Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

i phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống. - Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi. Cách làm tiêu bản giọt treo Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích - Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa. - Bôi vaseline quanh phần lõm của phiến kính. - Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính. - Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính. Cách làm tiêu bản nhuộm màu a. Nguyên tắc Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu. b. Cách nhuộm + Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên phiến kính. + Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm. + Đậy lá kính lên giọt dịch. + Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40) PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH Nhuộm tế bào vi khuẩn dùng để phân biệt hình dáng tế bào vi khuẩn (cầu, trực, xoắn) hay để phân biệt các thành phần riêng biệt trên một tế bào vi khuẩn. Có 2 phương pháp nhuộm cơ bản: - Nhuộm đơn: Dùng một loại thuốc nhuộm để quan sát hình dạng tế bào. - Nhuộm kép: Dùng 2 thuốc nhuộm để phân biệt vi khuẩn G+ và G-, phân biệt tế bào dinh dưỡng và bào tử, hay phân biệt vi khuẩn lao với các vi khuẩn khác... Nguyên tắc chung làm tiêu bản nhuộm - Phết kính tiêu bản Lau nhẹ tiêu bản sạch bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. Dùng bút chì mỡ hoặc bút lông ghi tên mẫu, và vẽ vòng tròn ϕ khoảng 15mm, ở mặt dưới lame kính để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame. Đốt nóng đỏ que cấy (trước và sau khi thao tác), mở nút bông, hơ nhanh miệng ống nghiệm. Trường hợp 1: mẫu nuôi cấy trong canh dinh dưỡng, đưa đầu que cấy vào miệng ống nghiệm (vẫn giữ gần ngọn lửa), nhúng vào dung dịch canh cấy, lấy 1 vòng que cấy. Lấy que cấy ra, hơ nhanh miệng ống nghiệm và nút bông, đậy nút bông lại. Phết canh khuẩn trên vòng que cấy vào mặt trên lam, giữa vòng tròn, dàn đều ra xung quanh. Trường hợp 2: mẫu nuôi cấy trong thạch dinh dưỡng, nhỏ giọt dung dịch NaCl 9‰ lên giữa vòng tròn (mặt trên lam). Thao tác giống trường hợp 1, nhưng dùng cạnh vòng tròn của đầu que cấy đặt nhẹ lên khuẩn lạc vi khuẩn, rồi đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam, dàn mỏng và đều. - Cố định mẫu Mục đích giết chết vi khuẩn và làm cho vi khuẩn bám chặt vào lame. Cố định mẫu bằng cách để khô tự nhiên. Chú ý: Nếu cố định không tốt vi khuẩn sẽ trôi đi trong quá trình nhuộm. Khi cố định mẫu, chỉ hơ nhanh chứ không đốt trên ngọn lửa. Không được chạm vào thành khi đưa đầu que cấy vào và ra khỏi ống nghiệm vi khuẩn. Hình 9.6: Sơ đồ thứ tự phết kính. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM. Phương pháp nhuộm gram (Christian Gram): Nguyên tắc: Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram [+] sẽ giữ được phức hợp tím Gentian-iode không bị tẩy màu bởi alcool, trong khi vi khuẩn Gram [-] không giữ được phức hợp màu này, do vậy kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram [+] vẫn giữ được màu tím của gentian, còn vi khuẩn Gram [-] ăn màu hồng của phẩm màu safranin hay fushin. b. Thao tác: - Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa. - Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính. - Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc. Để từ 1 – 2 phút (nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để 1 phút). Rửa nước, thấm khô. - Tẩy cồn 960 từ 15 – 30 giây (từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây). Rửa nước, thấm khô. Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ ở mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu tím. - Cố định màu tím bằng iodine là dung dịch lugol. - Đặt miếng giấy lọc lên vết khuẩn, nhỏ dung dịch Fuschin kiềm loãng (hoặc Safranin O), để 1 phút. Rửa nước, thấm khô. - Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1.000 lần. Vi khuẩn Gr+ bắt màu tím Crystal violet Vi khuẩn Gr- bắt màu hồng Fuschin (Safranin O) Hình 9.7: Sơ đồ thứ tự nhuộm Gram c. Đọc kết quả: - Quan sát phết nhuộm Gram qua kính hiển vi, dưới vật kính dầu, chúng ta sẽ thấy vi khuẩn Gram [+] ăn màu tím, còn vi khuẩn Gram [-] ăn màu hồng. - Khi trả lời một kết quả nhuộm Gram, phải trả lời các chi tiết sau: + Hình dáng vi khuẩn. + Cách sắp xếp các vi khuẩn. + Cách ăn màu của vi khuẩn, tức là vi khuẩn Gram [+] hay Gram [-]. Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen: Dùng phân biệt vi khuẩn Lao với các vi khuẩn khác Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên khi đã nhuộm được phức hợp màu carbolfuchsin, phức hợp này sẽ không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh (acid, alcool acid). Tuy nhiên để phức hợp màu này có thể thấm xuyên qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn, có hai cách: - Đun nóng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchin, nhờ đó carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; đây là phương pháp nhuộm nóng Ziehl Neelsen. - Phương pháp thứ hai là phương pháp nhuộm lạnh còn gọi là phương pháp Kinyoun, trong phương pháp này người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ vậy khi phủ dung dịch màu đậm đặc này lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin vẫn có thể thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn. Nhuộm bào tử Một số vi khuẩn như Bacillus hay Clostridium có khả năng tạo thành bào tử. Bào tử có thể tồn tại trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chịu được nhiệt và một số các hóa chất mà thể sinh dưỡng không thể. THỰC HÀNH Quan sát hình thái vi sinh vật được phân lập và nuôi cấy từ các bài trước. àVẽ lại hình đã quan sát àViết báo cáo HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 8 1. Số liệu báo cáo 1.1. Kết quả quan sát hình thái vi nấm trên kính hiển vi: Mẫu vi sinh vật 1 .. 2 . 3 .. Hình dạng 1.2. Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn Mẫu 1 .. 2 3 . Hình dạng Bắt màu ( ) Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: Trình bày thao tác sử dụng kính hiển vi quang học? nêu sự khác biệt khi thao tác quan sát vi nấm và vi khuẩn, tại sao? Tại sao phải nhuộm Gram khi quan sát vi khuẩn? Phân loại vi khuẩn bắt màu nhuộm Gram? Trình bày thao tác nhuộm Gram? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi PHỤ LỤC A. HÓA CHẤT. 1. Cồn – Ether Tỷ lệ về thể tích 3:1. Đong 750 ml cồn 960 + 250 ml ether, ta được dung dịch cồn – ether tỷ lệ 3:1. Dung dịch này dùng để tẩy sạch vật kính dầu, hoặc các dụng cụ dính dầu soi. 2. Cồn – acid (dùng để nhuộm Ziehl Neelsen ) Cách pha: Đong 97 ml cồn 960 + 3 ml acid HCl hoặc H2SO4 đậm đặc. 3. Dung dịch sunfo – cromic: K2Cr2O7 + H2SO4 Công thức: K2Cr2O7 60g H2SO4 đậm đặc 66ml Nước 1000ml Cách pha: Cân 60g K2Cr2O7, hào vào 500ml nước. Thêm từ từ 66ml H2SO4 đậm đặc, cuối cùng lại thêm 500ml nước nữa. Bicromate kali sẽ tác dụng với acid sulfuric và làm sinh ra acid cromic. Chất này có tác dụng oxi hóa mạnh do đó có thể tẩy sạch các vết bẩn trên dụng cụ thủy tinh. Thời gian ngâm dụng cụ thủy tinh từ 1 – 2 ngày, xả thật kỹ bằng nước sạch, rửa bằng savon bột, rồi rửa lại bằng nước sạch. Dung dịch này có thể dùng nhiều lần cho đến khi dung dịch từ màu đỏ cam biến thành màu lục đen thì bỏ đi. Lưu ý: Dung dịch này rất độc. Do đó khi ngâm phải đậy kín, lúc rửa nên đeo khẩu trang, mang găng cao su và kính bảo hiểm. 4. Cồn 700: Dùng để sát khuẩn tay, bàn , ghế, tủ cấy, Cách pha: cồn 700 từ cồn 960. Vì không đòi hỏi chính xác, nên có thể áp dụng công thức: V1C1 = V2C2 5. Nước muối sinh lý 9‰ vô khuẩn: Cân chính xác 9g NaCl tinh khiết cho vào cốc có chứa 991ml nước cất (vừa đủ 1000ml ), dùng đũa thủy tinh khuấy đều. Đem hấp vô khuẩn ở t0 = 1210C, 1atm, 15 – 20 phút. B. THUỐC NHUỘM. 