Đề tài Vector - Khái quát chung về các loại Vector

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ((((((((((
VECTOR KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÁC LOẠI VECTOR Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện : TS. TRẦN THỊ DUNG PHẠM THÀNH THÁI Thành phố Hồ Chí Minh 2008 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ VECTOR : Vector : là phương tiện truyền thông tin di truyền vào tế bào. Gồm : Hệ thống vector có bản chất virus (dựa trên virus): retrovirus, adenovirus và virus kết hợp adeno (Adeno associated virus – AAV). Một số vector có bản chất virus nhưng ít được sử dụng hơn : Herpes simple virus I (HSV–1), virus đậu mùa hay Baculovirus,… Hệ thống vector không có bản chất virus bao gồm các phân tử DNA, RNA tại chỗ được khuyết đại trong tế bào vi khuẩn hay các tế bào eukaryote (plasmid, cosmid, bacteriophage,…) và các oligodeoxyribonucleic hay những phân tử tương tự được tổng hợp in vitro bằng phương pháp nhân tạo. Các vector cần thỏa mãn các yêu cầu sau : Có trình tự khởi đầu sao chép (ori – origin of replication) để có thể tự sao chép và tồn tại độc lập. Có các vị trí nhận biết đơn (single recognition sides – SRS), nơi các enzyme hạn chế nhận biết để cắt rời để ghép đoạn gene ngoại lai. Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu sao chép để tránh cắt nhầm. Có trình tự khởi động (promoter) để tiến hành phiên mã gene ngoại lai. Chứa các gene chỉ thị (marker gene) (thường là các gene kháng chất kháng sinh) để có thể phát hiện ra thể tái tổ hợp. Ngoài ra còn có các đặc tính khác như : chứa gene vô hiệu hóa các gene không mong muốn được gắn vào. Có thêm các trình tự như RBS (ribosome blinding site – vùng liên kết với ribosome để dịch mã),… Việc chọn lựa các vector phụ thuộc vào : Tế bào mục tiêu và những đặc tính của nó. Vd: khả năng tải nạp ex vivo (chuyển gene vào tế bào bên ngoài cơ thể) và dung hợp vào bệnh nhân. Thời gian biểu hiện cần thiết. Kích thước của vật liệu di truyền cần chuyển. Ứng dụng chủ yếu của vector chuyển gene là: Tạo dòng (cloning) và khuếch đại (amplification) một đoạn trình tự của DNA. Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA. Chuyển gene vào tế bào động – thực vật. Chuyển gene mã hóa một loại protein chức năng (hay một thực thể sinh học) vào tế bào nhằm thay đổi sự biểu hiện của gene nội sinh. Sản xuất protein, RNA,… CÁC VECTOR CÓ BẢN CHẤT VIRUS Sử dụng virus trong chuyển gene có lợi là chúng không làm thay đổi sự điều hòa hoạt động của gene chủ, tuy nhiên các vector virus này có khả năng tạo nên chủng virus mới, nó có thể mạnh và nguy hiểm hơn chủng đã dùng làm vector rất nhiều. Một số virus tạo vector và đặc tính của chúng Virus  Genome  Protein virus  Lý tính  Bệnh ở động vật   Retrovirus  7 – 10kb, RNA đơn  Gap, Pro, Pol, Env  Ø ~ 100 nm, có vỏ bọc  Cảm ứng khối u, suy giảm miễn dịch   Adenovirus  36kb, DNA thẳng – kép  Hơn 25 loại protein  Ø ~ 70 – 100 nm, không vỏ bọc  Cảm lạnh, viêm kết mạc, dạ dày, ruột   AAV  4,7kb, DNA thẳng – đơn  Rep, Cap  Ø ~ 18 – 26 nm, không vỏ bọc  Chưa biết   HSV – 1  152kb, DNA thẳng – kép  Hơn 18 loại protein  Ø ~ 110 nm  Loét miệng, mụn cóc, viêm bộ phận sinh dục, viêm não   Virus đậu mùa  190kb, DNA thẳng – kép  Hơn 198 khung đọc (ORF)  Chữ nhật 350 – 270nm, có vỏ bọc  Virus được làm nhược độc, điều chế vaccin đậu mùa   Baculovirus  80 – 230kb, DNA vòng – kép  Hơn 60 loại protein  Chữ nhật 27 – 45nm, có vỏ bọc  Không gây