Đề tài Phương pháp chuyển gene tạo cây chống virus

phương pháp chuyển gen tạo cây chống virus A,Nội dung trình bày: I,định nghĩa virus. II,tác hại của virus lên thực vật. III,phương pháp chuyển gen kháng virus vào cây. IV,ưu và nhược điểm của phương pháp này. V,một số cây trồng được chuyển gen kháng virus. VI,tài liệu tham khảo. Virus thực vật thường gây hại cho mùa màng và làm giảm năng xuất một cách đáng kể.Do vậy việc sử lý hóa chất không hiệu quả,các nhà chọn giống thực vật nghiên cứu để chuyển gen kháng virus xuất hiện tự nhiên từ giống cây này sang giống cây khác.Cải biến gen đã được dùng để phát triển các dạng cây chuyển gen kháng virus không truyền thống. I,định nghĩa virus: Virut là một thực thể sống chưa có cấu tạo tế bào, kích thước của chúng rất nhỏ, trung bình 10 – 100 nm. Chúng chỉ gồm 2 phần chính: vỏ là prôtêin (capsit) và lõi là axit nuclêic. Do chưa có cấu tạo tế bào nên virut sống kí sinh bắt buộc trong tế bào chủ (vi sinh vật, động vật hoặc thực vật), virut ngoài tế bào chủ được gọi là hạt virut hay virion. II,tác hại của virus lên thực vật: Bộ gen của hầu hết virut kí sinh ở thực vật là ARN mạch đơn. Tế bào thực vật có thành xenlulôzơ nên rất bền vững, virut không thể tự chui qua thành tế bào mà phải chủ yếu nhờ vào vết tiêm chích của côn trùng hoặc các vết xước (do thiên tai hay cơ học)… Ví dụ sâu, rệp, bọ rẫy khi hút nhựa kèm theo cả virut. Cũng có trường hợp nhờ dây tơ hồng, hay virut truyền bệnh thông qua hạt giống, củ giống, cành chiết, mắt ghép, cỏ dại… Sau khi nhân lên trong tế bào, virut lan sang các tế bào khác qua cầu sinh chất. Hiện nay người ta đã biết 600 – 1000 bệnh ở thực vật do virut gây ra. Virut gây tắc mạch làm cho hình thái lá thay đổi: đốm chết, làm xoăn lá hay đốm lá rồi rụng gây nhiều thiệt hại cho cây trồng như bệnh khảm thuốc lá, bệnh xoăn lá khoai tây, khảm súp lơ, khảm dưa chuột… hoặc làm cho thân bị lùn, còi cọc như bệnh còi cà chua. Hiện nay, chưa có thuốc chống các loại virut kí sinh ở thực vật. Khi phát hiện ra dịch bệnh chỉ có cách là thu gom và đốt. Để phòng tránh virut ở thực vật thì người ta phải chọn giống cây sạch bệnh, luân canh cây trồng, thực hiện vệ sinh đồng ruộng, tiêu diệt các côn trùng truyền bệnh. Một số hình ảnh tác hạt của virus lên thực vật
III,phương pháp chuyển gen kháng virus vào cây: Có hai phương pháp: bảo vệ qua trung gian protein vỏ virus và bảo vệ bằng sự biểu hiện các gen khác. III,1,Bảo vệ qua trung gian protein vỏ virus Khi cây chuyển gen biểu hiện gen của protein vỏ(thường là loại proten có nhiều nhất ở hạt virus) của một virus thường nhiễm vào các cây này,khả năng virus nhiễm vào cây và lan tỏa một cách hệ thống sau đó thường bị giảm thiểu nhiều.Mặc dù cơ chế chính xác mà các protein vỏ kiềm hãm sự tăng sinh chưa được biết,nhưng rõ ràng là tác dụng chống virus xuất hiện sớm trong chu trình tái bản của virus và do đó ngăn chặn một lượng virus được tổng hợp.Đặc điểm này là một ưu điểm vì nó làm giảm khả năng chọc lọc cac virus đột biến ngẫy nhiên có thể vượt quá tính kháng này và tái bản khi có protein vỏ virus.Cách tiếp cận gen protein vỏ virus đã được dùng để tạo tính kháng với một số virus thực vật khác nhau(bảng).Với cách tiếp cận này các nghiên cứu đã phát triển nhiều cây chuyển gen kháng virus đối với một số cây trồng khác nhau.Mạc dù không đảm bảo được sự an toàn nhưng đã có tính kháng virus cao.Hơn nữa gen protein vỏ virus này đôi khi cho tính kháng phổ rộng với một số virus không liên quan.Việc sử dụng phương pháp này được hỗ trợ bởi việc quan sát các cây chuyển gen.Tổng hợp protein vỏ virus hoạt động tốt trên đồng ruộng cũng như trong phòng thí nghiệm. Ở cả sinh vật nhân chuẩn và nhân sơ phân tử DNA bổ sung với bản phiên mã cua gen bình thường(RNAtt) được gọi là RNA đối nghĩa.RNAtt có thể dịch mã được xem là RNA có nghĩa.Sự có mặt của gen RNA đối nghĩa có thể làm giảm sự tổng hợp sản phẩm gen bằng tạo thành phân tử kép với RNAtt có nghĩa bình thường do đó ngăn cản không được dịch mã.Phân tử kép RNA đối nghĩa-RNAtt cũng nhanh chóng bị phân hủy,một đáp ứng làm giảm hàm lượng của một RNAtt cụ thể trong tế bào.Về mặt lý thuyết có thể ngăn cản virus thực vật không được tái bản và tiếp theo là không phá hủy các mô cua tế bào thực vật bằng tạo cây chuyển gen tổng hợp RNA đối nghĩa bổ sung với RNAtt protein vỏ virus. Ở một trong số nhiều nghiên cứu hiệu quả của gen protein vỏ virus và cách tiếp cận RNA đối nghĩa đã được so sách bằng nhân dòng RNAbs của protein vỏ virus khảm dưa chuột(CuMV) vào cây thuốc lá theo hai hướng(có nghĩa và đối nghĩa mỗi hướng một cây) và sau đó kiểm tra cây chuyển gen về tính nhạy cảm với virus.
Hình:Quy trình đưa RNAbs bổ sung protein vỏ virus khảm dua chuột vào tế bào thực vật.RNA4 mã hóa protein vỏ,được tách từ chế phẩm RNA virus và dùng làm khuôn để tổng hợp RNAbs chuỗi xoắn kép.Các cầu nối được thêm vào DNAbs và DNA được nhân dòng vào vector plasmit E.coli.Clon RNAbs có độ dài trọn vẹn được nhận dạng,cắt từ vector E.coli và nhân dòng tiếp vào một vector nhân dòng plasmit Ti giữa promoto 35s từ virus khảm súp lơ(P35s) và đoạn kết thúc phiên mã của gen quy định tiểu đơn vị nhỏ của ribuloza bisphosphat carboxylaza(tRBC).Bước nhân dòng này tạo ra hai hướng cho DNAbs của RNA4.Một trường hợp RNA đã phiên mã được dịch mã thành protein vỏ(RNA có nghĩa) và trường hợp kia,RNA4 đã phiên mã bổ sung với RNAtt của protein vỏ(RNA đối nghĩa) Bộ gen của CuMV có ba mẫu RNA riêng rẽ,mỗi mẫu mã hóa một protein đặc hiệu virus.In vi tro một trong ba mẫu này,RNA3 được chế biến để loại bỏ một phần trình tự của nó,do đó tạo ra RNA4 mã hóa protein vỏ virus để tạo cây chuyển gen.Để tạo cây RNAtt bình thường và biểu hiện protein vỏ virus hoặc simh RNA đối nghĩa của nó,các bước tiến hành như sau: 1,phân lập RNA4 2,chuyển RNA4 bằng enzym in vi tro thành RNAbs xoắn kép. 3,bổ sung các cầu nối vào RNAbs 4,chèn các trình tự RNAbs hoàn chỉnh vào các vector nhân dòng theo cả hai hướng,mỗi trình tự đã định hướng dưới sự kiểm soát của trình tự promoto 35s từ virus khảm súp lơ và các trình tự điều hòa kết thúc phiên mã từ gen thực vật của tiểu đơn vị nhỏ của riboloza bisphosphat carboxylaza. 5,tạo các cây riêng rẽ mang trình tự bổ DNAbs của một trong hai hướng có thể. Hệ vector kép của plasmit Ti được dung để chuyển cả trình tự DNAbs có nghĩa sinh protein lẫn DNAbs sinh RNA đối nghĩa vào các tế bào thuốc lá riêng biệt,từ đó các cây chuyển gen được tái sinh(hinh2).
