Đề tài Phương pháp PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) Nhóm thực hiện: Nguyễn Thị Li Na Lâm Thiên Ngọc Nguyễn Thị Thanh Nga Nguyễn Hải Linh Phương pháp PCR I.PCR là gì và nguyên tắc của phương pháp PCR. II.Tiến trình phản ứng III.Các thành phần và điều kiện tối ưu hoá của phản ứng PCR. IV.Các loại PCR. V. Ứng dụng. I.PCR là gì và nguyên tắc của phương pháp PCR. 1.Phương pháp PCR -Phương pháp PCR do karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. -PCR là phản ứng được dùng để nhân bản một chuỗi DNA nào đó có trong một hỗn hợp với điều kiện trình tự hai đầu của chuỗi này được biết trước.(Trừ trường hợp nhân bản ngẫu nhiên.Vd.RAPD). -PCR là kĩ thuật rất phổ biến trong lĩnh vực sinh học phân tử và có những đóng góp tích cực trong ngành công nghệ sinh học hiện đại I.PCR là gì và nguyên tắc của phương pháp PCR. 2.Nguyên tắc. Phương pháp PCR dựa trên đặc tính của enzyme DNA polymerase.(Đặc tính của DNA polymerase là tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự hiện diện của mồi (primer). Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu mạch khuôn,giúp cho DNA pol nối dài và hình thành mạch mới II.Tiến trình phản ứng. 1.Các giai đoạn Mỗi chu kì khuyếch đại một đoạn DNA gồm ba bước kế tiếp: Bước 1:Biến tính( Denaturation) ở 94°C,trong khoảng 1 phút.Làm DNA mẫu xoắn kép tách thành 2 sợi đơn. Bước 2:Gắn mồi (Annealing) ở 55°-65°C,kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.Các đoạn mồi bắt cặp với DNA mẫu. Bước 3:Sinh tổng hợp (Synthesis) ở 72°C.Nhờ Taq polymerase sự sinh tổng hợp DNA bắt đầu từ đầu 3’OH của mỗi đoạn mồi. II.Tiến trình phản ứng 2.Số lượng chu kì của phản ứng PCR -Số chu kì của một phản ứng PCR thường là 25-35, tuỳ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu. -Số chu kì thường không vượt quá 40 vì lúc đó hiệu quả khuyếch đại giảm do cạn kiệt các thành phần phản ứng hoặc do sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng… PCR Baét caëp 37°C - 65°C Keùo daøi chuoãi72°C 25-35 Chu kyø Bieán tính 93°C - 95°C Bieán tính93°C - 95°C Fig. 7.23 Denature Anneal PCR Primers Extend PCR Primers w/Taq Repeat… III.Các thành phần và điều kiện tối ưu hoá của phản ứng PCR. 1.DNA mẫu -Phản ứng thường xảy ra tối ưu trên DNA tinh sạch, có độ dài nhỏ hơn 1,5 kb. -Số lượng DNA: chỉ cần 5-10ng,nếu DNA mẫu quá nhiều sẽ tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. III.Các thành phần và điều kiện tối ưu hoá của phản ứng PCR. 2.Mồi (primer) -Chiều dài của mồi thường là 15-25 base. -Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và phải đặc trưng cho trình tự DNA cần được khuyếch đại, không trùng các trình tự lặp trên gen -Tm của mồi xuôi và mồi ngược không được cách biệt quá xa. -Nồng độ mồi thường không vượt quá 0.5µg.Nồng độ của mồi xuôi và mồi ngược phải bằng nhau. III.Các thành phần và điều kiện tối ưu hoá của phản ứng PCR. 3.Enzyme. -phản ứng PCR sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt –Taq polymerase,được tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng là Thermus aquaticus. -Nồng độ enzyme được khuyến cáo là 1-2.5 đv/100µl dung dịch phản ứng.Nồng độ quá cao hoặc quá thấp đều khiến phản