Đề tài Thử nghiệm điều chế auto-Vaccine phõng bệnh tiêu chảy do e. coli trên heo sau cai sữa

2 Đƣợc sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG BỆNH TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO SAU CAI SỮA” 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Thử điều chế auto-vaccine phòng tiêu chảy do E. coli trên heo con sau cai sữa cho trại chăn nuôi. 1.2.2. Yêu cầu - Phân lập thành công chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy cho heo con. - Sản xuất auto-vaccine và tiêm thử nghiệm trên heo con sau cai sữa. - Theo dõi đáp ứng miễn dịch trên heo thí nghiệm đối với auto - vaccine điều chế. - Theo dõi ảnh hƣởng của auto-vaccine lên sức khỏe và tăng trƣởng của heo thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện từ khi bắt đầu thí nghiệm 14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vi khuẩn Escherichia coli 2.1.1. Định nghĩa Escherichia thuộc họ Enterobacteriaceae, bao gồm các loại trực khuẩn Gram âm có kích thƣớc khoảng 2-3µm x 0,5µm, di động nhờ các tiêm mao, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Các nhóm vi khuẩn này có mặt thƣờng xuyên trong ruột của động vật, ở phần cuối của ruột non hoặc ruột già, cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Chúng chiếm đến 80% trong thành phần của hệ vi sinh vật hiếu khí đƣờng ruột (Intervet, 1997). Chi Escherichia bao gồm 5 loài: E. coli, E. fergusonii, E. hermanie, E. vulneris, E. blattae. Nguồn gốc tên gọi: năm 1885, tại Munich, Theodor Escherich - một bác sĩ nhi khoa trẻ phát hiện một loài vi khuẩn từ trong tã lót của trẻ em và đƣợc công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune, bốn năm sau, đƣợc giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân ngƣời có công khám phá. Năm 1895, ngƣời ta lại gọi bằng tên Bacillus coli và năm 1896, gọi thành Bacterium coli. Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1991, vi khuẩn kia đƣợc định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli. 4 Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Protebacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Escherichia Loài: Escherichia coli 2.1.2. Đặc tính sinh hóa Nuôi cấy: vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp là 370C (có thể tăng trƣởng ở 100C– 460C), pH thích hợp 6,4 - 7,5. E. coli mọc tốt trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng; sau 24 giờ hình thành khuẩn lạc S có dạng tròn, ƣớt, trắng đục; nếu để lâu trở thành khuẩn lạc R có dạng khô, rìa hơi nhám. Một số hóa chất ngăn chặn đƣợc sự phát triển của E. coli nhƣ: chlorin và các dẫn xuất, muối mật, sodium deoxycholate, sodium tetrathionat, selenite… Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi đƣờng glucose, galactose, lactose, maltose, xylose, rhamnose, mannitol, fructose. Lên men saccharose không đều, không lên men dextrin và glycogen, không sử dụng phenylalanin, ure, gelatin, malonate, adonitol, inositol, không sinh H2S. Để phân biệt E. coli với các vi khuẩn đƣờng ruột khác, ngƣời ta dùng nghiệm pháp IMViC (++--). 2.1.3. Yếu tố kháng nguyên 2.1.3.1. Kháng nguyên thân O Các kháng nguyên O có bản chất lipopolysaccharide (LPS), thƣờng đặc trƣng cho từng loài. Chúng bền với nhiệt độ và cồn, khi đun ở nhiệt độ 1200C trong 2 giờ vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên, có khả năng ngƣng kết và kết hợp. Kháng nguyên O giữ một vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn và 5 một trong số các kháng nguyên này có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Ví dụ nhƣ các type kháng nguyên sau đây:  Ở ngƣời: O2, O4, O75, O9, O18, O22, O1.  Ở bò: O8, O15, O20, O35, O86, O101, O115.  Ở heo: O8, O45, O54, O138, O139, O141, O147.  Ở gia cầm: O1, O2, O8, O11, O78. 2.1.