Đề tài Thư viện cDNA

THƯ VIỆN cDNA Nhóm 4: Nguyễn Thuý Kiều Nguyễn Hoàng Ngân Trần Thị Thanh Phấn Trần Thị Quế Trần Thị Ngọc Quỳnh I Khái niệm cDNA: - cDNA là phân tử DNA mạch đơn được tổng hợp từ khuôn mRNA hoặc một đọan polyribonucleotide tổng hợp hóa học nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). - cDNA mạch đơn được biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là cDNA kép. - Đọan cDNA kép được gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng cDNA.
II Kỹ thuật tạo cDNA và ngân hàng cDNA: - Tách các mRNA ra khỏi các mRNA khác. - Sử dụng mRNA làm khuôn cùng với enzyme phiên mã ngược và các nguyên liệu dNTP để tạo cDNA. - Tạo dòng cDNA, thu thập các dòng cDNA. - Tìm các cDNA cần thiết bằng cách lai DNA hoặc nhờ các phản ứng miễn dịch.
1 Tách các mRNA ra khỏi các mRNA khác: mRNA chức năng của sinh vật nhân chuẩn vốn không có các intron, có một mũ G đầu 5’, và thông thường một chuỗi khoảng 200 gốc Adenine (đuôi axit polyadenylic [poly(A)]) ở đầu 3’. Đuôi poly(A) cung cấp phương tiện để phân tách các thủy phần mRNA của một mô ra khỏi rRNA và tRNA. Các chuỗi ngắn của 15 gốc thymidin dược gắn với các hạt xenluloza và olygo(dT)-hạt xenluloza được nhồi vào cột. RNA của tế bào sinh vật nhân chuẩn đã tách chiết được cho qua một cột olygo(dT)-hạt xenluloza và các đuôi poly(A) của các phân tử mRNA liên kết nhờ bắt cặp base với chuỗi olygo(dT). Các phân tử tRNA và rRNA không có đuôi poly(A) đi qua cột. mRNA được rút ra từ cột bằng cách xử lý với một chất đệm bẻ gãy liên kết hydro A:T, bởi vậy giải phóng ra các mRNA bắt cặp base.
Sử dụng mRNA làm khuôn cùng với enzyme phiên mã ngược và các nguyên liệu dNTP để tạo cDNA: Sinh tổng hợp mRNA bổ sung. Mồi olygo(dT) được bổ sung vào hỗn hợp mRNA tinh sạch, và enzyme phiên mã ngược với bốn dNTP được sử dụng để tổng hợp DNA từ RNA. Enzyme phiên mã ngược thường không tổng hợp các bản sao cDNA hoàn chỉnh của RNA từ mồi phân tử khuôn (bên phải dưới). Đoạn gấp vòng của sợi DNA đang tổng hợp được tạo ra nhờ enzyme phiên mã ngược cung cấp nhóm 3’OH cho đoạn klenow để hoàn chỉnh sự tổng hợp sợi thứ hai, sử dụng sợi thứ nhất làm khuôn. Sau khi sự tổng hợp sợi thứ hai kết thúc, mRNA được thủy phân bằng enzyme Rnaza H và DNA được xử lý bằng SL nucleaza để tổng hợp các phân tử mạch thẳng đầu bằng không có vòng móc.
3.Tạo dòng cDNA, thu thập các dòng cDNA:

Sơ đồ biểu diễn phương pháp chọn lọc và nhân dòng các phân tử cDNA dài hoàn chỉnh. mRNA tinh sạch (chuỗi trên) được trộn với một tổ hợp olygo(dT)-vùng endonucleaza giới hạn (chữ nhật phải) olygonucleotid (mồi-tay nối). Enzyme phiên mã ngược tổng hợp sợi cDNA thứ nhất (chuỗi dưới) với 5-methy-dCTP (hạt vuông nhỏ) như là một trong bốn dNTP. Cả hai sợi DNA hoàn chỉnh và không hoàn chỉnh được tổng hợp. Biotin (hộp đánh dấu B) được gắn vào các đầu phân tử mRNA. Các vùng nhạy Rnaza I được đánh dấu bằng ngoặc vuông. Các phân đoạn sợi đơn của RNA được phân hủy bởi RnazaI. Các phân tử được biotin hóa liên kết với các hạt nam châm bọc streptavidin (tròn). Sau khi xử lý bằng Rnaza I, các thể lai RNA:DNA dài hoàn chỉnh được biotin hóa, và vì vậy chúng liên kết với streptavidin. Vùng nhạy Rnaza H của phân tử lai của RNA:DNA hoàn chỉnh được đánh dấu bằng dấu ngoặc đơn. Xử lý bằng Rnaza H phân hủy RNA của phân tử lai RNA:DNA liên kết streptavidin và tạo ra phân tử cDNA thứ nhất hoàn chỉnh. Một đuôi poly(dG) được bổ sung vào đầu 3’OH của sợi cDNA thứ nhất. Một olygo(dC)-vùng endonucleaza giới hạn (chữ nhật trái) olygonucleotid (mồi thích ứng) cặp với đuôi olygo(dG) và tạo ra nhóm 3’OH để tổng hợp sợi DNA thứ hai bằng DNA polymeraza. Trong quá trình tổng hợp cDNA thứ hai bằng DNA polymeraza, không một dNTP nào được methyl hóa; Rnaza H loại mọi RNA bắt cặp còn lại; và DNA ligase liên kết các phân đoạn DNA được tổng hợp nội bộ từ các mẫu mRNA không bị phân hủy.Tình tự olygo(dC) mồi-tay nối hoạt động như một khuôn tổng hợpDNA từ nhóm 3’OH ở đầu của đuôi poly(dG). cDNA hoàn chỉnh cuối cùng được cắt bởi hai endonucleaza giới hạn, mỗi enzyme ở mỗi đầu, và nhân dòng vào một vector có các đầu bổ trợ. Sự bán methyl hóa, bảo vệ cDNA khỏi bị các endonucleaza giới hạn cắt, được sử dụng trong nhân dòng do các enzyme này không thể cắt các vùng endonucleaza giới hạn đã bị methyl hóa. Sàng loc thư viện cDNA: Sàng lọc thư viện bằng mẫu dò DNA đánh dấu (lai khuẩn lạc): Các tế bào từ phản ứng biến nạp được cấy lên môi trường agar rắn, dưới các điều kiện cho phép chỉ các tế bào biến nạp phát triển, tế bào không biến nạp không phát triển.