ứng không đạt hiệu quả tốt. VK chịu nhiệt : Thermus aquaticus Taq DNA polymerase Life at High Temperatures by Thomas D. Brock Biotechnology in Yellowstone © 1994 Yellowstone Association for Natural Science III.Các thành phần và điều kiện tối ưu hoá của phản ứng PCR. 4.Các dNTP. -Có 4 loại dNTP được dùng trong phản ứng PCR là ANTP,GNTP,TNTP,CNTP. -Nồng độ mỗi dNTP khoảng 20-200µM thì cho kết quả ổn định,trung thực và chutên tính. -Nồng độ của các dNTP phải bằng nhau để giảm các lỗi sao chép của Taq polymerase,tránh sự kết gắnnhầm lẫn mã di truyền. III.Các thành phần và điều kiện tối ưu hoá của phản ứng PCR. 5.Dung dịch đệm -Dung dịch đệm của phản ứng PCR thường là dung dịch stock của 10×PCR buffer -Thành phần quan trọng của dung dịch đệ là Mg++ giúp tạo phức với dNTP,cần thiết để gắn dNTP vào enzyme.Kích thích hoạt tính polymerase.Nồng độ trong phản ứng thường là 0.2-2.5mM. -Nồng độ Mg++ cao làm các DNA không biến tính hoàn toàn,sản phẩm ít di. -nồng độ Mg++ thấp làm xấu đi quá trình kéo dài chuỗi mã DNA mới. Hoãn hôïp moät phaûn öùng PCR 50ls trong moät oáng Eppendorf (0.5ml) Taát caû hoãn hôïp ñöôïc troän chung moät laàn. Taát caû hoãn hôïp ñöôïc troän chung moät laàn. III.Các thành phần và điều kiện tối ưu hoá của phản ứng PCR. 6.Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: -Phản ứng PCR được thực hiện bởi máy luân nhiệt tự động “Thermocycler” với chương trình cài sẵn khi gắn ống phản ứng vào. -Ống nghiệm dùng cho các phản ứng phải cùng một kiểu. -Mọi thí nghiệm của một nghiên cứu phải được tiến hành trên cùng một thiết bị. real-time real-time real-time real-time PCR hardware PCR IV.Các loại PCR. 1.RT PCR 2.Real Time PCR 3.PCR đảo (inverse PCR) 4.PCR neo (anchored PCR) 5.PCR Insitu 6.Nested PCR Reverse Transcription PCR (RT PCR) Inverse PCR NESTED PCR Primer 1.2 Primer 1.1 Primer 2.2 Primer 2.1 Khuyeách ñaïi giai ñoaïn 2 töø saûn phaåm giai ñoaïn 1 Saûn phaåm cuoái cuøng. Khuyeách ñaïi giai ñoaïn 1 V. Ứng dụng 1.Tạo mẫu dò đánh dấu. 2.Khuyếch đại và phát hiện gen mục tiêu. 3.Định lượng gen mục tiêu. 4.Dòng hoá. 5.Tạo đột biến. 6.Giải trình tự DNA. Tạo mẫu dò từ các cặp mồi ngẫu nhiên Cho gen mục tiêu bắt cặp với các cặp mồi ngẫu nhiên 1.Tạo mẫu do 2.Khuyếch đại gen mục tiêu Khuyếch đại bằng phản ứng PCR Phát hiện bằng điện di Khuyếch đại đồng thời trình tự đích và trình tự chứng có nồng độ đã biết. - Trình tự đích và trình tự chứng được khuyếch đại trong cùng một ống nghiệm (hai trình tự dùng chung cặp mồi, nhưng phần trung tâm có độ dài khác nhau). - Có thể phân biệt hai trình tự này dựa vào kích thước bằng Phương pháp điện di. - So sánh hàm lượng sản phẩm của trình tự đích với trình tự chứng, từ đó so sánh được số lượng bản mẫu ban đầu. 3. Định lượng gen mục tiêu 4. Dòng hoá Thêm vị trí cắt hạn chế vào sản phẩm PCR 5. Tạo đột biến 6. Giải trình tự DNA thực hiện phản ứng PCR với dNTPs và ddATP ở nồng độ thấp sản phẩm được tạo ra a. Dideoxynucleotde có đánh dấu huỳnh quang b. Đọc các đoạn nucleotide có đánh dấu huỳnh quang c. Đọc, giải mã trên máy tính và hiển thị kết quả ra màn hình Tài liệu tham khảo 1.Sinh học phân tử,tác giả Hồ Huỳnh Thuỳ Dương,nhà xuất bản Giáo Dục.