DNA vật liệu di truyền

dnthDNA vật liệu di truyềnChương IVI. Bản chất của vật liệu di truyềnHiện tượng biến nạp ở vi khuẩnHiện tượng biến nạp (transformation) được Griffith phát hiện ở vi khuẩn Diplococcus pneumoniae.Vi khuẩn này có hai dạng: - Dạng SIII gây độc, có vỏ bao tế bào (capsule) bằng polysaccharide cản trở bạch cầu phá vỡ tế bào , tạo khuẩn lạc láng (Smooth). - Dạng RII không độc, không có vỏ bao, tạo khuẩn lạc nhăn (Rough).Dạng S bị đun chếtDạng S bị đun chếtDạng S còn sốngDạng R còn sốngDạng R còn sốngKhông capsulCó capsulChuột sốngChuột chếtChuột chếtChuột sốngDạng S và R còn sống được phân lập từ chuột chếtKhuẩn lạc RIIKhuẩn lạc SIIIThí nghiệm của Griffith (1928) Trong phổi chuột chết (do tiêm hỗn hợp SIII chết với RII sống) có vi khuẩn S và R.Các tế bào S chết đã truyền tính gây bệnh cho các tế bào R sống. Đây được gọi là hiện tượng biến nạp.Chất nào được truyền từ vi khuẩn S chết sang vi khuẩn R sống?Thí nghiệm Avery, McLeod và McCarty (1944)Xác định yếu tố biến nạpHiện tượng biến nạp chứng minh DNA mang tín hiệu di truyềnTế bào S + protease hay RNA-ase : hoạt tính biến nạp còn Protein và RNA không là tác nhân gây biến nạpTế bào S + DNA-ase : hoạt tính biến nạp mất DNA chính là tác nhân gây biến nạpAlfred Hershey và Martha ChaseThí nghiệm của Hershey và Chase (1952)Thí nghiệm của Hershey và Chase (1952)Phần nằm ngoài vi khuẩn chứa nhiều 35S (80%), phần trong các tế bào vi khuẩn chứa nhiều 32P (70%)  DNA được bơm vào trong tế bào. DNA của phage T2 ban đầu xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, sinh sản tạo ra thế hệ phage mới mang tính di truyền, tiếp tục nhiễm các vi khuẩn khác.. Kết luận: Vật chất di truyền của phage T2 là DNAII. Cấu trúc của phân tử DNAThành phần hóa học của DNACấu tạo hóa học của DNA gồm: Gốc phosphate Đường 5-deoxyribose Các base nitơ (A, G, T, C)Quy luật của Chargaff (1951)Trong DNA, số lượng purine (A và G) luôn bằng với số lượng pyrimidine (T và C)A luôn bắt cặp với TC luôn bắt cặp với GPhân tích DNA bằng kỹ thuật tán xạ tia X Franklin và Wilkins (1951)Nguồn tia XMẫu DNAMàng lọcChùm tia XPhiến ảnhM. Wilkins R. FranklinCấu trúc DNA theo Watson-CrickPhân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn. Mạch đơn gồm các nucleotide nối bằng liên kết phosphodiester tạo chuỗi polynucleotide. Mỗi nucleotide có thành phần là đường 5C, nhóm phosphate và base nitơ.Hai mạch nối với nhau bằng các liên kết hydro giữa các base đối diện theo từng cặp (A=T và GC).Đặc điểm quan trọng của mô hình là sự đối song song (anti paralell): Mỗi mạch là một trình tự có định hướng với một đầu là 5’P và đầu kia là 3’OH, hướng của hai mạch đơn luôn ngược nhau trong chuỗi xoắn kép.Số C trong phân tử nucleotideLiên kết phosphodiester giữa hai nucleotideLiên kết hydro giữa các base cùng cặpMô hình cấu trúc DNA của Watson-Crick trưng bày ở London’s Science Museum.James Watson (1928)Francis Crick (1916-2004) và nhiễm sắc thểDNA có trong tất cả các