Đề tài Sản xuất và ứng dụng chế phẩm diệt muỗi từ Bacillus thuringiensis var.israelensis

Mở Đầu Một trong những tác nhân truyền nhũng bệnh hiểm nghèo cho người như sốt rét, sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản… là do muỗi gây ra. Muỗi sinh trưởng và phát triển rất tốt ở những vùng có điều kiện thuận lợi cho nhiều loài côn trùng phát triển như những vùng nhiệt đới trong đó có Việt Nam . Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thì hàng năm, trên Việt Nam thế giới có tới hàng triệu trường hợp mắc các bệnh do muỗi truyền. Riêng ở Việt Nam , theo thống kê 6 tháng đầu năm 2001vẫn còn 126.000 ca sốt rét, 8.700 ca sốt xuất huyết, trong đó 20-25% ca tử vong và 60-70% để lại di chứng. Các bệnh hiểm nghèo do muỗi truyền đã có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước làm ảnh hưởng đến tình hình kinh tế xã hội. Bên cạnh đó, sự tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ thành dịch do hiện tượng kháng thuốc của côn trùng làm cho các nhà quản lý phải có những nỗ lực để thanh toán các bệnh trên. Sở dĩ có những nguy cơ đó là do một thời gian khá dài từ trước những năm đầu của thập kỉ 80, chúng ta đã sử dụng thường xuyên các hoá chất độc thuộc nhóm lân hữu cơ, các chất thuộc nhóm Pyrethroid để tẩm nhuộm màn. Điều này không những phá vỡ cân bằng sinh thái, gây hiện tượng bùng nổ côn trùng do kháng thuốc mà còn ảnh hưởng tới sức khoẻ con người. Loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis (Bti) được phát hiện vào năm 76 tại Israel có khả năng diệt muỗi đã mở ra một triển vọng mới cho việc kiểm soát các vectơ truyền bệnh hiểm nghèo cho người. Nhiều chế phẩm sinh học diệt muỗi từ Bacillus thuringiensis var.israelensis đã được sản xuất và ứng dụng thành công như Bactimos (Bỉ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mỹ)… Theo tổ chức Y tế thế giới thì việc sử dụng chế phẩm sinh học diệt muỗi từ các chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis là một biện pháp rất an toàn và hiệu quả. ở nước ta, việc nghiên cứu về Bacillus thuringiensis var.israelensis mới chỉ bắt đầu từ một vài năm gần đây nhưng cũng đã thu được những kết quả đáng kể. Nhiều chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis có hoạt lực cao đã được phân lập, một vài dòng gen đã được nghiên cứu tách dòng, đọc trình tự và biểu hiện. Chúng ta cũng đã bước đầu thử nghiệm thành công chế phẩm trong phạm vi phòng thí nghiệm. Tuy nhiên việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm diệt muỗi từ Bacillus thuringiensis var.israelensis cần phải được nghiên cứu thêm nữa. Phần I:Tổng quan về Bacillus thuringiensis 1.1. Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis Lịch sử về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện thấy một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillus bombyces. Năm 1901, Ishiwata phân lập ra một loại vi khuẩn từ ấu trùng tằmbị bệnh và đặt tên là Bacillus sotto, năm 1911, Berliner đã phân lập được một loại vi khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm ĐịaTrung Hải. Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensis . Năm 1928, Huszddax phân lập chủng B.thuringiensis (Bt ) từ Ephestia, thử nghiệm nó trên sâu đục thân ngô ở Châu Âu, đây được coi là ứng dụng đầu tiên của Bacillus thuringiensis .Chế phẩm thương mại đầu tiên , Sporeine, được sản xuất ở Pháp năm 1938. Năm 1951-1956 Steinhaus nghiên cứu khả năng diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis và đã sản xuất ở Mỹ. Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thương mại của Bt đã được sản xuất ở nhièu quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức.Sau đó Howard Dulmage và Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập được bộ sưu tầm đầu tiên về các chủng Bt. Năm 1970, Dulmage đã phân lập được chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn được sử dụng cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm Bt. Thập niên 80, nhiều công ty sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh đã đăng ký sản xuất và kinh doanh các chế phẩm BT. Đầu những năm 90 tại một số quốc gia như Cuba, Trung Quốc, Mỹ đẫ sản xuất chế phẩm BT ở quy mô công nghiệp. Ngày nay một số lượng lớn thương phẩm trừ sâu sinh học BT được sử dụng trong việc kiểm soát ấu trùng bộ cánh vẩy, hai cánh và cánh cứng… 1.2. Sự phân bố của B.thuringiensis Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ phát triển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc…Sự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích. Tuy nhiên ,Bt thường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trưòng có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng.Có thể phân lập Bt từ nhiều loại môi trường khác nhau. Bt dễ dàng phát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng. Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng không nảy mầm và nhân lên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên. Điều này chứng tỏ rằng Bt không thích nghi với môi trường đất. 1.3. Đặc điểm sinh thái của B.thuringiensis B.thuringiensis là thành viên của nhóm I, chi Bacillus. Đây là loại vi khuẩn sinh bào tử, Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc. Tế bào có kích thước 3x6m, có phủ tiêm mao không dày, có khả năng chuyển động , tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn…Bt có khả năng sinh nội bào tử giúp cho chúng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt đó. Bào tử của vi khuẩn có dạng hình trứng với kích thước 1,5x2 m và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng khi có điều kiện thuận lợi. Sự hình thành bào tử diễn ra đồng thời với sự tạo thành protein tinh thể có khả năng diệt côn trùng. Tinh thể có nhiều hình dạng khác nhau ( hình vuông, chữ nhật, hình tháp, hình ôvan hoặc vô định hình ). Khi tế bào phân giải tinh thể và bào tử được giải phóng ra ngoài. Tinh thể có kích thước khoảng 0,6x0,2 m, và có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Tinh thể này được gọi là thể vùi. Tinh thể và bào tử có thể quan sát dưới kính hiển vi đối pha ở vật kính đầu. Tinh thể bắt màu sẫm còn bào tử không bắt màu nhưng có mép sáng. Hình dạng của tinh thể được quyết định bởi gen mã hoá cho tổng hợp protein của tinh thể nằm trên plasmid. 1.4. Đặc điểm sinh hoá của B.thuringiensis Nói chung B.thuringiensis không lên men sinh axít đối với arabinoza, xiloza, và manitol,khử nitơrat thanh nitơrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, phát triển được trong môi trường thạch kị khí có chứa 1% lizozym. Sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 28-30 0C, pH 6,8-7,2. 1.5.Phân loại B.thuringiensis Bt được chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau: + Khả năng hình thành enzym leucitinase. + Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng. + Đặc tính huyết thanh học. + Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương ứng. Cho đến nay phương pháp phân loại Bt được sử dụng khá phổ biến là dựa trên các đặc tính huyết thanh học. Đặc tính huyết thanh học của chủng Bt được xác định chủ yếu dựa trên kháng nguyên tiên mao H và được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyết thanh tương ứng. Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn chưa phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Viẹc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn. Chính vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng. Bảng 1: Quan hệ giữa các lớp Cry, hình dạng tinh thể, thành phần protein và hoạt lực diệt côn trùng. Lớp gen Thành phần Protein (KDa) Hình dạng tinh thể Typ huyết thanh Hoạt lực diệt côn trùng Cry1A Cry1B Cry1C Cry1D Cry1E 131 138 135 133 133 Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi 1 3 6 7 8 Cánh vẩy Cánh vẩy Cánh vẩy Cánh vẩy Cánh vẩy Cry2A Cry2B 71 71 Tròn Tròn 3 3 Cánh vẩy, hai cánh Cánh vẩy Cry3A Cry3B Cry3C Cry3D 73 74 129 73 Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi 8 8 8 8 Cánh cứng Cánh cứng Cánh cứng Cánh cứng Cry4A Cry4B Cry4C Cry4D 135 128 78 67 Hình cầu Hình cầu Hình cầu Hình cầu 14 14 14 14 Hai cánh Hai cánh Hai cánh Hai cánh Cry5 81 Tháp đôi 3 Cánh vẩy, cánh cứng Cry6 ? ? ? Giun tròn CytA 28 14 1.6.Các loại độc tố do B.thuringiensis sinh ra Trong quá trình hình thành bào tử Bt có khả năng sinh ra 4 loại độc tố: +a-Exotoxin hay ngoại đọc tố A Năm 1954 lần đầu tiên Tomanaff phát hiện thấy vi khuẩn Bt var.elesti sản sinh ra enzym leucintinase. Tác động độc của enzym này liên quan đến sự phân huỷ mang tính chất cảm ứng của phospholopit trong mô của côn trùng, làm côn trùng chết.Enym này lần đầu tiên liên kết với tế bào ruột sau đó tách ra và được hoạt hoá bởi một chất không bền nhiệt. Chất này có trọng lượng phân tử thấp, có thể là lipit. a-Exotoxin có khả năng hoà tan vào nước và đặc biệt chỉ tác động vào loài ong xẻ có pH đường ruột phù hợp với hoạt đông của enzym này. a-Exotoxin cũng có hiệu lực với sâu thuộc bộ cánh cứng, cánh vẩy… +b-Exotoxin hay ngoại đọc tố B Đọc tố này bền nhiệt ở 1200C trong vòng 15 phút vẫn giữ được hoạt tính. Một số Bt không sinh ra tinh thể độc nhưng có thể sinh ra ngoại độc tố b. Hoạt tính của ngoại độc tố b bắt đầu xuất hiện trong giai đoạn phát triển mạnh trước khi hình thành bào tử. Ngoại độc tố là một nucleotid có trọng lượng phân tử thấp. Ngoại độc tố b còn có tác dụng cộng hưởng với nội độc tố d, sau khi có tác dụng gây dập vỡ, phá huỷ hoàn toàn biểu mô ruột giữa của ôn trùng mẫn cảm, ngoại độc tố nhanh chóng xâm nhập vào huyết tương và máu gây thay đổi sinh lý dẫn tới cái chết nhanh của côn trùng. +g-exotoxin hay độc tố tan trong nước g-exotoxin thuộc nhóm photpholipaza, nó tác động lên photpholipit và giải phóng ra axit béo g-exotoxin có chứa các peptid với trọng lượng phân tử thấp và một số axitamin tự do. Ngoại độc tố này tan trong nước, không ổn định, mẫn cảm với ánh sáng, oxy, không khí và nhiệt độ. +d-endotoxin (tinh thể độc) Đặc điểm quan trọng nhất của vi khuẩn Bt là có khả năng tạo thành trong té bào một loại tinh thể có bản chất là protein độc tính đối với nhiều loại côn trùng. Nội độc tố dlà một loại protein kết tinh từ 1180 gốc axitamin. Các axitamin chủ yếu gồm axit glutamic, axit asparaginic chiếm trên 29% tổng số axitamin trong phân tử protein, là nguyên nhân gây điểm đẳng điện thấp. Nguyên tố của tinh thể, ngoài C, H, O, N, S còn thấy một số nguyên tố khác như là Ca, Mg, Si, Fe… với một lượng nhỏ Ni, Zn, Al… và hầu như không có P. Sự tổng hợp tinh thể xẩy ra khoảng 3 giờ sau pha cân bằng. Mỗi tế bào sinh bào tử chỉ có thể có từ 1 đến 3 tinh thể độc. Tinh thể độc không tan trong dung môi hữu cơ. Có những tinh thể khi mới tách khỏi bào tử chỉ tan trong pH rất kiềm. Tinh thể đọc rất bền nhiệt,ủ 1 giờ ở 650C vẫn không bị mất hoạt tính, tính độc chỉ mất đi nếu ủ ở 1000C trong 30-40 phút. 1.7. Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của B.thuringiensis Ngày nay người ta đã phân tích 50 gen độc tố của Bt và nhận thấy một số hoàn toàn giống nhau, đại diện cho cùng một gen hay biến dạng từ một gen. Trong đó có khoảng 20 gen phân biệt chịu trách nhiệm tổnh hợp các protein tinh thể, nhất là các protein tinh thể độc. Bảng 2. Phân loại gen độc tố và phổ tác dụng của Bt Tên độc tố Trọng lượng phân tử, kDa Côn trùng đích Chủng Bacillusthuringiensis Hình dạng tinh thể Cry1A(a, b, c) Cry1B Cry1C Cry1D, E, F 130-133 138 135 130-134 Cánh vẩy Cánh vẩy Hai cánh Hai cánh B. berliner B. kurstaki KTO B. entomocidus B. aizawai Lưỡng tháp Cry2A Cry2B, C 71 71 Cánh vẩy Hai cánh B. aizawai B. kurstaki HD-1 Lập phương Cry3A, B, C, D 66-73 Cánh cứng B. tenebrionis Thoi dẹt Cry4A, B Cry4C, D 125-140 68 Hai cánh B. morrisoni PG14 B. israelensiss Cầu Chữ nhật Cry5A Cry5C 81 Hai cánh Cánh cứng B. kurstaki JHCC Lưỡng tháp Cry6 44 Giun tròn B. thómponi Lưỡng tháp Phần II. Tổng quan về Bacillus thuringiensis var.israelensis 2.1. Lịch sử phát triển của loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis Bacillus thuringiensis được chia làm nhiều loài phụ. Theo bộ sưu tập của trung tâm Bacillus diệt côn trùng Quốc tế, Viện Pasteur Paris năm 1996,đã có tới hơn 69 loài phụ khác nhau như: cánh vẩy, cánh cứng, hai cánh. ở một số loài phụ của Bacillus thuringiensis var.berliner, Bacillus thuringiensis var.thompsoni… Khác với loài Bacillus thuringiensis, loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis mới được phát hiện gần đây. Loài phụ này có tác dụng diệt ấu trùng muỗi. Các nhà khoa học Goldberg, Margarit là những người đầu tiên phân lập, nghiên cứu loài vi khuẩn này và De Bajac đặt tên cho là Bacillus thuringiensis var.israelensis. Họ đã phân lập và nuôi cấy,thử hoạt lực diệt ẩutùng muỗi với hàng trăm chủng khác nhau. Tuy nhiên chỉ có một số chủng có hoạt lực diệt các loài muỗi Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti… Chủng đầu tiên đó được kí hiệu là ORN-60A và thuộc typ huyết thanh H14. Khả năng sinh độc tố và tác dụng diệt muỗi của vi khuẩn này đã có nhiều công trình công bố. Ngày nay đã có rất nhiều chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis được tìm thấy và được phân loại làm phong phú thêm bộ sưu tập về Bacillus diệt côn trùng. Các chủng thường được sử dụng trong việc sản xuất chế phẩm sinh học diệt muỗi với các tên gọi khác nhau: Bactimos (Bỉ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mỹ)… chế phẩm dạng lỏng, dạng bột thấm nước, dạng viên, bánh nổi có tác dụng diệt ấu trùng của nhiều loài ruồi muỗi trong đó có loài Aedes Aegypti ( là vectơ truyền bệnh sốt xuất huyết). Chế phẩm Bacillus thuringiensis var.israelensis có tác dụng tốt trong môi trường nước sạch, nước không tù đọng hoặc nước có nồng độ muối loãng và được Tổ chức Y tế thế giới lựa chọn để diệt trừ các vectơ truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết ở các nước nhiệt đới. 2.2.Đặc điểm phân loại loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis Bacillus thuringiensis var.israelensis là loài phụ của loài Bacillus thuringiensis. De Bajac là người đầu tiên đã phân loại loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis thuộc typ huyết thanh H14. Tuy nhiên vào năm 1988, Ohba và Aiawa (Nhật Bản) đã phân lập được hai chủng Bacillus thuringiensis thuộc typ huyết thanh H14 nhưng lại không có hoạt lực diệt muỗi, ruồi đen. Trước đó (năm 1982) Pachun và cộng sự đã phân lập được chủng PG-14 thuộc typ huyết thanh H8A,B có hoạt lực cao đối với ấu trùng muỗi Aedes