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên K Kháng nguyên K là kháng nguyên giáp mô, che phủ hoàn toàn kháng nguyên O nên không cho kháng thể O gắn kết với các epitop trên kháng nguyên O, làm cho hiện tƣơng ngƣng kết không xảy ra (Lê Huy Chính và ctv, 2001). Kháng nguyên K gồm 3 type A, L, B. 2.1.3.3. Kháng nguyên F (fimbriae) Là kháng nguyên tiêm mao, có hình sợi, dài 4 µm, thẳng hay xoắn, đƣờng kính 2,1 - 7 nm. Chúng tạo nên đặc tính kết dính của vi khuẩn đối với tế bào, đặc biệt là đối với tế bào niêm mạc ruột. Kháng nguyên này cũng chính là yếu tố tạo nên khả năng gây bệnh và khả năng ngƣng kết hồng cầu cho những vi khuẩn có mang chúng. Tuy nhiên khả năng ngƣng kết hồng cầu này lại bị ức chế bởi đƣờng mannose. Gần đây, để tránh nhầm lẫn với cách gọi tên của kháng nguyên giáp mô, ngƣời ta đã dùng danh pháp chuẩn hơn cho các yếu tố kết dính, đƣợc ký hiệu F. Trong đó, K88 thành F4 , K99 thành F5, 987P thành F6 (Orskov, 1992; trích dẫn Broes và Fairbrother, 1993). Kháng nguyên F là kháng nguyên mạnh, khi xâm nhập vào trong cơ thể nó sẽ kích thích cơ thể tạo nên kháng thể đặc hiệu và là cơ sở cho việc chẩn đoán huyết thanh học và xác định type huyết thanh của các dòng E. coli, cũng nhƣ xác định các 6 kháng thể bảo vệ. Vì vậy, các kháng nguyên này đƣợc dùng để chế tạo vaccine phòng bệnh E. coli trên heo con. Các tiêm mao liên quan đến E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo con là F4, F5, F6 và F41. 2.1.3.4. Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella) Kháng nguyên H có bản chất protein, bị hủy bởi cồn, có tính chịu nhiệt, tuy nhiên khi đun 1000C trong 2 giờ thì các tính kháng nguyên, tính ngƣng kết đều bị phá hủy. Kháng nguyên này có ở những dòng E. coli di động. Hiện nay, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 56 loại kháng nguyên H. 2.2. Bệnh tiêu chảy trên heo 2.2.1. Khái niệm Tỷ lệ nƣớc trong phân bình thƣờng chiếm 80%, phân táo bón dƣới 70%, phân nhão 85%, phân lỏng trên 85% (tiêu chảy). Roux đã định nghĩa: “tiêu chảy là một hội chứng đặc trưng bởi sự tống phân nhanh và phân nhiều nước” (Nguyễn Thị Minh An và ctv, 2001). Trên thực tế, tiêu chảy là một biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù ở đƣờng tiêu hóa, thú đi phân lỏng, đôi khi có máu, bọt khí, chất nhầy… Hậu quả quan trọng của tiêu chảy là suy dinh dƣỡng và gây thiệt hại về kinh tế, vì khi bị tiêu chảy bệnh súc sẽ ăn ít; đồng thời, khả năng hấp thu chất dinh dƣỡng cũng giảm và có thể chết thú. Tiêu chảy xảy ra trên mọi lứa tuổi heo. Tuy nhiên, bệnh thƣờng gặp và gây nguy hiểm ở giai đoạn heo con theo mẹ, heo vừa mới cai sữa hoặc tách bầy. Các biểu hiện của tiêu chảy: Tính đàn hồi của da kém, khô niêm mạc hầu họng. Huyết áp hạ. Nƣớc tiểu có ít Cl- và Na+. 7 Giảm thể tích huyết tƣơng. Máu đặc, huyết tƣơng có hàm lƣợng Cl- và Na+ giảm, hàm lƣợng urea tăng. Tiêu chảy có 4 cơ chế chính, đó là: tiêu chảy do phân tiết, tiêu chảy do thẩm thấu, tiêu chảy do rối loạn vận động ruột và tiêu chảy do tổn thƣơng niêm mạc ruột. Tiêu chảy do vi khuẩn E. coli thƣờng theo cơ chế phân tiết, phân nhiều và lỏng (Buddle và Bolton, 1992). Thang thẩm thấu do sự tích tụ của Na+ và Cl- trong lòng ruột làm cho một lƣợng lớn nƣớc di chuyển từ máu vào lòng ruột. Phân đẳng trƣơng (isotonic) so với huyết thanh và có khuynh hƣớng kiềm vì chứa nhiều bicarbonate (đây là một trong các cách giúp phân biệt với bệnh tiêu chảy do tiêu hóa/hấp thu kém ở nhiễm trùng Rotavirus). Hậu quả là thú mất nƣớc và toan huyết. 2.2.2. Nguyên nhân gây tiêu chảy Tiêu chảy là một hiện tƣợng bệnh lý liên quan đến rất nhiều yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát. Vì vậy phân biệt thật rõ ràng nguyên nhân gây tiêu chảy không giản đơn. Đa số các nhà nghiên cứu trong và ngoài nƣớc đề nghị phân chia các nguyên nhân gây tiêu chảy thành 3 nhóm chính nhƣ sau: 2.2.2.1. Điều kiện ngoại cảnh bất lợi Chủ yếu do thời tiết khí hậu quá nóng, quá lạnh hoặc ẩm ƣớt kéo dài. 2.2.2.2. Nuôi dƣỡng không đúng kỹ thuật Thiếu sót đầu tiên là do heo con không đƣợc cho bú sữa đầu. Thức ăn, nƣớc uống kém phẩm chất nhƣ dơ bẩn, ôi mốc, nhiễm trùng, thiếu vitamin (nhất là vitamin A, D) hoặc thiếu chất khoáng (nhất là Fe). 