Đề tài Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân khó tiêu

Phần 1 : Mở đầu Phân bón là yếu tố quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Từ đầu thế kỷ XX, việc sản xuất và sử dụng phân bón vô cơ đã góp phần quan trọng nâng cao sản lượng nông sản, giải quyết nạn đói cho nhân loại. Tuy vậy, nếu chỉ sử dụng phân vô cơ để nâng cao năng suất cây trồng sẽ dẫn đến sự ô nhiễm môi trường và suy giảm chất lượng nông sản vì các lý do sau: - Để sản xuất phân vô cơ , cần sử dụng một lượng lớn nhiên liệu: Than đá , dầu mỏ... quá trình thiêu đốt các loại nhiên liệu, đã tạo nên hàng triệu tấn khí thải độc hại, thổi vào khí quyển và hàng tỷ mét khối nước thải đổ vào các nguồn nước mặt. Nguồn khí, nước thải này đã góp phần làm ô nhiễm môi trường sinh thái của trái đất, tăng cường hiệu ứng nhà kính [18]. - Sử dụng phân vô cơ lâu ngày với liều lượng cao, sẽ hạn chế sự đa dạng của quần thể sinh học đất, mật độ tế bào vi sinh vật trong đất giảm, số lượng giun đất giảm nghiêm trọng thậm chí bị mất đi. Chính những yếu tố này, làm cho đất ngày càng trở nên chai cứng, độ phì nhiêu của đất giảm nghiêm trọng . Chính vì vậy, trong những năm gần đây xu hướng xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, nhằm nâng cao năng suất nông sản nhưng vẫn giữ được độ phì của đất lâu dài đang được phát triển. Sử dụng cân đối giữa phân vô cơ, phân hữu cơ ( phân xanh, phân chuồng, phân ủ....) và phân vi sinh vật là một nội dung quan trọng của nền sản xuất nông nghiệp bền vững[18]. Phân bón vi sinh vật là sản phẩm sinh học, có tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ và góp phần tạo cân bằng sinh thái. Phânbón vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng trọng việc bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp sạch bền vững. Do vậy, nghiên cứu sử dụng rộng rãi phân bón vi sinh vật trong nông - lâm nghiệp đã và đang được nhiều nước trên thế giới quan tâm và đầu tư phát triển . Kết quả nghiên cứu từ các nước Mỹ , Canada, Nga, ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản.... Cho thấy sử dụng chế phẩm vi sinh vật có thể cung cấp cho đất và cây trồng từ 30-60 kg N / ha /năm hoặc thay thế một lượng lớn lân vô cơ bằng quặng photphat. Ngoài ra, qua hoạt động sống của vi sinh vật cây trồng được nâng cao khả năng trao đổi chất , khả năng chống chịu bệnh tật và qua đó góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản. Các loại phân bón vi sinh vật đang được thế giới nghiên cứu và sử dụngcó thể kể đến là : Phân vi sinh vật cố định Nitơ cộng sinh, hội sinh và tự do; phân vi sinh vật phân giải hợp chất Photpho khó tan; chế phẩm vi khuẩn lam; chế phẩm nấm rễ... So với lịch sử phát triển của phân bón vi sinh vật trên thế giới, việc nghiên cứu thử nghiệm phân vi sinh vật ở Việt Nam còn rất mới mẻ. Việt Nam mới chỉ tập trung nghiên cứu về vi sinh vật cố định Nitơ và đang được sản xuất, ứng dụng tại một số đối tượng cây trồng nông nghiệp chính như: Lúa, đậu, lạc... song qui mô còn hết sức hạn chế và chưa đáp ứng được yêu cầu của người sử dụng . Trong khi đó, thực tế sản xuất nông - lâm Việt Nam lại đòi hỏi một số lượng lớn, không chỉ phân vi sinh vật cố định Nitơ mà cả phân vi sinh vật phân giải lân - Một loại phân vi sinh vật mới được đề cập đến trong khuôn khổ đề tài cấp nghành mà Viện KHKTNN Việt Nam đã tiến hành trong giai đoạn 1992-1995. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế 30-50% phân vô cơ bằng quặng photphat mà năng suất cây trồng không thay đổi [18]. Tiếp tục nghiên cứu để mở rộng việc sản xuất và ứng dụng phân bón vi sinh vật, đề tài KHCN 02-06 giai đoạn 1996-2000 do Ts: Phạm Văn Toản làm chủ nhiệm đề tài đã nghiên cứu và tạo thêm một số chế phẩm phân vi sinh vật phục vụ cho sản xuất nông - lâm nghiệp [18]. Nhằm góp phần tạo sản phẩm phân bón vi sinh vật phục vụ cho sản xuất nông - lâm nghiệp chúng tôi chọn đề tài: ” Phõn lập, tuyển chọn và nghiờn cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật cú khả năng phõn giải lõn khú tiờu “ Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi tập chung giải quyết những vấn đề chính sau: - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải Photphat khó tan. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng tuyển chọn Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật phân lập được , nhằm tạo điều kiện phát huy hoạt tính sinh học của chúng.  Phần 2: Nội dung Chương I: Tổng quan tài liệu I.1 Lý thuyết về phân giải photpho I.1.1 Vai trò của photpho đối với sự sinh trưởng phát triển của cây trồng Photpho là nguyên tố quan trọng thứ hai trong ba nguyên tố dinh dưỡng đa lượng chính của cây trồng( N,P,K) là nguyên tố cơ bản cần thiết cho sự sống của tất cả các loài sinh vật đặc biệt là thực vật. Photpho là thành phần xây dựng nên các hợp chất quan trọng bậc nhất của tế bào như: Photphoprotein, photpholipit, photphoeste, trong các vitamin( B1,B6).Đặc biệt photpho là thành phần không thể thiếu của ATP, ADP,GTP,FAD,NADP,coA,..đây là những phân tử trao đổi năng lượng, có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình quang hợp và hô hấp của thực vật [ 7 ]. Photpho có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây trồng. Dưới tác động của photpho cây trồng có hạt chín sớm hơn 5 -7 ngày, cây ăn quả có số quả chín sớm nhiều hơn đạt tới 78%( nếu không bón phân photpho chỉ chín 32%) [2] Bón photpho làm tăng tính chịu rét, tăng độ đường cho củ cải, tăng lượng tinh bột cho củ khoai tây, nói chung là photpho có tác dụng tăng chất lượng cùng năng suất cho cây trồng lên rất nhiều [12]. Ngoài ra, photpho còn giúp cho cây chịu hạn tốt hơn nhờ khả năng ngậm nước cao của nó. Đối với cây họ đậu photpho còn giúp cho quá trình cố định Nitơ tốt hơn [3]. Trong quá trình sinh trưởng của cây, photpho có tác dụng khống chế độ độc của lượng đạm khoáng cao trong cây vì nó giúp cho thực vật tăng cường việc chuyển hoá đạm khoáng thành đạm Protein. Hơn nữa sự có mặt của photpho làm cây hấp thụ được lượng đạm khoáng nhiều hơn [1]. Thực tế đã chứng minh rằng khi thiếu photpho sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc ít phân cành đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng. . Thiếu Photpho năng xuất cây trồng bị giảm sút nghiêm trọng , ngay cả khi cây được cung cấp đầy đủ Nitơ. I.12 Vòng tuần hoàn của Photpho trong tự nhiên Chu trình Photpho ở trong đất được thể hiện qua sơ đồ 1. Sơ đồ 1 cho thấy, vi sinh vật phân giải Photphat có vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình chuyển hoá Photpho ở trong đất. Photpho dễ tiêu được giữ lại trong đất dưới dạng các hợp chất khó tan và chỉ được trả lại cho đất dưới dạng dễ tan cho cây nhờ vào vi sinh vật chuyển hoá chúng[23] Động vật Phân huỷ sinh học Vi khuẩn sử dụng P Sản phẩm bài tiết Thực vật Các photphat tan VSV phân giải photphat Khoáng hoá Hấp thụ Chất mùn P- hữu cơ Photpho khoáng photpho khó tan Sơ đồ 1: Chu trình chuyển hoá Photpho trong đất [23] I.1.3 Các dạng của Photpho trong tự nhiên Các khoáng chất chứa Apatit, photphorit là những loại quặng chứa Photpho hoặc từ xác động thực vật. Photpho tồn tại ở trong đất có hai dạng chính: Photpho vô cơ và Photpho hữu cơ. Trên thực tế Photpho vô cơ chiếm ưu thế. Cây trồng rất khó sử dụng phohot hữu cơ. Quá trình chuyển hoá từ photpho hữu cơ thành Photpho vô cơ để cây trồng có thể sử dụng được là nhờ hệ vi sinh vật . Photpho vô cơ thì tồn tại ở hai dạng chính sau: + Loại Photphat không tan chiếm đa phần, hầu như không tan trong nước. Thực vật không trực tiếp sử dụng loại Photphat này đó là các Apatit, các muối gốc Photphat của kim loại mang tính axit như: FeS04, AlS04, Photphat của kim loại kiềm thổ mang tính kiềm hoặc trung tính: Ca3(P04)2; Al3(P04)2 . + Loại Photphat tan trong nước thường gặp là KH2PO4; Na2HPO4; K2HPO4; Ca(HPO4)2; Mg(HPO4)2. Thực vật dễ dàng sử dụng tốt các loại Photpho này, nhưng đáng tiếc là hàm lượng của chúng lại rất thấp ( chỉ chiếm 0,1- 1% so với lượng Photpho tổng số ) cho nên cây trồng thường bị thiếu Photpho nghiêm trọng . Photpho hữu cơ tồn tại ở các chất có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Từ xác của động thực vật qua sự phân giải của vi sinh vật trong đất tạo thành dạng chất mùn. Do vậy, việc sử dụng lâu dài phân chuồng có thể làm tăng hàm lượng Photpho hữu cơ trong đất. I.1.4 Các dạng chế biến phân Photpho . Chia làm hai loại: Phân Photpho chế biến bằng axit và phân Photpho chế biến bằng nhiệt. I.1.4.1 Phân photpho chế biến bằng axit Phân photpho chế biến bằng axit còn được gọi là Superphotphat, nó có công thức là CaHPO4.CaSO4. Về nguyên tắc sản xuất, người ta cho quặng Apatit chứa P2O5 đã nghiền nhỏ tác dụng với H2SO4 theo tỷ lệ 1: 1. Phương trình phản ứng xảy ra như sau: Ca3(PO4)2.CaF2 + 3 H2SO4 = Ca(HPO4)2 + CaSO2 + HF Trong thành phần của Superphotphat, ngoài monohidrophotphatcanxi còn có 40% CaCo3, một phần axit H3PO4 tự do với hàm lượng 5- 6 %.Superphotphat là một loại phân mang tính axit nên chỉ sử dụng cho đất bão hoà kiềm hoặc trung tính. Nếu sử dụng cho đất chua có nhiều Fe, Al sẽ làm mất hiệu lực của phân Photpho [14] [4]. I.1.4.2 Phân Photpho chế biến bằng nhiệt. Phân Photpho chế biến bằng nhiệt còn được gọi là phân lân nung chảy, được sản xuất từ sự gia nhiệt làm nóng chảy Apatit với Mg, Silicat ở nồng độ loãng sau đó được làm lạnh đột ngột. Đây là phương pháp để chuyển các hợp chất muối Ca, P sang dạng dễ tan. Phân Photpho nung chảy có thành phần dinh dưỡng như sau: P2O5: 18-24%; MgO: 13-18%; SiO2:17-25%; CaO: 25-35%. Ngoài ra còn có một số nguyên tố khác như Na, K... Với thành phần và cấu trúc đặc