Aegypti, Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti… Do đó nếu chỉ dựa trên đặc diểm typ huyêt thanh thì không thể đảm bảo được phân loại một cách chính xác mà phải dựa trên những đặc điểm khác nhau như lớp Cry, thành phần và hình dạng protein tinh thể. Hofte và Whiteley là những người đầu tiên đưa ra ý tưởng phân loại loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis dựa trên sự kết hợp của tất cả các đặc điểm: gen Cry, thành phần và hình dạng protein tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng và typ huyết thanh. ý tưởng này đẵ được rất nhiều nhà khoa học hưởng ứng và được sử dụng chủ yếu cho đến nay để phân loại Bacillus thuringiensis var.israelensis. Bảng 3: Đặc điểm phân loại của loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis (theo Hofte và Whiteley, 1989). Lớp gen Cry Thành phần protein(KDa) Hình dạng tinh thể Typ huyết thanh Hoạt lực diệt côn trùng Cry4A Cry4B Cry4C Cry4D Cyt 135 138 78 67 28 Hình cầu Hình cầu Hình cầu Hình cầu Hình cầu H14 H14 H14 H14 H14 Muỗi, ruồi đen Muỗi, ruồi đen Muỗi, ruồi đen Muỗi, ruồi đen Muỗi, ruồi đen 2.3.Protein diệt muỗi của loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis Sự hình thành protein tinh thể Bacillus thuringiensis thường xẩy ra trong quá trình hình thành bào tử và nhiều nghiên cứu gần đây đã cho thấy nó có liên quan mật thiết tới sự có mặt của DNA plasmit. Gen mã hoá protein độc thường nằm trên các plámid cỡ lớn trên 3 kb gồm một phần là genmã hoá protein độc và phần còn lại mã hoá protein liên quan đến tính gắn. Khi nghiên cứu các cách chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis có hoạt lực đối với côn trùng thuộc bộ hai cánh, người ta thấy protein độc của chúng bao gồm các tiểu phần protein có trọng lượng phân tử: 130 KDa, 128 KDa, 78 KDa, 6 KDa , 28 KDa do các lớp gen Cry4A, Cry4B, Cry4C, Cry4D và Cyt mã hoá tổng hợp nên.Đây cũng chính là đặc điểm quan trọng nhất để phân biệt loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis với các loài khác. Nhóm Cry4 mã hoá tổng hợp các protein tinh thể có trọng lượng 130, 128, 78 và 67 KDa, có kích thước thông thường khoảng từ 0.7-1.2 m. Nhóm gen Cry4 mã hoá tổng hợp các protein tinh thể có trọng lượng 130, 128, 78và 67 kDa có kích thước thông thường đạt từ 0.7-1.2 m. Nhóm gen Cyt bao gồm hai lớp CytA và CytB thường tồn tại ở các chủng Bacillus thuringiensis mang nhóm gen Cry4 và tổng hợp các protein có trọng lượng phân tử khoảng 28 kDa. Các chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis thường tổng hợp các tinh thể protein hình cầu chỉ gây độc đối với bộ côn trùng hai cánh. Tinh thể độc của Bti gồm ba loại thể vùi protein khác nhau gắn với nhau bằng các lớp vỏ bọc. Mỗi thể vùi được bảo quản bởi một hay nhiều lớp nguyên liệu giống thành phần vỏ bọc mà đây cũng là một đặc điểm chỉ có vỏ Bacillus thuringiensis var.israelensis giúp cho tinh thể độc vẫn giữ được tính độc với côn trùng dưới tác dụng của proteaza cùng một số hoá chất khác mà cụ thể như sau : Protein 28kDa có trong thể vùi lớn nhất (chiếm khoảng 40-50% tinh thể). Nó thể hiện rõ trên gen polyarclamide (SDS-PAGE) bởi tính hòa tan của nó cao hơn hẳn các protein khác. Đối với protein này dưới tác dụng của enzyme proteaza, nó bị thuỷ phân thành protein có trọng lượng chỉ còn là 25kDa và hoạt tính diệt ấu trùng muỗi rất thấp. Protein 67kDa có trong thể vùi lớp thứ hai chiếm khoảng 15-20% tinh thể. Cũng giống như tiểu phần 28 kDa thì protein này cũng bị thuỷ phân thành các tiểu phần nhỏ hơn 31kDa, 35kda bởi enzyme proteaza và hoạt tính đối với ấu trùng muỗi cũng