Di truyền học virus, vi khuẩn tái tổ hợp DNA

DI TRUYỀN HỌC VIRUS, VI KHUẨN TÁI TỔ HỢP DNAChương VIIdnthI. DI TRUYỀN HỌC CỦA VIRUSCấu tạo virusBộ gen là một phân tử acid nulceic nhỏ dạng vòng hay thẳng (DNA hay RNA, mạch đơn hay kép).Vỏ protein (capsid) hình que, ống xoắn hay đa diện.Một số có màng bao (envelope) bên ngoài.Virion (hạt virus): virus ở giai đoạn ngoài tế bào, được hấp thu ở bề mặt tế bào chủ.Cấu tạo của virusa. Virus không có màng baob. Virus có màng baoBacteriophageHay còn gọi là phage (virus của vi khuẩn, thực khuẩn thể) gồm ba phần: Phần đầu đa diện gồm vỏ protein bọc lấy bộ gen.Bao đuôi bằng protein hình ống dài.Sợi gốc để bám vào vi khuẩn khi gây nhiễm.BacteriophageBacteriophage có 2 dạng:Độc (virulent), khi sinh sản làm chết tế bào chủ (tan – lytic cycle). Ôn hòa (temperate) có thể sinh sản theo hai cách: không làm chết (tiềm tan – lysogenic cycle) hay làm chết tế bào chủ (tan – lytic cycle).Bacteriophage T chẵn(Bao đuôi)(Cổ)(Sợi đuôi)(Đĩa gốc)(Đầu)(Gai)Kích thước virusSao chép của virusVirus là những sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc. Tên virus phụ thuộc vào loại tế bào mà nó ký sinh.Virus dùng các enzyme, chất dinh dưỡng và các chất khác của tế bào chủ để sinh sản.Tùy theo bộ gen là DNA (đơn hay kép) và RNA (đơn hay kép) mà virus có kiểu sao chép khác nhau.Sao chép của virus DNAPhiên mã gen virusDịch mãSao chép DNA viruscapsid virusMàng tế bào chủMàng tế bào chủMàng nhân của tế bào chủThâm nhậpPhóng thíchMàng baoProtein màng tế bào (chất nhận)RNA PoliovirusRNA HIVBản sao RNADịch mã thành các enzyme, protein vỏSao chép RNAProtein vỏ kết hợp vớI RNA(Trưởng thành)Protein vỏ kết hợp vớI RNA(Trưởng thành)Phóng thích các virion mớiDùng enzyme phiên mã ngược để tổng hợp DNAHình thành dạng DNA mạch képXen vào NST của tế bào chủMột chuỗI DNA dùng làm khuôn để tổng hợp RNA virusSao chép của RNA virusDịch mã thành các enzyme, protein vỏCapsidRNAVIrionSao chép của virus RNAPhóng thích các virion mớiCấu trúc của phage T4Cơ chế sinh sản của bacteriophageChu trình tan (lytic cycle)Tiến trình ở phage T4:Sợi đuôi phage T4 bám trên bề mặt vi khuẩn E.coli tiêm DNA vào trong tế bào.E.coli phiên mã và dịch mã gen virus.DNA tế bào chủ bị phân hủy. Bộ gen virus điều khiển tế bào chủ tổng hợp các thành phần của virus.Các thành phần của phage kết hợp lại thành viron.Enzyme lysozyme phá vỡ vách tế bào vi khuẩn, phóng thích các virion.Chu trình tan của phage1.QUÁ TRÌNH BÁM Phage bám trên vách tế bào vi khuẩn.2.XÂM NHẬPPhage xuyên qua vách và màng tế bào vi khuẩn, bơm DNA vào trong tế bàoDNA vi khuẩn bị phá hủy3. SINH TỔNG HỢPDNA phage điều khiển quá trình trao đổi chất của tế bào sản xuất các thành phần của virus – protein và các bản sao DNA phageProtein vỏ và sợI DNA của phage được tổng hợpCác thành phần của phage kết hợp lại với nhau4. GIAI ĐOẠN TRƯỞNG THÀNH5. PHÓNG THÍCHTế bào vi khuẩn tan vỡ, phóng thích các phage dã trưởng thànhProtein của phageChu trình tiềm tan (lysogenic cycle)Tiến trình ở phage  :Phage  gắn lên bề mặt vi khuẩn và tiêm DNA vào.DNA phage tạo vòng tròn trong tế bào chủ và tham gia vào 1 trong 2 chu trình: tan hay tiềm tan.Chu trình tiềm tan (lysogenic cycle)Tiến trình ở phage  :Ở chu trình tiềm tan: Bộ gen phage gắn vào bộ gen vi khuẩn tạo thành prophage.Prophage được sao chép bình thường trong tế bào chủ.Tế bào nhiễm có thể sinh ra nhiều tế bào con có chứa prophage.DNA phage có thể tách ra khỏi prophage để đi vào chu trình tan.Phage  gắn lên bề mặt vi khuẩnDNA của phage tiêm vào vi khuẩn