Đề tài: Nuôi cấy mô và tế bào thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI Đề tài: NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Giảng viên hướng dẫn: GS. TSKH. Vũ Quang Mạnh. GVCC Học viên : Bùi Thị Ngại Lớp : CH – K24 khoa Sinh Chuyên ngành : Di truyền học HÀ NỘI, 2015 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Từ rất lâu, con người đã biết nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp. Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để trồng ,gọi là giâm cành ,chiết cànhHay chắp nối những thân cây này với thân cây kia bằng cách ghép cành. Những ưu điểm vượt trội của nó được ứng dụng rộng rãi. Cùng một lúc chúng ta có thể nhân giống cây lên hàng loạt mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt, chờ cho cây con lớn. Bên cạnh đó người ta lại có một công nghệ hiện đại hơn, gọi là công nghệ nuôi cấy mô tế bào. Cùng với sự phát triển của khoa hoc kỹ thuật, nền công nghệ này đã và đang ứng dụng rộng rãi trong cây trồngCùng một lúc nó cũng tạo ra hàng vạn cây trồng mới, nhanh chóng mà không nhất thiết phải là từ các hạt của cây mà có thể lấy bất kỳ mô bào nào, trừ những mô tế bào đã hoá gỗ. Tuy nhiên nền công nghệ này đòi hỏi khá tốn kém, sự kiên nhẫn và khéo léo. Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật qúy hiếm. NỘI DUNG 1. NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT 1.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, ở điều kiện vô trùng. Bao gồm: Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành. Nuôi cấy cơ quan. Nuôi cấy phôi. Nuôi cấy mô sẹo. Nuôi cấy tế bào trần. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902. Theo quan niệm sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó: - Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. - Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào ngược lại với sự phân hóa tế bào. Phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào phân chia Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào Hình 1: Sơ đồ cơ sở khoa học của nuôi cấy mô. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trưởng của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Như vậy, kỹ thật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng). Đây là một điểm rất quan trọng vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng. 1.2. Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và khử trùng mẫu Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch virút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu. Bước 2: Tạo thể nhân giống in vitro Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy in vitro. Các giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Bước 3: Nhân giống in vitro Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Chúng ta cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25 - 27oC thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên, đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy khác nhau. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng. Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm công việc huần luyện cây in vitrô thích nghi với điều kiện khí hậu thay đổi: nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn. Thời gian tối thiểu để thích nghi là 2 – 3 tuần. Trong thời gian này cây cần phải được bảo vệ trước những điều kiện bất lợi như: Mất nước nhanh làm cây bị héo khô. Những vi khuẩn và nấm làm cho cây bị héo khô. Cháy lá do nắng Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp giá thể sạch tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật 1.3.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy Các yếu tố ảnh hưởng đến mẫu cấy bao gồm: Kiểu di truyền, tuổi cây, tuổi mô và cơ quan, tình trạng sinh lí, vị trí mẫu trên cây, kích thước của mẫu, vết thương, phương pháp cấy. 1.3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bao gồm: Khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, cacbon và nguồn năng lượng, Vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng, hợp chất hữu cơ không xác định, amino acid và nguồn cung cấp nitrogen khác, than hoạt tính và yếu tố đặc môi trường. 1.4. Các nhân tố đảm bảo trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật cần đảm bảo những nhân tố sau: Đảm bảo điều kiện vô trùng. Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách. Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy. 1.4.1. Đảm bảo điều kiện vô trùng Ý nghĩa: Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối, khoángrất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật nên nếu môi trường bị nhiễm thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt nuôi cấy sẽ phủ đầy vi khuẩn và nấm, mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần. Vô trùng các nguồn tạp chất: Dụng cụ thuỷ tinh: rửa sạch và sấy ở 1600 c/1 giờ (trừ các loại dung để đo thể tích). Nút đậy: bông không thấm nước. Nút phải tương đối chặt để bụi không đi qua được và nước không bay đựơc trong quá trình nuôi cấy. Mô nuôi cấy: dùng các chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy. 1.4.2. Môi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng là nhân tố quan trọng quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy. Hầu hết các môi trường dinh dưỡng được sử dụng để nuôi cấy mô và tế bào thực vật cơ bản gồm những thành phần sau: Các muối khoáng đa lượng và vi lượng. Các vitamin. Các amino axít. Nguồn Cacsbon: một số loại đường. Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch triết nấm men, dịch triết khoai tây Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại thạch (agar). 