kém. Cuối cùng các protein 128kDa và 135kDA có trong thể vùi nhỏ nhất, bị phân huỷ thành các nhân độc 58-73 kDa dưới tác dụng của proteaza nhưng có hoạt lực diệt ấu trùng muỗi cao nhất. Hiện nay protein này đang được tập trung nghiên cứu nhiều nhất và người ta cho rằng hai protein này là thành phần quan trọng đối với hoạt lực diệt ấu trùng của tinh thể. Các thử nghiệm thực tế bằng cách tách riêng rẽ từng loại protein tinh thể của Bacillus thuringiensis var.israelensis cho thấy rằng các protein 28, 67, 128, 135 kDa đều có hoạt tính độc đối với ấu trùng muỗi. Tuy nhiên , Chichott và Ellar đã chứng minh rằng việc sử dụng cả 4 loại protein tinh thể sẽ cho hiệu quả cao hơn do có sự tác động qua lại giữa 2 hay nhiều protein. Bảng 3: So sánh hoạt lực diệt ấu trùng muỗi Aedes aegypti của protein riêng rẽ và hỗn hợp protein ( theo Chichott và Ellar ,1988 ) Chế phẩm LC50 (g/ml ) Hỗn hợp tinh thể 0,32 Tinh thể hoà tan 1,0 Protein 130 kDa 32,0 Protein 67 kDa 4,0 Protein 28 kDa 115,0 Phần III . Cơ chế gây độc của protein tinh thể do Bacillus thuringiensis var.israelensis tổng hợp Knowles đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis lên tế bào côn trùng thì có thể thấy rằng cơ chế hoạt động của tinh thể độc chủ yếu diễn ra trong ruột của côn trùng. Bởi khi nuốt phải tinh thể (hay gọi là tiền độc tố) dưới tác dụng của pH cao và enzyme proteaza của đường ruột mà tinh thể được hoà tan, thuỷ phân và hoạt hoá thành các nhân độc có hoạt tính. Sau đó các nhân tố độc này bám dính lên tế bào thượng bì ruột, làm phá huỷ cấu trúc tế bào ruột và tạo nên các lỗ rò rỉ. Vì vậy, trong ruột côn trùng có sự chênh lệch áp suất thẩm thấu giữa ruột côn trùng với môi trường ngoài tạo điều kiện cho các ion cũng như nước khuếch tán từ ngoài vào gây nên sự phình của tế bào ruột. Cuối cùng côn trùng ngừng ăn sau 1 giờ và sau 4 giờ xử lý thì côn trùng trở nên chậm chạp và chết hẳn sau 6 giờ. Phần IV .Hướng mở Gen Cry4 được cấu thành từ nhóm gen không đồng nhất gồm các gen Cry4A, B, C, D mã hóa cho sự tổng hợp các protein có trọng luơợng phân tử khác nhau 133,4 kDa ;127,8kDa; 77,8kDa và 72,4kDa. Hai gen Cry4A, Cry4B mã hoá tổng hợp protein có trọng lượng phân tử xấp xỉ 130kDa. Protein này dưới tác dụng của enzyme protease sẽ phân giải thành các nhân tố độc 53-67 kDa có hoạt lực diệt muỗi rất cao. Vị trí phân giải của protein này vẫn chưa được xác định. Gen Cry4C mã hóa tổng hợp protein 77,8 kDa và một số tương đồng với đầu 5’ của gen Cry4A, Cry4B. Khi gắn gen này vào vi khuẩn Bacillus sudtilí hoặc một trong thể Bacillus thuringiensis var.israelensis đột biến không độc thì gen này trực tiếp tổng protein độc tố 58 kDa, tương tự protein độc tố 58kDa của Bacillus thuringiensis var.israelensis. Gen Cry4D mã hóa tổng hợp protein 72,4 kDa là thành phần chủ yếu trong tinh thể của Bacillus thuringiensis var.israelensis . Dưới tác dụng của enzyme protease, protein này phân giải thành nhân độc30 kDa và vị trí phân giải cũng chưa được xác định. Gen Cry4A, B, C có sự tương đồng rất lớn, trong khi đó mức độ tương đồng với gen Cry4D rất thấp. Các gen Cry4A, B, C, D phân lập từ Bacillus thuringiensis var.israelensis đều đã được nghiên cứu biến nạp riêng rẽ vào E.coli. Các thể tái tổ hợp mang các gen Cry đều có khả năng tổng hợp protein độc tố nhưng chỉ có protein do gen Cry4B có tính độc cao đối với ấu trùng. Bacillus megaterium cũng được sử dụng như chủng chủ để biến nạp gen Cry4D, tổng hợp protein 70 kDa. Tuy nhiên tính độc của thể tái tổ hợp vẫn thấp hơn chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis ban đầu. Những thể tái tổ hợp