Các cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện protein vỏ CuMV được bảo vệ khỏi sự tích tụ các hạt virus và không biểu hiện của triệu chứng bị nhiễm virus,không liên quan đến việc nhiễm virus thử thách cao hay thấp trong khi hướng cấu trúc đối nghĩa chỉ bảo vệ cây chuyển gen dưới liều lượng virus thấp. Một số các nhà khoa học đã tạo cây chuyển gen tổng hợp các bản sao RNA đối nghĩa của các gen protein vỏ virus và kiểm tra khả năng tạo được thử thách virus của cây đó.Trong tất cả các trường hợp các cây được bảo vệ chống virus xâm chiếm chỉ khi nồng độ virus thấp.Ở nồng độ cao cây vẫn bị virus phá hoại,ngoài ra các bản sao RNA đối nghĩa của các protein vỏ virus nhìn chung tạo được sự bảo vệ ở mức thấp hơn nhiều cho cây chuyển gen so với dạng có nghĩa của các gen protein vỏ virus.Mặc dù cách tiếp cận RNA đối nghĩa vẫn chua phải cách hiệu quả để tạo cây kháng virus nhưng trong tương lai có thể sử dung dang RNA gây nhiễu là RNA chuỗi kép thường dài khoảng 21 nucleotid để bảo vệ cây chống sự xâm nhập cua virus.Trong trường hợp này RNA gây nhiễu có thể hoạt động với RNAtt đặc hiệu đích(như các RNAtt mã hóa proteun vỏ virus) để phân giải nucleaza. Thông thường cây trồng trên đồng ruộng bị tiếp xúc với nhiều loại virus khác nhau,bất kỳ loại nào trong số đó cũng có thể phá hoại cây và làm giảm năng xuất cuối cùng.Với suy nghĩ này các vector kép của plasmit Ti biểu hiện một hoặc nhiều gen protein vỏ của CuMV,virus khảm bí vàng và virus khảm dua hấu 2 đã được dùng để biến nạp cây bí ngô cổ cong(cucurbita.pepo)(hinh) Cây chuyển gen mang các gen protein vỏ virus bí vàng và virus dua hấu đã được kiểm tra dưới các điều kiện ngoài đồng ruộng bằng dùng rệp vừng một loại sâu bệnh nhỏ chuyển các virus này trong tự nhiên đến cây đang phát triển.Cây chuyển gen biểu hiện cả hai loại protein vỏ hoàn toàn kháng với sự nhiễm virus khi 2 virus này được truyền với cùng một thời điểm.Mặc khác trong cây chuyển gen chỉ biểu hiện một trong hai protein vỏ đã làm chậm sự gây chết so với cây đối chứng không chuyển gen,nhưng tất cả các cây này cuối cùng đều phát triển các triệu chứng nghiêm trong của bệnh virus khiến không thể bán cho người tiêu dùng.Rõ rang là việc sử dụng từ hai protein vỏ virus trở lên là một phương án hiệu quả có thể hữu dụng trong phát triển nhiều loại cây.Chuyển gen kháng với tất cả các virus chủ yếu thường kiềm hãm sự sinh trưởng và phát triển của cây đó.
o vàHình:bản thiết kế T-DNA với gen neomyxin phosphor transferaza(NPT II)làm gen đánh dấu chọn lọc,gen glucuronidaza(GUS)làm gen chỉ thị,hai bản sao của genprotein vỏ virus khảm dưa hấu 2(WMV2)và gen protein vỏ của virus khảm dưa chuột(CMV).Biên trái và phải của T_DNA được ký hiệu là LB và RB.B tương tự như sơ đồ A nhưng không có CMV và GUS chỉ có một bản sao của WMV2 và gen của protein vỏ virus khảm bí vàng(ZYMV).C như sơ đồ B nhưng có them CMV.Tất cả các gen trong các bản thiết kế này đều có promot vùng kết thúc phiên mã. Kiểu dung gen mã hóa trong cây để phá vỡ vòng đời virus và do đó tạo tính kháng virus đôi khi gọi là làm im lặng gen phụ thuộc tương đồng,việc them các bản sao mới của một gen vào một gen kiềm hãm sự biểu hiện của cả gen đưa vào lẫn các bản sao nội sinh đã có trước đó,hoặc trong trường hợp virus là các gen được tổng hợp sau khi nhiễm.Thực tế trong một số trường hợp cơ chế tự bảo vệ của cây có thể gồm khả năng im lặng gen phụ thuộc tương đồng. III,2,Bảo vệ bằng sự biểu hiện các gen khác Tính kháng đã cải biến đối với virus thực vật nói chung là nhờ sự biểu hiện protein vỏ virus hoặc các gen virus khác trên cây chuyển gen thường chỉ có hiệu quả với các virus giống nhau.Vì một số các virus khác nhau có thể nhiễm tiềm ẩn vào một cây trồng,nên sẽ là ưu điểm nếu cây có thể được cải biến để có thể kháng phổ rộng với virus.