bệnh ở động vật có vú, gây bệnh ở côn trùng   Vector retrovirus Retrovirus Các retrovirus có đường kính trung bình 100nm. Vỏ bao bọc chứa những phân tử glycoprotein, chúng quyết định tính chuyên biệt cho tế bào mục tiêu thông qua sự gắn kết tương đồng lên recepter của tế bào đích. Retrovirus chứa hai bản sao của mạch RNA đơn dài khoảng 5 – 10kb, chúng có thể nhận các gene chuyển (transgene) có kích thước khoảng 8kb. Bộ RNA đơn được sao chép thành phân tử DNA mạch đôi, sáp nhập vào bộ gene của vật chủ, tồn tại và duy trì lâu dài sự ổn định. Nguyên tắc hoạt động của Retrovirus là gắn các gene chuyển vào NST tế bào đích. Sau khi gắn lên receptor, RNA đi vào cytoplasm và sao chép thành DNA mạch đôi nhờ enzyme reserse transciptase (có thêm chúc năng RNase – phân hủy RNA trong phân tử lai DNA-RNA). Mạch đôi DNA này chuyển vào nhân và sáp nhập vào bộ gene tế bào vật chủ nhờ enzyme integrase được tạo bởi virus. Sự xâm nhập có sự khác nhau giữa các retrovirus. Vd : MLV (Murine Leukimia Virus) chỉ nhiễm vào tế bào đang phân chia, vì DNA chỉ chuyển vào nhân khi màng nhân bị phá vỡ trong quá trình nguyên phân ; HIV thì có thể xâm nhiễm vào tế bào không phân chia, nó có các protein nền (protein matrix) và các protein mã hóa bởi các gene vpr có những tín hiệu định vị nhân, do đó cho phép chúng đưa DNA vào nhân. Enzyme reserve transcriptase (phiên mã ngược) : tổng hợp mạch DNA thứ nhất từ mạch RNA khuôn, DNA polymerase của tế bào chủ sẽ tổng hợp mạch thứ hai. Enzyme integrase : chèn một bản sao DNA virus vào bộ gene tế bào chủ. Giúp retrovirus thoát khỏi sự tấn công của hệ thống miễn dịch hay chính là sự “bền vững” của retrovirus khi chúng đã nhiễm vào tế bào chủ.
Chu trình sống của retrovirus, ở đây là Human Immunodeficiency Virus – HIV Chu trình sống của retrovirus gồm các giai đoạn : Nhiễm virus vào tế bào đích. Phiên mã ngược RNA thành DNA nhờ enzyme reverse transcriptase. Chuyển DNA virus vào nhân. DNA virus sát nhập vào bộ gene tế bào chủ. DNA virus phiên mã thành mRNA bởi promoter trong trình tự LTR. Dịch mã trong cytoplasm tạo các protein do các gene Gag, Pol, Env mã hóa. Hình thành và đóng gói hai mạch RNA virus và các enzyme reverse transcriptase. Các virion (hạt virus) làm “nổ” tế bào và thoát ra ngoài. Gene Gag mã hóa cho protein lõi, capside, nucleoprotein, gene Pol mã hóa cho enzyme reserse transciptase và enzyme integrase, gene Env mã hóa cho protein trong cấu trúc vỏ của virus. Trình tự LTR : là các đoạn lặp dài ở hai đầu genome virus chứa tất cả các tín hiệu cần thiết cho biểu hiện gene của virus. Trình tự ψ+ : là trình tự cần thiết cho quá trình đóng gói. Vector retrovirus Về nguyên tắc có thể thêm các trình tự cần chuyển vào virus, nhưng phương pháp phổ biến hơn cả là thay thế 1 trình tự trên virus bằng trình tự cần chuyển vào để tạo vector tái bản không hoàn toàn. Hệ thống vector retrovirus này gồm hai phần : Cấu trúc vector mang gene : chứa trình tự promoter, trình tự cần cho sự sát nhập vào bộ gene chủ và trình tự cần thiết cho đóng gói vỏ (kí hiệu ψ+(psi)). Nói cách khác là thay thế các gene của virus (gag, pol, env,…) bằng các gene chuyển mong muốn. Dòng tế bào cung cấp protein vỏ virus cần thiết cho sản xuất virus tái tổ hợp gọi là dòng tế bào đóng gói (packing cell line). Các tế bào đóng gói chứa các gene mã hóa cho protein vỏ cần cho sự đóng gói (Gag và Env), nhưng không chứa các trình tự cần thiết cho sự đóng gói ( ψ-) và trình tự LTR.