biệt nên phân lân nung chảy không hoà tan vào trong nước mà chỉ hoà tan trong axit yếu. Trong axit Xitric 2% phân Photpho nung chảy gần như tan hoàn toàn, nó có thể đạt tới 99%. Phân Photpho nung chảy có hiệu lực tốt nhất trong đất axit [14][4] nhưng trong tất cả các loại đất phân Photpho đều bị các ion của đất giữ lại nhiều hay ít phụ thuộc vào từng loại đất, đặc điểm cây trồng, độ khoáng hoá, độ mùn của từng loại đất. I.1.5 Vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan. Vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan là các vi sinh vật có khả năng chuyển hoá hợp chất Photphat khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng.Vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan được biết đến nay là: Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Selerotium, Aspergillus, nấm rễ (Mycorrhira). Các vi sinh vật này không chỉ phân giải hợp chất Photphat Canxi mà cả Photphat nhôm, sắt, mangan và các dạng khác kể cả quặng. Kết quả nghiên cứu hiệu quả phân giải lân được thể hiện qua bảng 1. Bảng 1: Khả năng phân giải hợp chất Photphat khó tan Tên chủng vi sinh vật Nguồn Photphat % phân giải Nguồn tài liệu Vi khuẩn Photphat Canxi 3 3-17 Moreau - 1995 Pseudomonas Photphat Canxi 3 13-58 Ostwaba.Bhide -1992 Aspergillus Photphat Canxi 3 Photphat Canxi 2 Photphat nhôm Photphat sắt 30,8 58,4 24,0 25,6 Gaura. Gaind-1983 Penicillium Photphat Canxi 3 Photphat sắt Photphat nhôm 90,0 49,3 28,1 Gaura. Gaind-1983 Bacillus Quặng Photphat 5-10 Gaura. Barrdiga-1972 Bacillus Quặng Photphat 12-20 Gaur et .al-1973 Penicillium Quặng Photphat 10-17 Asea et. Al-1988 I.1.6 Cơ chế phân giải hợp chất Photphat khó tan nhờ vi sinh vật. Cơ chế của quá trình phân giải hợp chất Photphat khó tan đến nay vẫn còn chưa được hiểu đầy đủ và còn rất nhiều tranh cãi trong vấn đề này. Sản sinh ra axit hữu cơ có thể là nguyên nhân chính song CO2, H2S, axit, kiềm cũng là các yếu tố được nhiều nhà nghiên cứu đề cập đến. I.1.6.1 Phân giải Photphat khó tan do sự tạo thành axit của vi sinh vật [10]. Theo nghiên cứu của Bardia và Gaur(1972-1974), cho thấy trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật khi mà pH môi trường bị giảm sút mạnh, lúc đó hàm lượng Photpho tan trong môi trường tăng lên. Sau khi nuôi cấy vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan người ta tìm thấy nhiều axit hữu cơ như: Axit axetic, axit focmic, axit glucolic, axit oxalic,axit sucinic, axit malic, axit xitric...trong môi trường. Các axit hữu cơ này tác dụng với hợp chất Photphat không tan nhờ sự liên kết với Cation: Mg+2, Ca+2, Al+3 , Fe+3...qua đó tạo nên hợp chất Photpho mới tan trong nước. Kapoor (1998), cho rằng phần lớn các chủng nấm sợi có khả năng phân giải mạnh các hợp chất Photphat khó tan là nhờ axit hoá môi trường, do tạo ra các axit hữu cơ. Goldstein A.H (1996) đã chứng minh rằng kết quả của sự oxi hoá glucoza sản sinh ra axit gluconic và 2-ketogluconic có ở vùng xung quanh tế bào vi khuẩn dẫn đến làm tan Ca3(PO4)2 của môi trường. I.1.6.2 Sự phân giải Photphat khó tan nhờ phản ứng Cacbondioxit (CO2 và H2S ). Nhiều nghiên cứu trước đây cho rằng CO2 sản sinh bởi rễ cây và vi sinh vật có tác dụng phân giải