loại tế bào từ vi khuẩn đến người. Ty thể và lục lạp có DNA riêng.Sự khác nhau về thành phần cấu tạo và tổ chức DNA trong tế bào giữa Prokaryote và Eukaryote: DNA ở Prokaryote có dạng vòng, cuộn lại hoặc ở dạng siêu xoắn. DNA ở Eukaryote được tổ chức thành nhiều nhiễm sắc thể (NST) trong nhân tế bào. Mỗi NST chứa 1 phân tử DNA mạch thẳng. Mỗi loài có số NST và hình dạng đặc trưng riêng.DNA trong tế bào ở dạng xoắn và cuộn thật chặtCác dạng DNA của vi khuẩnDạng vòng trònDạng xoắnDạng siêu xoắnĐộ lớn của DNADạng DNACơ thểSố lượng cặp baseDNA nhiễm sắc thểĐộng vật có vú6 x 109Thựcvật2 x 108 - 2 x 1011Nấm 2 x 107 - 2 x 108DNA ty thểĐộng vật16 x 103 - 19 x 103Thực vật bậc cao150 x 103 - 250 x 104Nấm17 x 103 - 78 x 103Tảo xanh16 x 103protozoa22 x 103 - 40 x 103DNA lục lạpThực vật bậc cao120 x 103 - 200 x 103Tảo xanh180 x 103Nhiễm sắc thể của EukaryoteNST của Eukaryote gồm DNA và các protein.Nucleosome là đơn vị cấu trúc của NST, gồm sợi DNA dài 140 cặp base quấn quanh 8 phân tử protein histone.Các nucleosome nối với nhau qua một histone trung gian H1.Chromatin (chất nhiễm sắc) là phức hợp của các nucleosome xếp khít nhau.Sợi chromatin với nhiều lần xoắn uốn khúc gắn với các protein không histone tạo thành nhiễm sắc thể.NucleosomeDNA nốiCấu trúc nuleosomeNucleosomeSợi chromatin gồm các nucleosome “đóng gói”Vùng nhiễm sắc thể ở dạng lỏng lẻoVùng nén chặt của nhiễm sắc thểNhiễm sắc thể kỳ giữaChuỗi xoắn kép DNACác mức độ tổ chức của nhiễm sắc thểCác loại DNA DNA có nhiều dòng họ cấu trúc khác nhau: A, B, C, , Z. Dạng B thường gặp nhất trong điều kiện sinh lý bình thường theo mô hình Watson-Crick. Dạng Z có chiều xoắn ngược về bên trái theo hình zig-zăc.Dạng B Dạng ZDạng DNASố cặp base của một vòng xoắn (n)Góc xoắn so với mặt phẳng của base (độ)h- khoảng cách thẳng đứng giữa hai base kề nhau (Å)Đường kính r của chuỗi xoắn kép (Å)A11+ 32,72,5623B10+36,03,3819C9,3+38,63,3219Z12-30,03,7118III. Sao chép DNASao chép theo khuôn và bán bảo tồnA luôn bắt cặp với T; G luôn bắt cặp với C  Trình tự các nucleotide trên một mạch sẽ xác định chính xác trình tự đặc hiệu các nucleotide trên mạch bổ sung với nó.Hai mạch cũ của DNA được tách ra để mỗi mạch làm khuôn tổng hợp mạch mới giống với cặp mạch ban đầu.Mỗi phân tử DNA con sẽ mang một mạch cũ và một mạch mới.  Đây chính là kiểu sao chép bán bảo tồn.Thí nghiệm của Meselson và Stahl (1958)Cơ chế chung của sự sao chép DNACác liên kết hydro phải bị phá vỡ và tách rời hai mạch.Phải có đoạn mồi (primer).Có đủ 4 loại ATP, GTP, TTP, CTP bắt cặp bổ sung với các nucleotide trên mạch khuôn.Mạch mới phải được tổng hợp theo hướng 5’P  3’OH.Các nucleotide mới được nối lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị.Mỗi bước được xúc tác bởi một enzyme đặc hiệu để đảm bảo nhanh chóng, chính xác.- Các enzyme sao chép đi dọc mạch mẹ theo hướng 3’  5’ để tạo mạch bổ sung theo hướng 5’ 3’.