Để sản xuất các vector retrovirus tái tổ hợp, cấu trúc vector mang gene liệu pháp (therapeutic gene) sẽ được biến nạp vào trong tế bào đóng gói bằng phương pháp vật lý như điện biến nạp,… các gene của dòng tế bào đóng gói sẽ sản xuất các protein và enzyme. Nhờ trình tự đóng gói nằm trên cấu trúc gene nên các tế bào sẽ bao bọc vỏ capside cho vector và hình thành virus tái tổ hợp. Những virus này sẽ thoát ra ngoài, khuyết tán vào môi trường nuôi cấy. Môi trường chứa virus tái tổ hợp sẽ được lọc để tinh sạch virus và sau đó cho virus nhiễm vào tế bào mục tiêu. Virus sẽ bám lên các receptor của tế bào mục tiêu, RNA phiên mã ngược thành DNA và sát nhập vào DNA tế bào chủ. Các gene sẽ phiên mã, tổng hợp protein, đây chính là protein liệu pháp mong muốn.
Quá trình đóng gói retrovirus. Dòng tế bào chứa hai vùng gene, đều có trình tự mang nhân tố phiên mã nhưng không có tín hiệu đóng gói. Vector mang trình tự đóng gói và đoạn gene chuyển. Tín hiệu đóng gói sẽ giúp tế bào đóng gói các vector. Neor là gene marker chọn lọc. Các dòng tế bào đóng gói thường dùng là : ψ-2, ψ-Am, PA12, PA317, PE501, ψ-CRE, ψ-CRIP, GP + E-86, GP + envAM12,… Ứng dụng của vector retrovirus : Vector retrovirus thường được sử dụng trong liệu pháp gene. Đã được sử dụng có hiệu quả nhiều liệu pháp gene chữa bệnh cho người như suy giảm miễn dịch do thiếu hụt enzyme, thiếu máu, tiểu đường,… Tạo động vật chuyển gene như : gà chuyển gene đặc biệt, chuyển gene vào noãn của bò và khỉ,… Đối với trường hợp gà chuyển gene thì các vector phải mang trình tự Env nhận biết các tế bào phôi gà, chúng được tiêm vào trứng gà mới đẻ ; tuy nhiên hiệu quả không cao do phôi gà lúc này đã chứa khoảng 60000 tế bào nên chỉ có một số ít tế bào mang gene chuyển và ít có cơ hội truyền gene chuyển cho các thế hệ sau ; một phương pháp khác có hiệu quả hơn là tiêm virus ở giai đoạn phôi 16 tế bào. Ở trường hợp chuyển gene vào noãn bò, khỉ thì vector retrovirus phải thỏa hai điều kiện sau : vỏ là protein G của VSV (vesicular somatitis virus) có khả năng nhận biết màng phospholipid ; các hạt virus phải được tiêm vào giữa màng trong và màng noãn bào vào lúc màng nhân đã biến mất để RNA virut có cơ hội tốt nhất đến genome của tế bào chủ. Các hạn chế, rủi ro khi sử dụng vector retrovirus : Việc tải nạp các vector retrovirus gặp khó khăn khi các tế bào ở nhiều mô đã biệt hóa, không thể phân chia. Do vậy, các vector retrovirus cần phải cảm ứng để tế bào phân chia. Một hướng khác là tải nạp vào tế bào không phân chia. Hiện nay có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng virus HIV làm vector vì nó có khả năng tải nạp vào tế bào không phân chia. Rất hiệu quả trong việc cài gene chuyển vào tế bào nhận tuy nhiên các vector này chỉ chuyển được một đoạn nhỏ DNA đoạn gene chuyển có thể thiếu các trình tự quan trọng để điều hòa sự biểu hiện của mình. Xuất hiện đột biến chèn khi vector virus chèn vào bên trong hay kề gene nội bào. Đột biến này có thể làm bất hoạt các anti-oncogenes hay hoạt hóa các proto-oncogene gây ung thư. Nguy cơ ung thư khi dùng vector retrovirus đã xuất hiện ở động vật. Anti-oncogene : (các gene ức chế hình thành khối u – tumor suppressor genes) ức chế quá trình tăng sinh của tế bào khối u. Vd : gene p53 nằm trên tay ngắn của NST 17, khoảng 50% bệnh ung thư là do đột biến gene p53. Proto-oncogene (gene tiền ung thư) : đóng vai trò quan trọng trong sự điều hòa phát triển và tăng sinh của các tế bào bình thường. Sản phẩm của proto-oncogene bao gồm các nhân tố phát triển, các receptor của nhân tố phát triển hay các chất truyền tín hiệu của nhân tố phát triển. Khi bị đột biến chúng sẽ chuyển thành oncogene (gene gây ung thư). Sự tái tổ hợp các virus tạo nên các virus hoang dại có ba hình thức : sự tái tổ hợp trong dòng tế bào đóng gói và vector, tuy nhiên các virus này có thể bị loại bỏ khi tiến hành các thử nghiệm kiểm tra ; sự tái tổ hợp ở vector virus có khả năng sao chép ; sự tái tổ hợp giữa vector virus và các virus nội sinh. Sự tái hợp nếu thành công sẽ tạo thành những chủng virus có khả năng sao chép rất nguy hiểm. Do sử dụng virus làm vector nên trong cơ thể sinh vật cũng mang loại virus này. Các virus tuy được thiết kế là một vector tái bản thiếu Vì những lý do trên nên hiện nay phương pháp này chỉ có ý nghĩa trong phòng thí nghiệm, ít được dùng để tạo ra các sinh vật chuyển gene có ý nghĩa thương mại. Một số vector retrovirus : Murine Leukimia Virus (MLV) : Là retrovirus đơn giản với bốn gene Gag, Pro (mã hóa cho enzyme protease), Pol và Env. MLV là vector đầu tiên trong hệ thống retrovirus. Nó được sử dụng khá nhiều vì : Sinh học của MLV được biết rõ. Bộ gene của MLV là bộ gene retrovirus được tạo dòng sớm nhất. Cách xâm nhập vào vật chủ khá hiệu quả. Đa số MLV chỉ có khả năng xâm nhiễm vào tế bào của loài gặm nhấm, ít có khả năng xâm nhập vào tế bào người, trừ trường hợp được thiết kế để xâm nhiễm vào tế bào người. Lentivirus Là một họ của retrovirus, trong đó có HIV. Chúng có khả năng hợp nhất vào genome của tế bào chủ ở pha nghỉ khi tăng sinh và cả khi không tăng sinh. Khả năng này có được do sự có mặt của một trong số các protein virus, có khả năng nhắm tới genome ở vùng nhân. Lentivirus phức tạp hơn MLV, vector lentivirus đang được nghiên cứu rất nhiều do ứng dụng của nó trong liệu pháp gene. Vector dùng genome của lentivirus tạo ra các hạt virus tái tổ hợp có khả năng nhiễm vào tế bào đang phân chia hoặc không phân chia. Chúng chứa LTR đã biến đổi dẫn đến sự bất hoạt của genome virus hợp nhất, điều này làm giảm khả năng tái tổ hợp tạo ra virus mang gene ngoại lai nguy hiểm. Vector này có hiệu quả đặc biệt với việc chuyển gene vào chuột. (Lois, 2003) Ngoài hai loại kể trên, một số retrovirus khác cũng được sử dụng ở các mức độ khác nhau và tùy thuộc vào đặc điểm sinh học của chúng. Một số vector retrovirus khác Tên  Đặc điểm nổi bật   N2  Chứa 2 đầu 3’,5’ LRT, trình tự đóng gói dài với 418 nu gene gag và trình tự codon khởi đầu AUG của gene gag. Có thể tái tổ hợp tạo virus hoang dại.   LNL 6  Chứa 2 đầu 3’,5’ LRT, trình tự đóng gói dài với 418 nu gene gag và đột biến ở codon bắt đầu dịch mã AUG thành codon bất hoạt UAG và phần đầu 3’ của gene env   Nhóm LN  Cấu trúc tương tự LNL 6 nhưng không có đầu 3’ của gene env. Gồm LNSX, LNCX, LXSN. Trình tự kí hiệu là trình tự của các phần trong vector với L là LRT, N là gene kháng neomycin, S là promoter SV40, C là promoter CMV và X là trình tự đa liên kết (polilinker) để giúp chèn các gene liệu pháp vào.   