khô đến kích thước 0.3mm. Chuẩn bị 5 mẫu nguyên liệu cho mỗi thí nghiệm, với khối lượng 2g/mẫu. Sau đó, bổ sung dung môi nước với tỷ lệ 1/50 (g/ml) và tiến hành trích ly trong các điều kiện khảo sát. Quy trình sản xuất: nấm mèo → loại tạp chất → nghiền thô 0.3 mm → trích ly → cô đặc → sấy phun → bột nấm mèo. Khảo sát quá trình trích ly được hỗ trợ bằng enzyme Pectinase Mẫu nguyên liệu đã chuẩn bị, được điều chỉnh pH về 5.0 bằng acid citric và Na2CO3. Sau đó, tiến hành khảo sát nồng độ enzyme ở các mức 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5% trong thời gian 60 phút. Sau khi xác định được nồng độ enzyme thích hợp thì tiến hành khảo sát thời gian ủ enzyme ở các mức 45 phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút và 105 phút. Các mẫu được xác định hiệu suất trích ly để xác định điều kiện xử lý enzyme đạt hiệu suất trích ly cao nhất. Khảo sát quá trình trích ly được hỗ trợ bằng sóng siêu âm Mẫu nguyên liệu đã chuẩn bị, được tiến hành khảo sát công suất siêu âm ở các mức 150W, 187.5W, 225.0W, 262.5W và 300W trong thời gian 15 phút. Sau khi xác định được công suất siêu âm thích hợp thì tiến hành khảo sát thời gian siêu âm ở các mức 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút và 30 phút. Các mẫu được xác định hiệu suất trích ly để xác định điều kiện siêu âm đạt hiệu suất trích ly cao nhất. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu Phương pháp xác định hiệu suất trích ly: Tiến hành cân xác định khối lượng dịch chiết. Sau đó lấy 10g dịch chiết và thực hiện sấy đến khối lượng không đổi. Cân xác định khối lượng chất tan sau khi sấy và tính ra phần trăm chất tan trong dịch chiết. Từ khối lượng dịch chiết và phần trăm tỷ lệ chất tan, ta tính được hiệu suất trích ly theo công thức sau: Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 172 1 2 m m 10H(%) 100 m (1 W)  =   − Trong đó: m1 là khối lượng chất tan trong 10 g dịch chiết sau khi sấy khô (g), m2 là khối lượng dịch chiết (g), m là khối lượng mẫu ban đầu (g), w là độ ẩm trong mẫu ban đầu (%). Xử lý số liệu: Phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và phương pháp kiểm định hậu tố LSD (Least Significant difference) được sử dụng để kiểm tra sự khác nhau giữa các nghiệm thức (α= 0,05) với sự hỗ trợ của phần mềm thống kê JMP 10.0. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát ����nh trích ly được hỗ trợ bằng enzyme Pectinex Ultra SP-L Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Hình 1: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất trích ly Ghi chú: Số liệu là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng ký tự khác biệt nhau về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5% Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất trích ly chất chiết từ nấm mèo được thể hiện trên hình 1. Khi tăng nồng độ enzyme từ 0.5% (v/w) đến 2.0% (v/w) thì hiệu suất trích ly tăng dần từ 4.47% đến 10.46%. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ lên 2.5% thì hiệu suất trích có xu hướng giảm dần (10.09%) và không có sự khác biệt với mẫu xử lý ở nồng độ enzyme 2.0% theo phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Điều này được giải thích như sau: thành tế bào của nấm có khoảng 25% chất khô, trong đó có khoảng 80% chất khô là hợp chất polysaccharide, còn lại 20% bao gồm protein, lipid, và nhiều loại muối vô cơ khác. Hợp chất polysaccharide ở các loài nấm khác nhau thì cũng sẽ khác nhau, phần lớn là glucan, chitin, hemicellulose Những thành phần này được kết dính lại với nhau nhờ pectin [7]. Khi sử dụng chế phẩm enzyme pectinex Utra SP-L với thành phần chủ yếu là pectintranseliminase, polygalacturonase, pectinesterase, hemicellulase và cellulase thì các thành phần này sẽ sử dụng các cơ chất trên thành tế bào nấm mèo như pectin và hemicellulose,dẫn đến phá v� cấu trúc thành tế bào. Ngoài ra, enzyme Pectinex Ultra SP-L cũng sẽ tấn công làm gãy các liên kết như liên kết ester giữa phenol và polymer trên thành tế bào [2]; do đó làm tăng hiệu suất trích ly các chất bên trong thành tế bào ra môi trường bên ngoài. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 173 Khi tăng nồng độ enzyme lên thì sự phá hủy thành tế bào càng tăng do đó hiệu suất trích ly cũng tăng lên đáng kể. Tuy nhiên nếu ta tăng nồng độ enzyme quá cao so với cơ chất thì sẽ xảy ra hiện tượng ức chế ngược làm giảm hiệu suất trích ly. Với mục tiêu tối đa hóa hiệu suất trích ly, đồng thời đảm bảo hiệu quả kinh tế thì nồng độ enzyme 2.0% được sử dụng để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.Với điều kiện này, thì hiệu suất trích ly đạt 10.46%. Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme Hình 2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly Ghi chú: Số liệu là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng ký tự khác biệt nhau về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Mức độ ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly được thể hiện trên hình 2 Theo đó, khi tăng thời gian trích ly thì hiệu suất trích ly cũng tăng. Ở thời gian 90 phút đạt hiệu suất trích ly cao nhất với hiệu suất 12.16%. Tuy nhiên, vẫn không có sự khác biệt theo phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 5% so với mẫu trích ly ở 75 phút (10.46%) và 105 phút (12.09%). Điều này có thể giải thích như sau: quá trình hòa tan các chất trong nguyên liệu xảy ra cho đến khi đạt sự cân bằng về nồng độ của dịch trích ly giữa các lớp bên trong và lớp bên ngoài của nguyên liệu. Qúa trình hòa tan lúc đầu diễn ra nhanh, sau đó chậm dần và ngừng lại cho đến lúc đạt sự cân bằng nồng độ. Có thể do ở 90 phút cũng là thời gian để nấm mèo trương nở tối đa, dẫn đến sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất là cực đại. Tiếp tục tăng thời gian trích ly thì hiệu suất gần như không thay đổi, có thể do quá trình trích ly đã diễn ra hoàn toàn, do pectin ảnh hưởng đến độ nhớt dung dịch hoặc hoạt tính của enzyme đã giảm dần theo thời gian trích ly nên khi tăng thời gian hơn nữa thì hiệu suất trích ly cũng tăng không đáng kể. Với mục tiêu tối đa hóa hiệu suất trích ly thì thời gian xử lý enzyme 90 phút được lựa chọn để thực hiện quá trình xử lý bột nấm trước khi trích ly. Với điều kiện này, thì hiệu suất trích ly đạt 12.16%. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 174 Khảo sát ����nh trích ly được hỗ trợ bằng sóng siêu âm Ảnh hưởng của công suất siêu âm Hình 3: Ảnh hưởng của công suất siêu âm lên hiệu suất trích ly Ghi chú: Số liệu là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng ký tự khác biệt nhau về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Mức độ ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hiệu suất trích ly chất chiết từ nấm mèo được thể hiện trên hình 3. Khi tăng công suất siêu âm từ 150 W đến 300 W thì hiệu suất trích ly tăng dần từ 2.97% đến 15.48%. Các giá trị nghiệm thức có sự khác biệt có nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Hiệu suất thu hồi chất chiết tăng khi tăng công suất siêu âm. Điều này được giải thích như sau: Sóng siêu âm là sóng có tần số trên 20kHz, có tác dụng hiệu quả trong việc phá v� màng tế bào nhờ sự dao động và phá v� của các bọt khí. Qúa trình này tạo ra nhiệt độ và áp suất cao lên các tế bào lân cận [1],[10]. Do đó, các liên kết trên vách tế bào bị phá v�, tạo điều kiện cho dung môi dễ dàng xâm nhập vào bên trong tế bào và giải phóng các chất trong tế bào vào môi trường [4],[5]. Khi tăng công suất siêu âm thì nhiệt độ dung dịch siêu âm sẽ tăng. Mà nhiệt độ dung dịch là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ nhớt và cường độ tạo sủi bóng. Nếu độ nhớt của chất lỏng cao, hiện tượng sủi bóng sẽ giảm, sự thẩm thấu của sóng siêu âm vào môi trường chất lỏng thấp. Do đó, nếu tăng công suất siêu âm thì nhiệt độ dung dịch tăng, độ nhớt giảm. Điều này giúp quá trình truyền khối diễn ra dễ dàng hơn và làm tăng hiệu suất trích ly. Kết luận này đã được khẳng định trong các nghiên cứu của Wang và cộng sự (2008), Yang Zhao và cộng sự (2008), You Zou và cộng sự (2010), Dariusz Stasiak (2007) [4],[8],[10]. Quy luật ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hiệu suất trích ly chất chiết từ nấm mèo này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Yu Zou và chungan Xie (2010) trong nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất melanin từ nấm mèo. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng melanin tăng dần khi tăng công suất siêu âm từ 100W đến 250W và xu hướng còn tiếp tục tăng. Tuy nhiên, do điều kiện công suất tối đa của thiết bị là 250W nên giá trị này được lựa chọn là thông số tối ưu [4]. Ma và cộng sự (2013) cũng đã khảo sát ảnh hưởng ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hiệu suất trích ly polysaccharide từ nấm linh chi. Kết quả cho thấy, công suất siêu âm tỷ lệ thuận với hàm lượng polysaccharide [3]. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 175 Với mục tiêu là tối đa hóa hiệu suất trích ly trong điều kiện cho phép của thiết bị, đồng thời hạn chế chi phí năng lượng, nên công suất siêu âm là 300W được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Với điều kiện này thì hiệu suất trích ly đạt 15.48%. Ảnh hưởng của thời gian xử lý siêu âm Hình 4: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm lên hiệu suất trích ly Ghi chú: Số liệu là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng ký tự khác biệt nhau về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Sóng siêu âm có khả năng làm tăng tốc độ phá v� thành tế bào và mô thực vật cũng như tốc độ truyền khối, nên thời gian xử lý được rút ngắn so với các phương pháp trích ly truyền thống [11]. Mức độ ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất trích ly chất chiết từ nấm mèo được thể hiện trên hình 4. Khi tăng thời gian siêu âm từ 10 phút đến 25 phút thì hiệu suất trích ly tăng dần từ 5.75% đến 17.35%. Do đây là quá trình trích ly các phân tử chất tan nên thời gian trích ly kéo dài cũng làm tăng hàm lượng polysaccharide hòa tan cho đến khi đạt đến hàm lượng tối ưu Nếu tiếp tục tăng thời gian siêu âm đến 30 phút thì hiệu suất trích ly tăng lên lên 17.41%, nhưng thay đổi không có nghĩa theo phân tích thống kê với mẫu xử lý 25 phút ở mức ý nghĩa 5%. Điều này có thể giải thích là do hàm lượng chất chiết trong mẫu là có giới hạn. Hơn nữa, nhiệt độ trích ly từ 70oC đến 100oC chỉ có thể trích ly các polysaccharide mạch ngắn. Sau thời gian trích ly 30 phút thì hàm lượng polysaccharide sẽ không tăng do quá trình trích ly hầu như đã xảy ra hoàn toàn và thời gian trích ly kéo dài có thể gây ra sự phân hủy các polysaccharide mạch ngắn có cấu trúc không bền vững và hậu quả có thể làm cho hàm lượng polysaccharide giảm [11]. Ngoài ra, thời gian xử lý siêu âm kéo dài thì hàm lượng chất chiết trong dung dịch, đặc biệt là hàm lượng polysaccharide hòa tan tăng lên. Polysaccharide có phân tử lượng lớn nên sẽ làm tăng độ nhớt dung dịch, điều này có thể làm tắc nghẽn các kênh mao dẫn trong khối nguyên liệu, hạn chế sự dao động và số lượng của các bọt khí. Từ đó làm giảm hiệu quả truyền khối và hiệu suất trích ly [9],[4]. Quy luật ảnh hưởng này tương đồng với kết quả của một số nghiên cứu trước đó. Theo kết quả nghiên cứu của Yu Zou và Cộng sự (2010), khi tăng thời gian trích ly melanin từ nấm mèo thì hiệu suất trích ly tỷ lệ thuận với thời gian từ 20 phút đến 35 phút, nhưng sau đó hiệu suất giảm dần nếu kéo dài thời gian trích ly. Theo Wang và Cộng sự (2008), Lê Văn Việt Mẫn (2012) thì thời gian siêu âm tối ưu phụ thuộc vào khối lượng mẫu, nhiệt độ và công suất siêu âm. Nếu công Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 176 suất siêu âm lớn thì sẽ rút ngằn được thời gian siêu âm. Nếu công suất siêu âm nhỏ thì cần kéo dài thời gian siêu âm để đạt được hiệu suất tương đương [9],[8]. Theo kết quả phân tích thống kê thì hiệu suất trích ly ở thời gian 30 phút không có sự khác biệt có nghĩa với hiệu suất trích ly ở 25 phút. Do đó, với mục tiêu tối đa hóa hiệu suất trích ly, đồng