- Hai mạch DNA được tách ra để bắt đầu sao chép, điểm tách ra tạo thành chẻ ba sao chép (replication fork). - Mạch mới luôn được tổng hợp theo hướng 5’  3’Trên một mạch khuôn, sự tổng hợp sẽ hướng từ ngoài vào chẻ ba  mạch khuôn trước.Trên mạch còn lại, sẽ tổng hợp theo hướng từ chẻ ba ra ngoài bằng cách tạo ra các đoạn Okazaki rồi nối lại  mạch khuôn sau.Cơ chế chung của sự sao chép DNAMạch khuôn sauMạch khuôn trướcMạch DNA conĐoạn OkazakiLigasePolymerase IProtein ổn định mạch (SSP-protein)HelicaseChẻ ba sao chépPolymerase IIIPrimaseĐoạn mồi RNADNA mẹSao chép DNAGyraseGiai đoạn khởi sự Protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự sao chép (replication origin hay ori) và gắn vào. Enzyme Gyrase cắt DNA làm tháo xoắn ở hai phía của protein B.Enzyme Helicase cắt liên kết hydro giữa hai base bắt cặp, tạo chẻ ba sao chép.Các protein căng mạch (single - strand binding protein hay SSB-protein) gắn vào các mạch đơn DNA làm chúng tách thẳng ra, không xoắn lại được.Giai đoạn nối dài DNA polymerase III gắn vào mạch khuôn, lắp các nucleotide bổ sung vào vị trí tương ứng, theo hướng 3’OH của mạch đang tổng hợp.Nếu lắp sai, DNA polymerase III dùng hoạt tính exonuclease 3’ 5’ lùi lại cắt bỏ đi nucleotide sai, lắp cái đúng vào và tiếp tục sao chép. Mạch trước: mạch mới được tổng hợp theo hướng 5’  3’ vào chẻ ba sao chép. Mạch sau: mạch mới được tổng hợp theo hướng 5’  3’ từ chẻ ba ra ngoài. Emzyme primase tổng hợp đoạn mồi (primer) RNA (khoảng 10 nucleotide) gần chẻ ba. DNA polymerase III nối thêm vào đoạn mồi RNA để tạo thành các đoạn Okazaki dài khoảng 1000 – 2000 nucleotide.DNA polymerase I dùng hoạt tính exonuclease 5’  3’ cắt bỏ mồi RNA, lắp các nucleotide vào chỗ trống và tổng hợp tiếp theo hướng 5’  3’.Enzyme ligase nối liền các đoạn DNA lại với nhau, hoàn thành việc tổng hợp mạch sau. Sao chép ở mạch sauNhiễm sắc thể ở tế bào E.coli chỉ là một sợi DNA vòng tròn, chỉ có một điểm ori.Bộ gen của Prokaryote chứa khoảng 4,7*106 cặp nucleotide, thường chỉ có một replicon (đơn vị sao chép).Tốc độ sao chép ở E.coli diễn ra rất nhanh (khoảng 1000 nu/giây)Sao chép nhiễm sắc thể ở ProkaryoteSao chép nhiễm sắc thể vi khuẩnSao chép nhiễm sắc thể ở EukaryoteEukaryote có số lượng DNA lớn hơn nhiều so với Prokaryote  có nhiều nhiễm sắc thể, mỗi NST gồm một sợi DNA thẳng liên kết với protein.DNA ở Eukaryote có nhiều replicon.Tế bào Eukaryote có cơ chế kiểm soát quá trình sao chép, không sao chép tại điểm ori đã qua sao chép.Tốc độ sao chép chậm hơn so với Prokaryote (khoảng 50 nu/giây).Sao chép nhiều replicon ở EukaryoteIV. CÁC CƠ CHẾ SỬA SAI VÀ BẢO VỆ DNACác dạng sai hỏng DNAGãy hay đứt mạchMất base nitơ  base tương ứng không có cặp (vd: mất purine)Gắn nhóm mới vào base nitơ bằng liên kết cộng hóa trị (vd: gắn nhóm methyl –CH3)Biến đổi base nitơ (vd: cytosine thành uracil)Base bắt cặp sai Tạo dimer thymine bằng liên kết cộng hóa trị giữa 2 thymine liền kềSửa sai trong sao chépTổng hợp DNA in vitro, sai sót là 1x10-5. Trong cơ thể sinh vật (in vivo), sai sót là 