Vector Adenovirus Adenovirus Từ “adeno” xuất phát từ tiếng Lating có nghĩa là “tuyến”, vì lần đầu tiên virus này được phân lập là từ amidam và tuyến vòm họng của người. Adenovirus gây các bệnh về đường hô hấp, chúng có thể nhiễm vào tế bào người không phân chia. Tuy gây bệnh nhưng đây là loại virus được dùng rộng rãi như một vaccin sống mà không có tác dụng phụ trong việc chống lại sự lây nhiễm qua đường hô hấp và viêm dạ dày, ruột. Chính vì thế nên adenovirus có khả năng là một vector chuyển gene hiệu quả và an toàn. Adenovirus có hình khối 20 mặt, DNA mạch kép thẳng dài khoảng 36kb, đầu 5’ chứa đoạn cuối lật ngược dài 100 – 1800 nu (trình tự IRT). Bộ gene gồm các thành phần sau : vùng gene cuối lật ngược (IRT), các gene sớm E (early gene), các gene muộn L (late gene), tín hiệu đóng gói P (packaging signal). Có năm gene sớm gồm : E1A, E1B, E2, E3 và E4. Chúng được phiên mã và dịch mã sau một thời gian ngắn khi các virus xâm nhâp vào tế bào, sau đó tạo thành các chuỗi polypeptid, có chức năng điều hòa. Các gene muộn L tạo thành 11 loại protein khác nhau với 7 protein ở vỏ và 4 protein ở lõi. Các edenovirus bám vào bề mặt tế bào thông qua các thụ thể là protein sợi. Khi vào cytoplasm, các tiểu phần virus sẽ được đưa vào nhân theo tín hiệu định vị nhân nằm trên vỏ capsid. Trong nhân, các gene của adenovirus và gene chuyển sẽ phiên mã và sau đó là dịch mã trong tế bào chất tạo protein virus và protein của gene chuyển. Giai đoạn đầu của quá trình phiên mã được thực hiện bởi enzyme RNA polymerase của tế bào chủ. Sự phiên mã của adenovirus xuất phát từ hai đầu của phân tử DNA thẳng. Tạo thành một phân tử mạch dơn và một phân tử mạch kép, phân tử mạch đơn sẽ cuộn tròn nhờ vào trình tự lật ngược ở hai đầu và mạch mới được tổng hợp từ đuôi 5’, hình thành một phân tử mạch kép mới. Vector Adenovirus Vector có kích thước chèn khoảng 7,5kb. Các promoter sử dụng vector adenovirus được tách từ cytomegalo virus. Hệ vector này chuyển gene tốt nhưng kông bền, do vậy tần số biểu hiện gene thấp. Vector adenovirus thế hệ thứ nhất : được tạo ra bằng cách thay thế trình tự 3kb của gene E1 bằng promoter và gene chuyển. Sự loại bỏ gene E1 làm virus không có khả năng tái bản trong tế bào chủ. Mặc dù vector này biểu hiện mức cao trong các cơ quan khác nhau nhưng chỉ trong thời gian ngắn do sự biểu hiện của gene chuyển gây độc tế bào hay cũng có thể là do bộ máy miễn dịch của tế bào vật chủ làm bất hoạt gene chuyển. Các thế hệ vector adenovirus sau : hủy bỏ các gene E2, E3 và E4 cùng với gene E1. Điều này làm giảm biểu hiện của gene muộn L, giảm đáp ứng miễn dịch tăng thời gian biểu hiện gene chuyển đồng thời làm tăng không gian cho gene chuyển vào. Các adenovirus tái tổ hợp mang gene chuyển sẽ xâm nhiễm vào trong tế bào mục tiêu. Tại đây, DNA tái tổ hợp lại không có khả năng tái tổ hợp vào genome của tế bào chủ nên không bền. Do đó khi dùng liệu pháp gene dựa trên adenovirus cần phải bổ sung adenovirus tái tổ hợp vào tế bào định kì.