thời hạn chế tổn thất chi phí năng lượng thì thời gian 25 phút được lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Với điều kiện này thì hiệu suất trích ly đạt 17.35%. KẾT LUẬN Phương pháp trích ly bằng dung môi nước có sự hỗ trợ của enzyme Pectinex Ultra SP- L đạt hiệu suất tốt nhất ở điều kiện tiền xử lý là nồng độ enzyme 2.0%, thời gian ủ 90 phút. Với điều kiện này, thì hiệu suất trích ly đạt 12.16%. Trong khi đó, phương pháp trích ly bằng dung môi nước có sự hỗ trợ của sóng siêu âm đạt hiệu suất trích ly tốt nhất ở điều kiện tiền xử lý bột nấm là công suất siêu âm 300W, trong thời gian 25 phút. Với điều kiện này, thì hiệu suất trích ly đạt 17.35%. Việc lựa chọn phương pháp trích ly thích hợp phụ thuộc vào tính chất của từng đối tượng trích ly, giá trị sản phẩm, chi phí năng lượng và hiệu quả kinh tế. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Atchey, L.A. Frizzell, R.E. Apfel, C.K. Holland, S.Madanshetty, R.A. Roy., "Thresholds for cavitation produced in water by pulsed ultrasound" Ultrasonics, vol. 26, pp. 280-285, 1988. [2] Z. Manuel Pinelo, Anne S. Meyer "Selective release of phenols from apple skin: Mass transfer kinetics during olvent and enzyme- assisted extraction", Separation and Purification Technology, vol. 63, pp. 620 - 627, 2008. [3] Ma, M. Feng, X. Zhai, M. Hua, L. You, W. Luo and M. Zhao, "Optimization for the extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum and their antioxidant and antiproliferative activities" Taiw. Ins. Chem. Eng vol. 44, pp. 886-894, 2013. [4] X. Yu Zou, Gongjian Fan, Zhenxin Gu, Yongbin Han, "Optimization of ultrasound- assisted extraction of melanin from Auricularia auricula fruit bodies," Innovative Food Science and Emerging Technologies, vol. 11, pp. 611-615, 2010. [5] M. Shi, Y. N. Yang, X. Hu and Z. Zhang, "Effect of ultrasounic extraction conditions on antioxidative and immunomodulatory activities of a Ganoderma lucidum polysaccharide originated from fermented soybean curd residue " Food Chem vol. 155, pp. 50-56, 2014. [6] M. Cano, P.C. Stringheta, A.M. Ramos and J. Cal - Vidal., "Effect of the carriers on the microstructure of mango powder obtained by spray drying and its functional characterization " Innovative Food Science and Emerging Technologies, vol. 6, pp. 420 - 428, 2015. [7] O. Yarden, Handbook of Fungal Biotechnology: Marcel Dekker, 2004. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 177 [8] S. Wang. J., B., Cao, Y., Tian, Y "Optimizaion of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran" Food Chemistry, vol. 106, pp. 804-810, 2008. [9] T. P. a. L. Nguyen, V.V.M, "Application of ultrasound to pineapple mash treatment in juice processing," International Food Research Journal, vol. 19, pp. 547-552, 2012. [10] J. S. Zbigniew J. Dolatowski, Dariusz Stasiak, "Applications of Ultrasoun in food Technology" Acta Sci. Pol., Technol. Aliment, vol. 6, pp. 89-99, 2007. [11] Z.-e.-H. Farid Chemat, Muhammed Kamran Khan, "Applications of ultrasound in food technology: Processing, preservation and extraction" Ultrasonics sonochemistry, vol. 18, pp. 813-835, 2011. RESEARCH ON EXTRACTING NUTRITIONS FROM MUSHROOM AURICULARIA AURICULA ABSTRACT Auricularia auricula is raw materials, which is rich nutritive value as soluble fiber, protein, minerals, low in fat. Polysaccharides in mushrooms as ingredients of high biological activity, is resistant to cancer, cardiovascular conditioning, anti-aging... The studied, mushrooms to be breaking the cell walls of with ultrasound and enzyme pectinase to enhance nutrient extraction outside. The results showed that the method of water extraction solvent supported by pettiness at concentrations of 2.0% (v/w) during the 90 minutes, recovery yield is 12,16%. The recovery yield of extraction method supported by ultrasound is 1735% of the ultrasonic power conditions 300W, during 25 minutes. Keywords: Auricularia auricula-judae, Extraction, Ultrasound, EnzymePectinase.