1.4.3 Chọn mô cấy và xử lý mô cấy Tùy từng loại mà chọn mô thích hợp. Thông thường các mô trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy, trừ những mô đã hoá gỗ. Tuy vậy, khi để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước tiên người ta chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. 1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.5.1 Ưu điểm Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có những ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống: Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: Trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấnmà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được. Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng thương mại. Cây con tạo ra thống nhất về mặt di truyền. Tạo cây sạch virut thông qua xử lí nhiệt độ hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm Bảo quản nguồn giống in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện tích nhỏ. Tạo cây có khả năng tạo hoa, quả sớm, chọn được dòng đực, cái theo ý muốn. Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen. 1.5.2 Nhược điểm Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống thì phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm cần phải được khắc phục như: Giá thành cây con được sản xuất còn khá cao. Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài để thích ứng trước khi có thể thích ứng trồng nguyên vị ở vườn ươm. Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình. Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. 2. VAI TRÒ ĐIỀU TIẾT CỦA HOOCMÔN ĐỐI VỚI NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô. Những hoocmôn khác như Giberilin, Ethylene, Abscisic acid chỉ được sử dụng theo từng thời kì. 2.1. Vai trò của Auxin Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được sử dụng với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Cùng với cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone của nhóm này có hoạt tính như: Tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác động của các auxin thường liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ ... Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin thường dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic Acid), 2,4 - D (Dichlorphenoxy Acetic Acid). 2.2. Vai trò của cytokinin Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là BAP (6 - Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - 1 - H - 6 - amin ), zeatin (6 - (4 - hydroxy - 3metyl - trans - 2 butanylamin) purin). Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 0,2 mg/l. Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ hợp tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn. Bổ sung tổ hợp hoocmôn sinh trưởng mới cho các quá trình khác nhau: Tỷ lệ Auxin/ Cytokinin < 1 tăng cường quá trình tạo chồi. Tỷ lệ Auxin/ Cytokinin > 1 tăng cường quá trình tạo rễ. Tỷ lệ Auxin/ Cytokinin = 1 cân bằng quá trình tạo rễ và tạo chồi. 2.3. Giberilin Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước chồi nuôi cấy là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính. Giberillin có những chức năng cơ bản sau: Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào. Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống. Ức chế hình thành rễ bất định. Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa vá sinh trưởng của ống phấn. 2.4. Abscisic axít (ABA) Trong nuôi cấy mô và tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật. 3. ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY MÔ Có thể tóm tắt các khả năng ứng dụng của nuôi cấy thực vật in vitro vào công tác giống cây trồng ở một số điểm chính sau: Nhân nhanh và duy trì các kiểu gen hiếm, làm vật liệu cho chọn giống, những giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, có giá trị kinh tế cao. Làm sạch bệnh virut để phục tráng những giống thoái hóa. Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn tạo giống. Những ứng dụng nuôi cấy mô trong thực tế đang được áp dụng rộng rãi: nhân nhanh được nhiều giống cây lương thực, thực phẩm ( lúa chịu mặn, khoai tây, suplơ, măng tây...), giống cây nông nghiệp ( mía, cà phê...), giống cây hoa ( cẩm chướng, các loại lan, đồng tiền, lili...), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây...), cây lâm nghiệp ( bạch đàn keo lai, thông, tùng, trầm hương) Ví dụ một số quy trình kĩ thuật nuôi cấy mô đang được áp dụng: KẾT LUẬN Công nghệ nuôi cấy mô tế bào hiện nay đang rất phổ biến và là nghành có tiềm năng phát triển. Không chỉ riêng lĩnh vực cây trồng, công nghệ nuôi cấy này còn có ở động vật và cả con người. Thời gian nhanh và số lượng nuôi cấy tăng, dễ dàng lấy mẫu, đó là một trong những ưu điểm của công nghệ này. Theo tình hình hiện nay thì vấn đề này rất thích hợp với việc đưa vào trồng cây, cải tạo đất ,bảo vệ môi trường. TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội. Nguyễn Thành Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân (2005), Kết quả bước đầu nhân giống in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.) bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật: 450-453. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuậ Nguyễn Như Khanh (2006), Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục Hà Nội. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thuỷ Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB Đại Học Quốc gia Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Thành ( 2000), Nuôi cây mô tế bào thực vật nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội. Nguyễn Văn Uyển (1996), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông Nghiệp TPHCM. Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), NXB Giáo dục Hà Nội.