Vector adenovirus a)Genome Adenovirus b)Vector Adenovirus c)Tế bào đóng gói Ứng dụng của vector adenovirus : dùng chuyển gene in vivo vào phổi, gan, cơ, mạch máu, mắt, não và khối u ở động vật. Các hạn chế, nguy cơ tiềm ẩn khi sử dụng vector adenovirus : Giới hạn chính của vector adenovirus là thời gian biểu hiện của gene chuyển ngắn (khoảng 1 tháng), do sự đáp ứng miễn dịch với các thành phần protein còn lại của virus. Sự đáp ứng miễn dịch sẽ nhanh chóng loại bỏ các tế bào nhận gene chuyển, có thể gây viêm hoặc rối loạn chức năng của cơ quan tại vị trí nhận gene đó. Cơ chế dung nạp vector adenovirus phát triển có thể gây bệnh bạo phát khi bị nhiễm virus hoang dại có cùng cơ chế, cách nhiễm bệnh. Sự phát triển những chủng virus in vivo, có khả năng sao chép và gây bệnh. Vector Adeno associated virus: Adeno associated virus (AAV) : Virus kết hợp với adeno có kích thước nhỏ, không gây bệnh cho người, có khả năng gắn vào vùng đơn của NST 19 ở người. Bộ gene DNA đơn, dài khoảng 4,7kb. Khả năng sao chép của AAV phụ thuộc vào một loại virus khác gọi là virus giúp đỡ (helper virus) như adenovirus. Do đó chúng có tên là virus kết hợp adeno, dù không gần gũi gì với adenovirus. Bộ gene gồm 2 vùng lật ngược lặp lại ở cuối bộ gene (ITR) và gene Rep và Cap. Trình tự IRT cần thiết cho việc sao chép, đóng gói và sát nhập của AAV Rep : mã hóa cho 4 chuỗi polypeptid có vai trò điều hòa sự sao chép. Cap : mã hóa cho 3 chuỗi polypeptid. Khi AAV xâm nhập vào nhân, polymerase của tế bào chủ chuyển bộ gene của AAV thành sợi đôi và sau đó phiên mã. Vetor AAV Tương tự như vector retrovirus, có thể hủy bỏ các trình tự rep, cap và thay thế bằng gene mong muốn cùng với promoter của nó. Việc loại bỏ hai gene rap, cap làm giảm sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể với vector. Phương pháp phổ biến dùng để đóng gói vector là tạo hai plasmid : plasmid thứ nhất mang gene chuyển và trình tự IRT ; plasmid thứ hai mang gene rep và cap, plasmid này không chứa trình tự IRT nên không thể sao chép và đóng gói thành hạt virus. Việc sản xuất số lượng lớn AAV vẫn còn nhiều khó khăn do sự chuẩn bị một lượng lớn plasmid chứa ITR là không dễ dàng ; và do độc tố của rep làm hạn chế khả năng tạo những dòng tế bào đóng gói ổn định, dùng để khuếch đại các vector ; việc sản xuất cần phải có sự hỗ trợ của một loại virus khác. Vector AAV chuyển gene khá hiệu quả trong lúc tế bào phân chia và cả lúc tế bào nghỉ. AAV biểu hiện chuyển gene 2 năm ở chuột, vài tháng ở chó, tinh tinh và người. Ở người, vector này có thể dùng để điều trị các bệnh mãn tính.