Để làm điều này một giống lúa mì đã được cải biến để biểu hiện gen ribonucleaza(RNaza)III(tức rnc)của E.coli,một enzyme chỉ cắt RNA xoắn kép vì đa số các virus thực vật có vật liệu di truyền là RNA chuỗi kép.Khi kiểm tra các cây chuyển gen biểu hiện gen rnc kháng với một số virus thực vật khác nhau.Thật không may cây biểu hiện gen này thường còi cọc và không phát triển bình thường.Đây có lẽ là kết quả của sự tương tác giữa RNA thực vật và enzym.Để khắc phục vấn đề này,thể đột biến của RNaza III đã được dùng.Enzym đội biến vẫn có thể lien kết với RNA xoắn kép nhưng nó không cắt cơ chất này nữa(hình).Gen đột biến (rnc70)được đưa vào lúa mì dưới sự kiểm soát của gen ubiquitin ngô(hình) bằng bắn vi đạn.Cây chuyển gen biểu hiện RNaza III đột biến phát triển bình thường và thể hiện sự kháng cao với virus khô vằn lúa mạch.Trong trường hợp này ,RNaza III đột biến đã bám vào virus khô vằn lúa mạch đang nhân đôi và ngăn cản sự tái bản virus.Ngoài RNA virus,cách tiếp cận này sẽ là cách hiệu quả để loại bỏ sự nhiễm các viroit thực vật.Các viroit là tác nhân gây bệnh có RNA mạch đơn xoắn vòng và tạo thành cấu trúc tương tự chuỗi xoắn kép bắt cặp baza cao bằng cách bắt cặp baza nội chuỗi.Các viroit thực vật khó kiểm xoát vì chúng không mã hóa protein nào,do đó axit nucleic của viroit phải là đích. Ngoài việc “tiêm chủng” cho cây khỏi bị virus phá hoại bằng biểu hiện protein vỏ virus ở tế bào thực vật,có thể dùng protein thực vật kháng virus để bảo vệ cây.Ví dụ cỏ thương lục(Phytolacca Americana) có ba protein kháng virus ở vách tế bào:Protein kháng virus cỏ thương lục(PAP)có ở các lá mùa xuân;PAP II có ở các lá mùa hè;và PAP-S có ở hạt.Mặc dù chúng chỉ giống nhau 40% ở mức protein và các kháng thể kháng PAP không phản ứng với PAP II nhưng chúng vẫn hoạt động theo cách tương tự.Cả PAP và PAP II đều là các protein bất hoạt ribosome loại bỏ gốc adenine đặc hiệu từ RNA ribosom lớn của tiểu đơn vị 60s của ribosom nhân chuẩn.Khi các cây cỏ thương lục bị nhiễm virus cả PAP và PAP II được tổng hợp tùy theo mùa và các ribosom trong các tế bào bị nhiễm bất hoạt.Dựa vào cách hoạt động,PAP và PAP II là các ứng viên tốt để phát triển cây chuyển gen kháng virus có kháng phổ rộng ở thực vật. Sau khi DNAbs mã hóa PAP được phân lập,dưới sự kiểm soát phiên mã của promoto 35S được đưa vào cây thuốc lá và khoai tây với vector plasmid Ti kép.Các thể biến nạp thể hiện nồng độ PAP cao(>10ng/mg protein)có bề ngoài còi cọc,vằn vện và bị bất thụ.Mặc khác cây có nồng độ PAP thấp hơn(1-5ng/mg protein) có ngoại hình bình thường và hữu thụ.Do vậy mức PAP cao đã can thiệp xấu vào chức năng tế bào bình thường.Ở cây chuyển gen biểu hiện PAP,ảnh hưởng chủ yếu của protein kháng virus là làm giảm số lượng các tổn thương.Khi cây khoai tây và cà chua chuyển gen biểu hiện nồng độ PAP thấp được thử thách với virus khoai tây X hoặc Y,chúng phát triển ít các thương tổn hơn một cách đáng kể trên lá so với cây đối chứng không không biến nạp. Cây chuyển gen mang DNAbs PAP II biểu hiện protein này ở mức cao hơn so với quan sát PAP (đến 250ng/mg protein).Cây có >150 ng PAP II/mg protein có tổn thương do bệnh úa vàng trong khi với 10-100 ng PAP II/mg protein lại bình thường.Cây chuyển gen biểu hiện mức PAP II thấp hơn và những biểu hiện khác bình thường khác với virus khảm thuốc lá,virus khoai tây X và nấm bệnh Rhizoctonia solani .Trong khi gen này có hiệu quả cao trong phòng thí nhiệm,vẫn còn xem nó hoạt động thế nào trong các thử nghiệm ngoài đồng ruộng. IV,ưu và nhược điểm của phương pháp này. Ưu điểm:Tạo được nhiều giống mới có tính kháng virus tốt,kháng phổ rộng,đạt năng xuất cao,…ghóp phần rất lớn vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp. Nhược điểm:Phương pháp này cần có nhiều thời gian để thử nghiệm cây trên đồng ruộng,sau khi làm trong phòng thí nhiệm.Phương pháp này rất cần độ chính xác cao. V,một số cây trồng được chuyển gen kháng virus.