1x10-9.Quá trình sao chép ở cơ thể sinh vật có độ chính xác cao. Do: Hướng sao chép luôn từ đầu 5’  3’ để việc sửa sai được chính xác.Các DNA polymerase I và III vừa có hoạt tính polymerase hóa vừa có hoạt tính exonuclease 5’  3’, 3’  5’. Vị trí base saiBase sai bị cắt bỏDNA polymerase lắp base đúng vàoSửa sai trong quá trình sao chépSửa sai khi bị đột biếnDNA có thể bị biến đổi khi không sao chép bởi các tác nhân vật lý và hóa học, gây ra đột biến.Cơ thể sinh vật có cơ chế sửa sai để giữ tần số đột biến ở mức thấp.Có nhiều enzyme đặc hiệu nhận biết các sai hỏng trên DNA (liên kết cộng hóa trị sai giữa base với các chất hóa học khác và giữa các base liền kề trên một mạch, bắt cặp sai giữa các base)Sửa sai trực tiếpTrường hợp dimer thymine, các enzyme photolysae có thể trực tiếp loại bỏ các liên kết dimer thymine qua phản ứng quang hoạt hóa.Sửa sai gián tiếpNhư sửa sai khi sao chép: các enzyme nhận biết gắn vào trình tự sai và cắt bỏ đoạn sai, sau đó dựa vào mạch đơn đúng làm khuôn để tổng hợp lại chỗ bị cắt cho đúng.Cơ chế sửa sai DNA ngoài quá trình sao chépSửa chữa base bắt cặp saiEnzyme sửa chữa cắt bỏ base saiDNA polymerase bổ sung base đúngBase bắt cặp saiSửa chữa bằng cách cắt bỏ Base bị biến đổiMột base trong DNA hư hỏng dẫn đến bị mất chức năngEnzyme sửa chữa cắt bỏ base biến đổi và vài base kế cậnDNA polymerase bổ sung các base đúngSửa sai DNA trực tiếp và gián tiếp trong đột biến dimer thymine Tia cực tímSửa sai bằng cách cắt bỏSửa sai bằng phản ứng quang hoạt hóaDimer thymineDimer thymineEnzyme liên kếtÁnh sáng cắt liên kết dimerEnzyme được giải phóngDimer được sửa chữaChuỗi DNA đã được sửa saiChuỗi DNA đã được sửa saiGián tiếpTrực tiếpCác hệ thống bảo vệ DNASự methyl hóa (gắn nhóm –CH3) ở những điểm nhất định trên DNA. Enzyme endonuclease (cắt DNA ở giữa) có thể nhận biết DNA lạ, cắt và loại bỏ chúng.Hệ thống cấp cứu (SOS) được mở ra khi DNA bị sai hỏng nhiều.Các hệ thống sửa sai (hệ thống bảo vệ DNA) theo hai kiểu: Sửa sai bằng cách cắt bỏ chỗ sai và tổng hợp lại dựa theo mạch đúng còn lại. Sửa sai nhờ cơ chế tái tổ hợp và các cơ chế khác. TelomereTelomere là những trình tự DNA không mã hóa, ngắn và đơn giản, lặp lại nhiều lần, nằm ở phần cuối của các nhiễm sắc thể eukaryote.Có chức năng bảo vệ thông tin di truyền trên nhiễm sắc thể.Sẽ mất dần sau mỗi lần sao chép.Được tổng hợp bởi enzyme Telomerase (có nhiều trong các tế bào phân chia nhiều lần như protozoan, sinh vật đơn bào, tế bào ung thư).Sao chép ở đầu cuối nhiễm sắc thểCÁC ĐIỂM CẦN NHỚCác thí nghiệm chứng minh DNA là chất di truyền: TN của Griffith (1928), Avery và cs (1944) và TN của Hershey và Chase (1952).Thành phần và mô hình cấu trúc xoắn kép DNA theo Watson-Crick, quy luật của Chargaff (1951) về sự bắt cặp base nitơ.Hình dạng và các mức tổ chức của nhiễm sắc thể Sự sao chép DNA theo khuôn: TN Meselson và Stahl (1958).Các enzyme trong quá trình sao chép DNA.Cơ chế sửa sai DNA.Hệ thống bảo vệ DNA, Telomere.