Nguyên tắc tạo vector AAV Quy trình tạo vector tái tổ hợp Plasmid 1 mang gene trị liệu (TG) nằm giữa hai trình tự IRT. Plasmid 2 mang gene mã hóa giúp cho sự sao chép (rep), tạo vỏ (cap) nằm dưới sự kiểm soát của promoter (p) và trình tự polyadenin (p.a). sau khi làm tan tế bào chủ tạo thành các AAV và ADV (Adenovirus). Tách AAV ra khỏi hỗn hợp bằng cách ly tâm và bất hoạt ADV bằng nhiệt. Vector Herpes Simplex virus : Herpes Simplex virus (HSV) : HSV có nhiều dạng. Trong đó có dạng HSV-1 có thể nhiễm và tồn tại rất lâu trong trong tế bào thần kinh, đồng thời chúng có khả năng sinh sản trong nhân. Có cấu tạo từ bốn thành phần : vỏ bọc, teguenzymt, capsid và nhân. Có đường kính khoảng 150nm, trung tâm là nhân chứa DNA mạch đôi, một capsid bao bọc bên ngoài có cấu trúc 20 mặt, bao gồm 160 tiểu phần. Bên ngoài capsid là lớp vỏ định hình có cấu trúc sợi đặc trưng cho HSV có tên là teguenzymt. Ngoài cùng là lớp vỏ với bề mặt có nhiều tua nhỏ. DNA của HSV có kích thước 152kb mã hóa cho hơn 75 loại protein khác nhau. Quá trình nhiễm diễn ra khi virus bám vào tế bào chủ, capsid lọt vào bên trong và chuyển đến nhân của tế bào. Các thành phần của virus sẽ tương tác ức chế quá trình sinh tổng hợp của tế bào vật chủ. Chu trình sinh sản gồm quá trình li giải (sinh tan, gây tan) và pha tiềm tàng. Trong suốt quá trình li giải, chúng nhân đôi và vỏ virus được tạo ra. Trong pha tiềm tàng thì bộ gene củ virus dày lên và đặc lại. Genome của HSV chứa nhiều vùng dài và ngắn gọi là vùng UL (long unique region) và US (short unique region), mỗi bên được bao bởi các trỉnh tự lật ngược. Sự phiên mã các gene sớm nhờ nhân tố VP16 hiện diện trong virion (hạt virus). HSV chứa ba điểm khởi đầu sao chép (ori) : một ori nằm ở giữa vùng UL (OriL), ori thứ hai nằm trong vùng lật ngược US (OriS), ori thứ ba nằm trong mạch kép cuộn tròn cần cho sự sao chép. DNA virus được đóng gói thông qua trình tự đóng gói nằm trong vùng gene cuối của bộ gene. Ở người có nhiều khiếm khuyết gene khác nhau ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương và thần kinh ngoại biên, trong đó bao gồm các khối u, khả năng biến dưỡng, miễn dịch,…ví dụ như hội chứng suy giảm thần kinh mà điển hình là bệnh Alzheimer và Parkinson,… Các bệnh này liên quan đến các tế bào thần kinh nên HSV rất thích hợp để làm vector liệu pháp gene chữa trị những loại bệnh này. Vector HSV Hầu hết các vector dều dựa trên HSV-1 đều hủy bỏ 1 hay nhiều gene cần cho sự sao chép để lấy chỗ gắn gene chuyển và để tránh HSV-1 nhân lên hàng loạt trong tế bào chủ. Do đó các hạt virus HSV-1 sản xuất trong tế bào muốn sao chép thì phải “mượn” gene chủ để biểu hiện. Vector này có thể chứa một gene chuyển trình tự dài đến 25kb, tuy nhiên chúng có thể gây độc cho tế bào in vitro và gây viêm não khi được dùng với liều cao. Mặt khác, HSV có kích thước lớn nên việc thao tác gene trở nên khó khăn hơn. Để khắc phục các vấn đề trên, phiên bản vector HSV mới được phát triển. Vector này bao gồm các thành phần nguyên thủy của HSV như : trình tự khởi động sao chép và các tín hiệu đóng gói được kết hợp trong plasmid của E.coli. những v