các hợp chất Photphat khó tan. Sau đó Goerge (1938) tìm ra rằng: CO2 làm tăng cường khả năng tan của Photphat và sử dụng Photpho của cây trồng. Trong quá trình phát triển, cây trồng và vi sinh vật đã tạo ra một lượng lớn cacbondioxit. Hợp chất này cùng với nước đồng thời tác dụng lên các hợp chất Photphat khó tan biến chúng thành dạng dễ tan như phương trình sau [24]: Ca3(PO4)2 +CO2 +H2O = 2 CaHPO4 + CaCO3 Ca3(PO4)2 + 2 CO2 + 2H2O = Ca(H2PO4)2 + 2CaCO3 Năm 1958 Sawby và Sperber đã chứng minh rằng vi sinh vật phân huỷ aminoaxit chứa Lưu huỳnh hoặc vi khuẩn Lưu huỳnh oxi hoá khử Sulfur hoặc tạo ra H2S , H2S có khả năng phân giải hợp chất Photphat khó tan như phương trình sau [24]: H2S + FeSO4 = FeS + H2SO4. I.2 Những thành tựu nghiên cứu vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan trên thế giới và ứng dụng. Trên thế giới vấn đề khu hệ vi sinh vật sống dị dưỡng trong đất, vùng rễ đã được nghiên cứu khá nhiều. Hàng loạt vi sinh vật phân giải lân khó tiêu đã được thu thập và tuyển chọn. Đặc biệt có các chủng vi sinh vật có thể pphaan giải tới 70% quặng Photphat thành lân dễ tiêu. Khi sử dụng loại phân vi sinh này có thể tiết kiệm được 50% lượng lân cần bón mà vẫn không thay đổi năng suất chất lượng nông sản. Điều này đã mở ra một triển vọng cực kỳ to lớn cho nhu cầu lương thực toàn cầu. Nó đã khắc phục được tình trạng bế tắc, thiếu hiệu quả của các loại phân bón hoá học trước đây.Theo tài liệu công bố tổ chức lương thực thế giới (FAO) thì để tăng sản lượng nông sản lên 2- 3 lần thì con người phải tạo ra một lượng phân đạm tăng khoảng 30 lần, Kali 10 lần. Điều đó cho thấy là hết sức tốn kém về công sức và của cải. Việc sử dụng các chế phẩm phân vi sinh trong đó có vi sinh vật phân giải lân đã được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới như Hoa Kỳ, Canada, Nga, Trung Quốc... chế phẩm “Điền lực bảo “ do Trung Quốc sản xuất là loại phân có nhiều giá trị sinh học và thực tiễn. Trong mỗi gam phân bón đã phát hiện thấy có chứa tới trên 5.109 tế bào vi sinh vật có khả năng chuyển hoá lân khó tan thành dạng dễ tan. Năm 1970 ở Liên Xô đã dùng Bacillus Megatheriumval Photphatium để sản xuất chế phẩm Photphobacterin. Chế phẩm này được sử dụng rộng rãi ở Liên Xô và các nước Đông Âu dùng bón cho lúa mỳ, ngô, lúa nước. Kết quả cho thấy sản lượng tăng 5-10% so với đối chứng. Grimer và Mount (1981) đã nghiên cứu tác động của Pseudomonas Putida phân lập từ đất xung quanh cây họ đậu Phaseollus Vulgaris. Các ông tthấy rằng khi bổ xung P.putida vào đất trồng làm cho cây họ đậu này tạo ra nhiều nốt sần hơn, do đó tăng khả năng hấp thu Photphat của cây [22]. Năm 1982, Datta và cộng sự đã ứng dụng thành công vi khuẩn Bacillus firmus có khả năng phân giải Photphat khó tan làm tăng năng suất lúa ở vùng đông bắc ấn Độ. Chủng này vừa có khả năng sinh IAA (Indolactic axit) - là hooc môn sinh trưởng rất cần thiết cho cây trồng vừa có khả năng chuyển hoá Photphat khó tan [23]. I.3 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật phân giải lân và ứng dụng trong phân bón vi sinh ở Việt Nam. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật cố định Nitơ cũng như phân giải Photphat khó tan đã được tiến hành từ những năm 60. Năm 1968 Lê Văn Căn và Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu một số nấm mốc có khả năng phân giải Photpho khó tan, trong đó có Aspergillus niger sau 4 tuần nuôi cấy đã chuyển hoá được 17,2% Photpho tổng số trong Photphorit. Hiện nay, chế phẩm phân hữu cơ vi sinh được công ty Thiên Nông sản xuất lần đầu tiên ở nước ta từ tháng 10-1990. Đó là một dạng chế phẩm bao gồm nhiều loại vi khuẩn được công bố là có khả năng chuyển hoá Photpho vô cơ và nhiều tác dụng khác. Mục tiêu chung của các nhà khoa học Việt Nam là phấn đấu có được nhiều loại phân bón sinh học tốt, để có thể giảm dần việc sử dụng phân hoá học trên đồng ruộng đó cũng là mong muốn của những người làm nông nghiệp . Kết quả nghiên cứu về phân lân vi sinh trong khuôn khổ đề tài cấp nghành mà Viện Khoa Học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam giai đoạn 1992 - 1995 cho thấy sử dụng vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế được 30-35% lượng lân vô cơ cần bón bằng quặng Photphorit mà năng suất cây trồng không thay đổi [17]. Nguyễn Hoài Hà và cộng sự (1960 )[8], đã phân lập từ đất trồng ngô ngoại thành Hà Nội được 100 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải Photphat khó tan, trong đó có 52% phân giải yếu (D-d 10 mm ). Ba chủng mạnh có khả năng chuyển hoá được > 41% quặng Photphorit . Nghiên cứu của Nguyễn Phương Chi và cộng sự (1998), Viện CNSH đã lựa chọn chủng Aspergillus awamori Nakazawa MN1 [11]. Chủng này đã chuyển hoá được 84,7% P2O5 sang dạng dễ tiêu từ quặng Photphorit chứa 20% P2O5. Mặt khác, chủng này cũng chuyển hoá được quặng Apatit chứa 25% P2O5 sang dạng dễ tan, tuy nhiên ở mức độ nhỏ hơn (61,5%). Do đó chủng A.awmori Nakazawa MN1 được sử dụng làm phân lân vi sinh, giúp cây trồng sử dụng Photphat hữu cơ hữu hiệu hơn. Trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nước, KHCN 02-04 giai đoạn 1996-1998 do GS-TS Lê Văn Nhương TTCNSH-Đại học Bách Khoa làm chủ nhiệm, các cán bộ khoa học, đã phân lập và nghiên cứu chủng nấm sợi Aspergills japonicus VTCCN11vừa có khả năng phân giải Photphat khó tan vừa có khả năng phân giải Xenluloza. Chủng nấm sợi này, có thể chuyển hoá 18,4% P2O5tan từ quặng Photphorit, 6,6% từ quặng Apatit và 18,84% từ Ca3(PO4)2. Chủng nấm sợi trên đã được sử dụng để tạo chế phẩm phân vi sinh vật [12]. Đề tài Khoa học cấp nhà nước KHCN 02 - 06 giai đoạn 1996- 2000 do TS Phạm Văn Toản Viện Khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp chủ nhiệm, đã nghiên cứu hàng loạt chủng giống vi sinh vật có khả năng cố định Nitơ, phân giải Photphat phục vụ cho Nông Nghiệp. Đề tài đã xây dựng quy trình chế phẩm vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan từ nấm mốc Aspergillus và vi khuẩn pseudomonas. Sản phẩm được chứng minh có tác dụng tốt đối với sự sinh trưởng, phát triển của ngô và lúa ....