8 2.2.2.3. Vi sinh vật Vi khuẩn: gồm 2 nhóm, đó là vi khuẩn khu trú thƣờng xuyên trong ống tiêu hóa (Enterobacteriaceae) nhƣ E. coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus… và nhóm vi khuẩn tạp nhiễm cùng với thức ăn, nƣớc uống vào đƣờng tiêu hóa nhƣ Staphylococci, Streptococci… loạn khuẩn đƣờng ruột là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở đƣờng tiêu hóa. Virus: ngƣời ta đã chứng minh đƣợc virus là một tác nhân gây tiêu chảy, thƣờng thấy là Rotavirus, Enterovirus, Coronavirus… Ký sinh trùng: tác động thông qua việc tranh chấp chất dinh dƣỡng với ký chủ, tiết độc tố, làm giảm sức đề kháng và làm tổn thƣơng niêm mạc đƣờng tiêu hóa, tạo điều kiện cho các tác nhân khác gây bệnh. Bảng 2.1. Tỷ lệ các vi sinh vật gây tiêu chảy trên heo (Bergeland, 1980) STT Mầm bệnh Tỉ lệ gặp (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Escherichia coli Isospora Rotavirus T.G.E virus Enterovirus Parvovirus Coronavirus (khác T.G.E) Calicivirus Salmonella Treponema hyodysenteriae Không chẩn đoán được 45,6 23,0 20,9 11,2 2,0 0,7 0,5 0,2 0,1 0,1 14,0 9 Qua đó, chúng ta thấy rằng vi khuẩn E. coli đóng một vai trò quan trọng trong các nguyên nhân gây tiêu chảy trên heo. 2.3. Sự miễn dịch 2.3.1. Khái niệm miễn dịch Miễn dịch là khả năng đề kháng của sinh vật chống lại một sinh vật khác và các chất mang trên bản thân chúng những dấu hiệu thông tin di truyền ngoại lai. Tính miễn dịch đƣợc hình thành trong quá trình tiến hóa của sinh vật (Petrov, 1978). 2.3.2. Phân loại miễn dịch Hệ thống miễn dịch trong cơ thể sinh vật đƣợc chia làm hai nhóm: miễn dịch tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu) và miễn dịch thu đƣợc (miễn dịch đặc hiệu). 2.3.2.1. Miễn dịch không đặc hiệu Là phƣơng tiện bảo vệ của cơ thể không nhằm chống lại một loại kháng nguyên cụ thể nào mà chống lại nhiều tác nhân có tính chất khác nhau. Miễn dịch Miễn dịch không đặc hiệu Miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch thụ động Miễn dịch chủ động Miễn dịch thụ động tự nhiên Miễn dịch thụ động nhân tạo Miễn dịch chủ động tự nhiên Miễn dịch chủ động nhân tạo 10 Miễn dịch không đặc hiệu đƣợc qui định bởi đặc tính của giống, loài sinh vật. Loại miễn dịch này đã có sẵn khi cơ thể đƣợc sinh ra và nó đƣợc di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Hệ thống miễn dịch này bao gồm 2 quá trình: quá trình miễn dịch tế bào và quá trình miễn dịch dịch thể.  Quá trình miễn dịch tế bào gồm: da, niêm mạc, hệ bạch huyết, nội tạng (gan, lách), thực bào.  Quá trình miễn dịch dịch thể gồm: kháng thể tự nhiên, bổ thể, interferon, enzyme lysozyme. 2.3.2.2. Miễn dịch đặc hiệu Là sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi xuất hiện kháng nguyên. Kháng nguyên này kích thích cơ thể tạo ra miễn dịch chống lại chính kháng nguyên. Miễn dịch đặc hiệu là quá trình phát sinh và phát triển sự hoạt động của 2 nhóm tế bào lympho T và lympho B với sự phối hợp của đại thực bào. Miễn dịch thu đƣợc hay còn gọi là miễn dịch đặc hiệu là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu đƣợc trong quá trình sống. Miễn dịch thu đƣợc chia ra làm hai loại: miễn dịch chủ động và miễn dịch thụ động. i. Miễn dịch thụ động là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu từ bên ngoài. Nếu quá trình tiếp thu miễn dịch xảy ra hoàn toàn tự nhiên nhƣ trong trƣờng hợp thú con tiếp nhận kháng thể từ thú mẹ qua sữa đầu, hoặc gia cầm con tiếp nhận kháng thể từ gia cầm mẹ qua lòng đỏ trứng, đƣợc gọi là miễn dịch thụ động tự nhiên. Còn miễn dịch thụ động có đƣợc do con ngƣời tạo ra nhƣ trƣờng hợp tiêm huyết thanh để phòng và trị bệnh, đƣợc gọi là miễn dịch thụ động nhân tạo.