1. Crystal violet (C25H30N3Cl . 9H2O = 570,11 ): Công thức: a) Crystal violet 0,4g Cồn 960 10ml b) Phenol 1g Nước cất 100ml Cách pha: Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Chú ý: dung dịch thuốc nhuộm này luôn bảo quản trong chai màu, tránh ánh sáng. 2. Lugol: Công thức: KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300ml Cách pha: Hòa 2g KI vào 5ml nước cất, sau đó thêm 1g iod. Chờ cho iod tan hết mới thêm nước vừa đủ 300ml. 3. Fuchsine kiềm ( C19H18N3Cl = 323,82 ): Công thức: a) Fuchsine kiềm 0,3g Cồn 960 10ml b) Phenol 5g Nước cất 35ml Cách pha: Trộn dung dịch a và b với nhau, khuấy cho tan đều à đem lọc. Bảo quản trong chai màu. Trước khi dùng pha loãng 5 lần (dịch pha loãng không giữ được lâu còn dịch đặc có thể giữ được trong nhiều tháng ). 4. Safranin O ( C20H19N4Cl = 350,80 ): Công thức: Safranin O ( dung dịch 2,5% trong cồn 960 ) 25ml Nước cất 75ml Bảo quản trong chai màu. 5. Methylene blue ( C37H27N2S2 = 799,80 ): Công thức: a) Methylen blue 3g Cồn 96% 30ml b) Dung dịch KOH 0.01% 1000ml Cách pha: Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau à khuấy hoà tan đều à đem lọc. Bảo quản trong chai màu. MÔI TRƯỜNG I. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MỐC VÀ NẤM MEN. Môi trường Sabouraud: (để nuôi cấy nấm mốc và nấm men) Công thức: Pepton 20g Mantose hay glucose 40g Agar 18g Nước cất vừa đủ 1000ml ( pH: 5,5 – 6,0 khử khuẩn trong nồi áp suất ở t0 = 1210C (1atm)/ 15- 20 phút). Môi trường PGA Thành phần môi trường PGA: Khoai tây 300g Glucose 20g Agar 15g Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút Môi trường PGA sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-460C và đổ đĩa để nguội. II. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI VI KHUẨN. 1. Môi trường Nutrient Broth (NB): Công thức: Cao thịt 5g Pepton bột 10g NaCl 5g Nước cất 1000ml ( pH: 7,4 – 7,6 ). Cân 13g bột môi trường NB hòa vào 1000ml nước cất, khuấy đều. Đem hấp khử trùng ở 1210C (1am)/ 15 – 20 phút. 2. Môi trường Nutrient Agar (NA): Thành phần môi trường như môi trường NB nhưng có bổ sung 18g agar trong 1000ml môi trường. Cân 13g bột môi trường NB + 18g agar hòa vào 1000ml nước cất, rồi khuấy đều. Khử khuẩn trong nồi áp suất ở t0 = 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút. 3. Môi trường thạch bán lỏng di động: Công thức: Nutrient broth 13g Agar 5g Nước cất 1000ml pH: 7,2 Pha chế: Đem các thành phần của môi trường trên hòa tan trong nước cất, rồi đun cách thủy cho agar hòa tan đều. Phân vào trong các ống nghiệm 16 x 120 mm, mỗi ống khoảng 5ml. Đem hấp khử khuẩn ở 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút. Lấy ra để đứng cho môi trường đông lại. 4. Môi trường Plate Count Agar (PCA): Thành phần: Trypton 5g Yeast extract 2.5g Glucose 1g Agar 15g Nước cất 1000ml Pha chế: Đem các thành phần của môi trường trên hòa tan trong nước cất, rồi đun cách thủy cho agar hòa tan đều. Đem hấp khử khuẩn ở 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút. Phân phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa dầy khoảng 10 - 20mm, Để nguội cho môi trường đông lại. 5. Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant green 0,0133g Nước cất 1000 ml Hòa tan peptone va lactose vào trong 500ml nước cất, cho mật bò vào trong khoảng 200ml và brilliant green vào trong khoảng 100ml nước cất. Trộn đều 3 dung dịch và thêm nước đủ 1000 ml, chỉnh pH khoảng 7,4. Rót vào ống nghiệm có ống Durham 10ml môi trường BGBL. Hấp 1210C, 1atm trong 15 phút. 6. Môi trường Lauryl Sulphate Broth (LSB) Tryptose 20g Lactose 5g Sodium chloride 5g KH2PO4 2,75g K2HPO4 2,75g Lauryl sulphate 0,1g Nước cất 1000ml Hòa tan các chất vào 1000 ml, chỉnh pH khoảng 7,4. Rót vào ống nghiệm có ống Durham 10ml môi trường LSB. Hấp 1210C, 1atm trong 15 phút. 7. Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB hoặc VRBA) Cao nấm men 3g Peptone hoặc gelysate 7g NaCl 5g Muối mật 1,5g Lactose 10g Neutral red 0,03g Crystal violet 0,002g Agar 15g Nước cất 1000ml Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh pH 7,4. Đun sôi trong 2 phút, không hấp khử trùng. Sử dụng vào môi trường đổ đĩa 8. Môi trường Potato Glucose Agar (PCA): Thành phần môi trường: Khoai tây 300g Glucose 20g Agar 15g Pha chế môi trường: Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút. TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Linh Thước (2005), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục. Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Giáo trình THỰC TẬP VI SINH CƠ SỞ, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Công nghệ sinh học. Nguyễn Thị Sơn, Trần Lệ Minh, Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm VI – HÓA SINH ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG, NXB Bách Khoa Hà Nội. Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, cây trồng. BẢNG TRA MPN BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT 3 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP Số lượng ống dương tính Số MPN/100ml Số lượng ống dương tính Số MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng 10 1 0,1 10 1 0,1 0 0 0 - 2 0 0 9 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6 2 1 1 20 0 1 2 9 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6 2 2 0 21 0 2 1 9 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 4 3 0 0 23 1 0 1 7 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 - BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT 5 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP Số lượng ống dương tính Số MPN/100ml Số lượng ống dương tính Số MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng 10 1 0,1 10 1 0,1 0 0 0 0 4 0 2 20 0 0 1 2 4 0 3 25 0 0 2 4 4 1 0 17 0 1 3 2 4 1 1 20 0 1 0 4 4 1 2 25 0 1 1 6 4 2 0 20 0 2 2 4 4 2 1 25 0 2 3 6 4 2 2 30 0 3 0 6 4 3 0 25 1 0 1 2 4 3 1 35 1 0 2 4 4 3 2 40 1 0 3 6 4 4 0 35 1 0 0 8 4 4 1 40 1 1 1 4 4 4 2 45 1 1 2 6 4 5 0 40 1 1 3 8 4 5 1 50 1 2 0 6 4 5 2 55 1 2 1 8 5 0 0 25 1 2 2 10 5 0 1 30 1 3 0 8 5 0 2 45 1 3 1 10 5 0 3 60 1 4 0 11 5 0 4 75 2 0 0 5 5 1 0 35 2 0 1 7 5 1 1 45 2 0 2 9 5 1 2 65 2 0 3 12 5 1 3 85 2 1 0 7 5 1 4 115 2 1 1 9 5 2 0 50 2 1 2 12 5 2 1 70 2 2 0 9 5 2 2 95 2 2 1 12 3 2 3 120 2 2 2 14 5 2 4 150 2 3 0 12 5 2 5 175 2 3 1 14 5 3 0 80 2 4 0 15 5 3 1 110 3 0 0 8 5 3 2 140 3 0 1 11 5 3 3 175 3 0 2 13 5 3 4 200 3 1 0 11 5 3 5 250 3 1 1 14 5 4 0 130 3 1 2 17 5 4 1 170 3 1 3 20 5 4 2 225 3 2 0 14 5 4 3 275 3 2 1 17 5 4 4 350 3 2 2 20 5 4 5 425 3 3 0 17 5 5 0 250 3 3 1 20 5 5 1 350 3 4 0 20 5 5 2 550 3 4 1 25 5 5 3 900 3 5 0 25 5 5 4 1600 4 0 0 13 5 5 5 1800 4 0 1 17 - - - - HƯỚNG DẪN BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÁCH LẤY MẪU CÁC CHỈ TIÊU PHÂN TÍCH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KẾT QUẢ NHẬT KÝ LÀM VIỆC NGÀY MÔI TRƯỜNG SỐ LƯỢNG KẾT QUẢ GHI CHÚ GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN VƯU NGỌC DUNG