[17]. I.3.1 Tình hình sản xuất và sử dụng phân vi sinh vật phân giải Photphat khó tan ở Việt Nam . I.3.1.1 Các loại phân lân vi sinh . Hiện nay trên thị trường phân lân vi sinh thường được chia làm hai nhóm sau: + Phân lân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng Quy trình sản xuất phân vi sinh trên nền chất mang thanh trùng được thể hiện thông qua sơ đồ 2. Các loại phân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng có mật độ vi sinh vật hữu hiệu lớn từ 108- 10 9tế bào / gam, vi sinh vật tạp ít. Sử dụng phân bón vi sinh vật này để nhiễm vi sinh vật vào hạt, tưới vào gốc cây non. Hiệu quả của phân dựa trên năng suất và phẩm chất của nông sản [14]. Sơ đồ 2: Quy trình sản xuất phân lân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng [14] Vi sinh vật phân giải lân Nhân sinh khối Xử lý tiềm sinh Đóng gói bảo quản, sử dụng Phối trộn Thanh trùng Than bùn, chất mang +Phân lân vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng Phân lân vi sinh được sản xuất trên nền chất mang không thanh trùng có mật độ vi sinh vật hữu ích thấp chỉ khoảng 106-108 tế bào /gam và vi sinh vật tạp khá cao. Hiệu quả của phân bón dạng này thường dựa trên các chất dinh dưỡng có trong chất mang. Chất mang ở đây thường là các chất hữu cơ: than bùn, phế thải nông nghiệp, rác thải thành phố... và các chất vô cơ khó tiêu: Apatit, Photphorit, bột đá vôi... Các loại chất mang hữu cơ thường được ủ háo khí hay yếm khí tuỳ loại nguyên liệu hữu cơ.Nhược điểm của loại phân này là chất lượng không ổn định và khó bảo quản. I.3.1.2 Hiệu quả sử dụng các loại phân lân vi sinh vật. Hiệu quả của các loại phân lân vi sinh thường được đánh giá thông qua các chỉ tiêu sau: - Tăng cường cung cấp thêm lân dễ tiêu cho cây trồng - Tăng cường sức hoạt động của các loại vi sinh vật khác trong đất - Cung cấp các chất điều hoà sinh trưởng - Cung cấp các chất kháng sinh phòng chống sâu bệnh hại cây trồng Cho đến nay, tuy rằng phân vi sinh vật phân giải lân khó tiêu được sản xuất, bán trên thị trường nhưng số lượng không nhiều vì lý do sau: Hiệu quả của chúng chưa được ổn định, giá thành đắt, khó khăn về bảo quản và vận chuyển [14]. I.3.2 Yêu cầu về chất lượng, thời gian bảo quản phân lân vi sinh . Theo TCVN của Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn -Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam quy định tiêu chuẩn phân bón vi sinh vật phân giải Photphat như sau: - Thời gian bảo hành của phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan ít nhất là 6 tháng. - Mật độ vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất Photphat khó tan phải phù hợp với bảng 2. Bảng 2: Mật độ vi sinh vật sống có trong phân bón vi sinh vật Tên chỉ tiêu Mật độ vi sinh vật CFU/g hoặc ml mẫu Chất mang đã được thanh trùng Chất mang không thanh trùng Khi xuất xưởng Cuối hạn bảo hành Khi xuất xưởng Cuối hạn bảo hành 1. Vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan không nhỏ hơn 1,0 x 109 1,0 x 108 1,0 x 107 1,0 x 106 2. Vi sinh vật tạp, không nhỏ hơn 1,0 x 106 1,0 x 108 - - Trong đó: CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc. Cho đến nay, có nhiều nhà sản xuất phân lân hữu cơ vi sinh như: Phân hữu cơ Thiên Nông, phân lân sinh hoá hữu cơ Komix của công ty hoá sinh nông nghiệp và thương mại Thiên Sinh, phân sinh hoá hữu cơ Biomix của công ty phân bón hoá chất Kiên Giang, Biofer của Hội Phân Bón Việt Nam ...