Bacillus thuringiensis var.israelensis (chủng đột biến không có tinh thể, không độc) mang gen Cry4D tổng hợp protein 70 kDa của chủng Bacillus thuringiensis morrisoni Pg14 biểu hiện tính độc cao. Gen Cry4D cũng đã được tách và biểu hiện trong tế bào Bacillus subtilis và Bacillus sphaericus 2362. Điều đáng chú ý là khi thử nghiệm độc tố của thể tái tổ hợp với Aedes aegypty thì kết quả thu đưọc cho thấy độc tố của thể tái tổ hợp có tính độc gấp 100 lần so với chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis. Thực chất sự tăng tính độc một cách bất thường của thể tái tổ hợp này là do một mình protein 128 kDa hay là có sự tương tác giữa protein này với thành phần bào tử của hai chủng Bacillus subtilis và Bacillus sphaericus 2362 đến nay vẫn chưa được lý giải. Delécluse cùng cộng sự (1993) đã tiến hành tách dòng và biểu hiện gen Cry4A, B trên chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis tái tổ hợp 4Q2-81. Kết quả cho thấy chủng tái tổ hợp khi mang gen Cry4B thì sản sinh các thể vùi nhỏ hơn so với chủng gốc còn khi mang gen Cry4A thì hầu như không nhìn thấy thể vùi. Tuy nhiên dịch nuôi cấy bào tử trong cả hai trường hợp đều gây độc đối với ấu trùng muỗi. Không chỉ dừng ở việc biểu hiện gen Cry4 trên các chủng vi khuẩn, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã tiến hành biểu hiện gen mã hóa protein diệt muỗi trên tảo lam.Đây là một hướng nghiên cứu có rất nhiều triển vọng đối với việc sản xuất chế phẩm bởi vì nó sẽ khắc phục được những nhược điểm của chế phẩm thông thường như : lắng nhanh trong môi trường nước dẫn tới hiệu quả tiêu thụ của ấu trùng muõi khong cao, nhanh chóng mất hoạt lưc bởi tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời… Những nghiên cứu ban đầu đối với chủng tảo lam Anabaena PCC7120 cho thấy tao lam được chuyển gen mã hóa protein diệt muõi thu được từ các chủng Bti có thể giết tơi 91% số ấu trùng muỗi Aedes aeggypti đem đi thử nghiệm trong vòng 24 giờ. Khi tiến hành chuyển gen Cry4A, Cry11A vào tảo lam Anabaena PCC7120 (một nguồn thức ăn quan trọng của ấu trung muỗi )thì htấy hoạt lực diệt ấu trùng muỗi vẫn được bảo vệ khỏi ảnh hưởng có hại của tia UV-B trong ánh sáng mặt trời (những tia tử ngoại có bước sóng 280-330nm và không bị háp thụ bởi tầng ozone ). Ngoài việc nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen Cry4 của các chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis , các yếu tố ảnh hưởng đến việc biểu hiện của gen Cry4 cũng được nghiên cứu. Theo báo cáo gần đây nhất của Trung tâm Quốc tề về công nghệ Gen và công nghệ sinh học (ICGEB) thì sự biểu hiện của gen Cry4 được biểu hiện của gen Cry4A bị điều khiển bỏi những nhân tố dinh dưỡng như glucose và phosphat vô cơ thông qua con đường điều hoà tổng số của sự ức chế dị hóa. Trong vi khuẩn Gram (+) thì sự ức chế dị hóa bị gián tiếp bởi mọt phosphoprotein – Hpr hoạt động như là một phân tố điều hòa phiên mã trong suốt quá trình biểu hiện gen. Nghiên cứu về sự phosphoryl hóa và dophosphoryl hóa phụ thuộc glucose và mối tương quan với sự biểu hiện của gen Cry4A cũng đã được tiến hành. Thí nghiệm với chủng Bti đột biến không sản sinh Hpr thì thấy chủng này ít nhạy cảm với glucose và phosphat vô cơ hơn so với chủng gốc ban đầu. Hiệu quả được quan sát ở các mức độ protein và mRNA đã chứng minh rằng sự phosphoryl hóa Hpr giữ một vai trò quan trọng trong sự ức chế glucose trong suốt quá trình biểu hiện của gen Cry4A. Kết luận Do thời gian làm tiểu luận còn nhiều hạn hẹp, cùng với kiến thức còn nhiều hạn chế nên tiểu luận của em còn nhiều thiếu sót không tránh khỏi. Em m