có thể được sao chép hay gắn vào bộ gen vi khuẩnDNA phage tạo vòng trònChu trình tanChu trình tiềm tanDNA phage được gắn vào bộ gen tế bào chủ tạo thành prophageSao chépDNA phage tách ra khỏi prophageSao chép DNA phageHình thành các virion mớiTế bào vi khuẩn tan rã, phóng thích các phage  Chu trình tiềm tanTóm tắt chu trình sống của bacteriophageVirus thực vật và các viroidVirus thực vậtĐa số có bộ gen là RNACapsid hình queCác đơn vị protein- capsomer- xếp hình xoắnXâm nhập vào tế bào thực vật qua cầu liên bàoViroidLà sợi RNA trần, dài khoảng vài trăm nucleotideKhông có proteinViroidVirus đốm thuốc lá (TMV)Các dạng virus thực vậtCon đường xâm nhập của virus vào tế bào thực vậtĐậu nành khảm virus (SMV)Thuốc lá khảm virus (TMV)Xà lách khảm virusBí đỏ khảm virusKhoai tây nhiễm virusVirus động vậtVirus động vật có bộ gen đa dạngGây nhiều bệnh nghiêm trọng, có liên quan đến bệnh ung thư và AIDSCó bốn nhóm lớn:dsDNAssDNAdsRNAssRNAPhân loại virus động vật dựa trên kiểu acid nucleic của bộ genPapilloma: sùi mào gàWarts: mụn cócCervical cancer: ung thư cổ tử cungSores: lở loétSmallpox: bệnh đậu mùaRoseola: sốt phát ban (bệnh ban đỏ)Diarrhea: bệnh tiêu chảyRabies: bệnh dạiMeasles: bệnh sởiMumps: bệnh quai bịLeukemia: bệnh bạch cầuMột số hình dạng phổ biến của virus động vậtInfluenza Virus H5N1 Rabies virus Herpes virus AdenovirusEnterovirusFMDV-foot &mouth disease virusHepatitis B virusPapillomavirusParamyxovirusViroid và PrionLà hai dạng sống đơn giản nhấtViroid là những phân tử ARN vòng, dạng trần không có vỏ capsit, mạch đơn Viroid không mã hóa bất kì một prôtêin nào và sự nhân lên của chúng phụ thuộc vào sự hoạt động của enzyme của tế bào chủ. Viroid gây nhiều bệnh ở thực vật như bệnh hình thoi ở khoai tây và bệnh hại cây dừa.Prion (PROteinaceous INfectious particle) là phân tử protein và không chứa axid nucleic. Trong cơ thể bình thường có thể có sẵn prion nhưng chúng không gây bệnh. Trong một điều kiện nào đó prion có thể thay đổi cấu trúc và gây bệnh. Prion gây nhiều bệnh nguy hiểm ở động vật và người, gây thoái hóa hệ thần kinh trung ương và giảm sút trí tuệ như bệnh bò điên, bệnh kuru ở người.ách nhân lên của prionFigure 19.11 Model for how prions propagateII. DI TRUYỀN HỌC VI KHUẨNCấu tạo của vi khuẩnHình cầu, hình que, chuỗiKhông có cấu trúc nhân, DNA nằm trong tế bào chất. Có màng bao tế bào. Bên ngoài là lớp vách. Một số có capsule bên ngoài vách.Di chuyển nhờ cấu trúc flagellaHình dạng phổ biến của vi khuẩnSinh sản ở vi khuẩnVi khuẩn sinh sản bằng cách nhân đôi.Trao đổi thông tin di truyền bằng cách:Biến nạp (transformation)Tải nạp (transduction)Tiếp hợp (conjugation)Sinh sản bằng cách nhân đôi ở vi khuẩnBiến nạp (transformation)Là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng DNA Được khám phá năm 1928 bởi Griffith Đối tượng nghiên cứu: Streptococcus pneumoniae, Bacilllus subtilus, Haemophilus influenzae Điều kiện biến nạp: Tế bào nhận phải có khả năng dung nạp DNA phải có mạch képThí nghiệm của Griffith về hiện tượng biến nạp ở StreptococcusCơ chế phân tử của sự biến nạpTải nạp (transduction)Là hiện tượng chuyển DNA của vi khuẩn này vào vi khuẩn khác nhờ bacteriophage.Được khám phá bởi Josua Lederberg và Norton Zinder vào năm 1952. Đối tượng vi khuẩn nghiên cứu là Salmonella typhimurium với 2 chủng:LA-22, với phe– trp– met+ his+ LA-2, với phe+ trp+ met– his–Thí nghiệm chứng minh tải nạpTải nạp chung (general transduction): phage mang bất kỳ gen nào của vi khuẩn A sang vi khuẩn B.Tải nạp chuyên biệt (special transduction): phage chỉ mang một vài gen nhất định.Có hai dạng tải nạp:Tiếp hợp (giao nạp - conjugation)Là hiện tượng chuyển gen giữa 2 tế bào cho và nhận bằng cách tiếp xúc trực tiếp.Phát hiện vào năm 1953 bởi Hayes.Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn dạng F+ (tế bào cho) và dạng F- (tế bào nhận).Tiếp hợp (giao nạp - conjugation)F+ (fertility – hữu thụ) tương đương giống đực.F- (thiếu yếu tố F) tương đương giống cái. Khi hiện tượng tiếp hợp xảy ra, tế bào F+ sẽ truyền gen sang tế bào F-. F- sẽ biến thành F+ do nhận được phần tử di truyền là episome.Tần số lai F+X F- rất thấp (10-6).Dạng Hfr có tần số lai với F- cao hơn F+ 104 lầnQuá trình tiếp hợp ở vi khuẩnPlasmidLà phần tử DNA mạch đôi, dạng vòng Tồn tại và tự sao chép độc lập với DNA vi khuẩnCó thể gắn xen vào và được sao chép cùng lúc với DNA vi khuẩnNhiễm sắc thể và plasmic ở vi khuẩnFigure 27.8 A prokaryotic chromosome and plasmidsEpisomeLà một nhân tố di truyềnCó thể tồn tại như một plasmid hay được gắn vào DNA vi khuẩnVí dụ: nhân tố FTransposonLà các phần tử di động ở vi khuẩn, có 2 dạng: những đoạn DNA ngắn mang thông tin di truyền (trình tự xen đoạn, insertion sequence, IS) những đoạn DNA lớn chứa nhiều gen khác nhau (transposon). Có khả năng di chuyển vị trí trong bộ gen.Sự dời chỗ của transposon là một dạng tái tổ hợp giữa transposon và DNA đích.Trình tự xen đoạn ISPhức hợp transposonTransposonSự chuyển vị của transposon không cần sự tương đồng giữa trình tự DNA cho và nhận.Hậu quả: Có thể làm thay đổi trạng thái hoạt động của gen đích. Gây đột biến trên DNA (mất đoạn, đảo đoạn hay chuyển đoạn). Phá vỡ cấu trúc nhiễm sắc thể.III. KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP DNARestriction endonucleaseEnzyme cắt hạn chếĐược V. Arber chứng minh có trong tế bào vi khuẩn vào năm 1962.Có khả năng phân biệt được DNA tế bào chủ và DNA lạ. Hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn.Cắt DNA ở giữa (hoạt tính endonuclease) một cách đặc hiệu, tại điểm nhận biết (recognition site) có trình tự 4-6 cặp nucleotide đối xứng đảo ngược nhau (palyndrom).Mỗi enzyme cắt hạn chế có trình tự nhận biết (palyndrom) đặc trưng.Kỹ thuật cắt DNA với enzyme retrictionThu nhận genTách DNA từ bộ gen để lập ngân hàng gen (thư viện gen, genomic DNA libaries) Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học (vd: gen mã hóa hormon tăng trưởng somatostatin) Sinh tổng hợp gen từ mRNA của gen tương ứng nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase)Các vector chuyển genLà những phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào và mang những đoạn gen cần thiết.Yêu cầu của một vector chuyển gen:Có trình tự xuất phát sao chép (ori)Có trình tự nhận biếtCó trình tự điều hòa phiên mãMang các gen đánh dấuCác loại vector chuyển gen Plasmid chứa các gen kháng thuốc Bacteriophage  Cosmid Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC) Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC)Plasmid pBR332Bacteriophage VectorsNhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩnNhiễm sắc thể nhân tạo nấm men Tạo DNA tái tổ hợpCác ứng dụng của kỹ thuật di truyềnTạo dòng phân tử, PCRXác định trình tự gen dễ dàng, thuận lợi để nghiên cứu DNA, RNACông nghệ proteinChẩn đoán bệnhChọn tạo giốngLiệu pháp genCây thuốc lá chuyển genCây phát sáng do biểu hiện của gen Luciferase chuyển từ con đom đóm.Luciferase là enzyme xúc tác phản ứng phát sáng.Đây là thí nghiệm cổ điển chứng minh gen động vật có thể được chuyển vào thực vật.Daffodil (thủy tiên hoa vàng)