đều sản xuất phân lân vi sinh nhưng số lượng không nhiều, hiệu quả chưa thật ổn định, giá thành đắt, khó khăn về bảo quản và vận chuyển hơn nữa không phải bón cho vùng đất nào cũng phù hợp và cho hiệu quả cao [14]. Mặt khác thành phần, số lượng , hoạt tính của các vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan trong các mẫu đất ở các vùng địa lý khác nhau cũng rất khác nhau [17]. Bởi vậy, việc tìm kiếm và bổ xung các vi sinh vật phân giải lân khó tan từ các vùng đất có khí hậu và điều kiện địa lý đặc thù, để đưa vào ứng dụng trong thực tế mà có hiệu quả là điều rất cần thiết, đòi hỏi các nhà nghiên cứu quan tâm và đầu tư. Chương II : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. II.1 Vật liệu và thiết bị: II.1.1 Vật liệu. II.1.1.1 Chủng vi sinh vật: Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu đất trồng ngô, lúa, đậu tương và đất vườn trên địa bàn Hà Nội. II.1.1.2 Giống cây trồng thí nghiệm đối với chủng vi sinh vật phân giải lân khó tiêu. Sử dụng giống đậu tương DT84 do bộ môn giống cây trồng Trường Đại học Nông Nghiệp cung cấp. II.1.2 Thiết bị thí nghiệm. Thiết bị được sử dụng của phòng các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật -Viện CNSH. Nồi khử trùng ướt (Trung Quốc) Nồi khử trùng khô (Trung Quốc) Máy đo pH Mettler Toledo -320 (Nhật) Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật) Máy lắc do Viện Khoa học Việt Nam chế tạo 220 vòng /phút Tủ ấm (Trung Quốc) Cân phân tích ADNHR- 200 (Nhật) Máy đo độ đục Novaspec II (Pharmacia- Thuỵ Điển) Và các dụng cụ khác phục vụ cho thí nghiệm: Micro pipet,ống nghiệm, bình tam giác, hộp Petri ... do Trung Quốc và Đức sản xuất. II.1.3 Hoá chất. Các hoá chất sử dụng đều tinh sạch ở mức độ phân tích, đạt tiêu chuẩn chất lượng trong nghiên cứu (P.A). Bao gồm : Ca3(PO4)2 ; các loại đường glucose, sacarose; cao nấm men, thạch , Pepton và các nguyên tố vi lượng: FeS04, MnS04.... do phòng “ các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật cung cấp”. II.2 Môi trường nuôi vi sinh vật phân giải Photphat. II.2.1 Môi trường Pikovskaya [27,6] (dùng phân lập giữ giống và nghiên cứu khả năng phân giải photphat của các chủng vi sinh vật). Thành phần: g/l. Glucoza................................ 10 Ca3(PO4)2.............................. 5 MgSO4................................. 0,1 KCl....................................... 0,2 FeSO4H2O ........................... vệt NaCl .................................... 0,2 MnSO4 ................................. vệt Yeast extract (cao nấm men) ..............0,5 Agar (thạch) ........................20 Nước máy.............................1000 ml. Khử trùng ở 0,8 atm / 30 phút. II. 2.2 Môi trường Pikovskay lỏng: dùng để nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật phân giải lân khó tiêu. Thành phần: g/l. Glucoza................................10 Ca3(PO4)2..............................5 MgSO4..................................0,1 KCl.......................................0,2 FeSO4H2O............................vệt NaCl ....................................0,2 MnSO4.................................vệt Yeast extract (cao nấm men)..............0,5 Nước máy............................1000 ml Khử trùng ở 0,8 atm / 30 phút. II.2.3 Môi trường nước chiết đất. Cân 1.5kg đất (đất Cổ Nhuế )