Ghi chú: Từ các khuẩn lạc riêng rẽ hình thành trên các đĩa gốc này, mẫu dò được chuyển sang giá nền rắn như màng nitroxenluloza hay nylon. Các vị trí khuẩn lạc trên đĩa gốc được giữ nguyên giống như trên đĩa giá nền. Các tế bào trên giá nền rắn được phá vỡ, và AND giải phóng ra được làm biến tính, khử protein, và cho bám không thuận nghịch vào giá nền. Mẫu dò DNA đánh dấu được bổ sung vào giá nền để thực hiện phép lai. Sau khi các phân tử mẫu dò không lai được rửa trôi, dùng phép tự chụp ảnh bằng phóng xạ chụp ảnh giá nền để xác định tế bào nào có liên kết DNA đánh dấu. Khuẩn lạc trên đĩa gốc tương ứng với vùng đáp ứng dương tính của phim tia X sẽ được nhận dạng. Các tế bào từ khuẩn lạc dương tính trên đĩa gốc được nuôi tiếp do chúng có thể mang bản thiết kế plasmit-DNA nhân dòng. Sàng lọc miễn dịch thư viện gen (thử miễn dịch khuẩn lạc): Các tế bào từ phản ứng biến nạp được nuôi cấy lên môi trường agar rắn, dưới các điều kiện cho phép các tế bào biến nạp phát triển, những tế bào không biến nạp không phát triển được.
Từ các khuẩn lạc riêng rẽ hình thành trên đĩa gốc này, mẫu từ mỗi khuẩn lạc được chuyển sang giá nền rắn như màng nitroxenluloza hoặc nylon. Các tế bào trên giá nền rắn được phá vỡ và các protein sẽ bám vào giá nền. Gía nền được xử lý bằng một kháng thể sơ cấp, kháng thể này chỉ liên kết với protein đích. Kháng thể sơ cấp không liên kết được rửa trôi, và giá nền được xử lý với một kháng thể thứ cấp, kháng thể này chỉ liên kết với một kháng thể sơ cấp. Mọi kháng thể thứ cấp không liên kết đều được rửa trôi, sau đó tiến hành phản ứng màu, phản ứng chỉ xảy ra khi kháng thể thứ cấp có mặt. Khuẩn lạc trên đĩa gốc tương ứng với đáp ứng dương tính trên đĩa nền được nhận dạng. Các tế bào từ khuẩn lạc dương tính trên đĩa gốc được nuôi cấy do chúng có thể mang bản thiết kế plasmit-DNA chèn mã hóa cho protein liên kết với kháng thể sơ cấp. III. Ưu nhược điểm của kỹ thuật tạo cDNA: Ưu điểm : Các dòng cDNA chứa trình tự liên tục mã hóa của một gen. Những tế bào chuyên hóa tạo ra một số lớn các protein một loại và mRNA tương ứng của protein giàu đó sẽ dễ tách ra để tạo ngân hàng cDNA. Biến nạp cDNA khắc phục được hiện tượng tế bào vi khuẩn không dung nạp gen có cấu trúc mang phần không mã hoá. Nhược điểm: Kỹ thuật tạo cDNA cho ta nhiều gen khác nhau. Mỗi giai đoạn phát triển khác nhau của cơ thể thì sự phiên mã ngược của hệ gen là khác nhau. =>Thiết lập ngân hàng cDNA và chọn lọc gen mong muốn đòi hỏi công phu tỷ mỉ và tốn nhiều thời gian. IV. Ứng dụng: - Tạo dòng các gen mã hoá cho globin của người, động vật và chim, cho protein thuỷ phân ở mắt bò, cho ovalbumin, cho fibrointơ tằm,… - Thành lập thư viện CDNA của khoai mì Các nhà khoa học thuộc CIAT, Colombia và Nhật Bản vừa hòan thành việc xây dựng thư viện cDNA phục vụ cho việc cải tiến giống khoai mì. Khoai mì là loài cây trồng được biết chống chịu tốt với stress phi sinh học, thí dụ như khô hạn và mặn. Nó là nguồn cung cấp carbohydrate lớn thứ ba cho loài người và là nguồn lương thực chủ lực của nhiều nước ở Châu Phi.