Đề tài Nuôi cấy mô sẹo và tế bào đơntạo và chọn dòng đột biến thu nhận các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học

NUÔI CẤY MÔ SẸO VÀ TẾ BÀO ĐƠNTẠO VÀ CHỌN DÒNG ĐỘT BIẾN THU NHẬN CÁC CHẤT THỨ CẤP CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC GV hướng dẫn:Võ Thị Xuyến Nhóm thực hiện:Trịnh Thị Huyền Huỳnh Thị Kim Chi Bùi Thị Thu Hương Nguyễn Anh Thư Vương Thị Ngọc Diệp Ngô Như Ngọc Lê Thị Anh Đào  A-Nuôi cấy mô sẹo B-Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào đơn C- Nuôi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp A-NUÔI CẤY MÔ SẸO 1-Sự hình thành mô sẹo 2-Sự hình thành chồi từ mô sẹo 3-Tính bất định về mặt di truyền 4-So saùnh vi nhaân gioáng vaø nuoâi caáy moâ seïo 1-Sự hình thành mô sẹo Cơ sở sinh lí:tính toàn năng Mô sẹo là một khối tế bào (Mô sẹo từ rễ cây cúc gai) - Sự hình thành mô sẹo gồm 3 giai đoạn : phát sinh mô sẹo phân chia tế bào biệt hóa - tế bào nhu mô và thành phần tế bào râybiệt hóa tế bào những chất liệu cấu tạo nhu mô các loại,các tế bào rây...hơn nữa hình thành mô phân sinh(trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ)mô sẹo Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo: sự biến tính tế bào do độ già của mẫu sự thay đổi tế bào chất của nhân thời gian duy trì điều kiện nuôi cấy thành phần môi trường, nhất là chất sinh trưởng 2-Sự hình thành chồi từ mô sẹo Được điều khiển bằng: Các chất sinh trưởng đi vào môi trường Điều kiện nuôi cấy. Dịch chiết Tỷ lệ cytokinin/auxin Quá trình hình thành chồi xảy ra qua 2 giai đoạn: tái phân hóaxảy ra quá trình chuyển các tế bào biệt hóa thành mô sẹo hình thành các mầm mống cơ quansử dụng các phương pháp phù hợp tổng hợp DNA và protein xảy ra rất mạnh, hàm lượng đường cũng tăngcác mô sẹo hình thành cấu trúc hình tháitạo chồi 3-Tính bất định về mặt di truyền NCMS: biến dị tế bào soma(biến dị về chất lượng , số lượng và năng suất và biến dị này không di truyền. ). Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. 4-So saùnh vi nhaân gioáng vaø nuoâi caáy moâ seïo Vi nhaân gioáng :taùch ñænh choài hoaëc moâ phaân sinh  khöû truøngñöa vaøo nuoâi caáy ôû moâi tröôøng phuø hôïpChoàichồi nhaân leântaùch chồi chuyeån sang moâi tröôøng môùi vaø qui trình cöù theá ñöôïc laëp laïi. cho heä soá nhaân thaáp hôn ,nhöng caùc choài nhaân giöõ laïi ñöôïc nhöõng ñaëc ñieåm cuûa phoâi goác, ít hoaëc khoâng bò thay ñoåi veà maët di truyeàn. Nuôi cấy tb đơn Những hệ thống NC DHPTB đơn ST và TĐC ở tb thực vật trong NC batch TT ổn định về ST và TĐC trong hệ thống NC liên tục mở Tạo và chọn dòng ĐB qua NCTB NCTB đơn cây mía và tạo dòng chống chịu amino acid NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN: Là nuôi cấy dịch huyền phù chứa nhiều tế bào liên kết với nhau. Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo có khả năng biệt hóa trong môi trường lỏng, và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy. NHỮNG HỆ THỐNG NC DHPTB ĐƠN: Nuôi cấy batch trên máy lắc: Nuôi cấy batch trên qui mô công nghiệp: Hệ thống nuôi cấy liên tục kín: Hệ thống nuôi cấy liên tục mở: ST VÀ TĐC Ở TBTV TRONG NC BATCH: Trong suốt giai đoạn lag-phase, tb giai đoạn stasionary-phase trong NC phát triển một sinh khối tổng hợp TBC mới và các cơ quan tử liên hệ, lặp lại DNA và bắt đầu phân chia. Kế là giai đoạn có tốc độ phân bào giới hạn không đổi và cực đại→thể tích tb trung bình giảm nhanh. Sự ST bắt đầu giảm, và tb đi vào giai đoạn stasionary-phase. TÌNH TRẠNG ỔN ĐỊNH VỀ ST VÀ TĐC TRONG NHỮNG HTNC LIÊN TỤC MỞ: Trong môi trường nuôi cấy đơn thì trạng thái ổn định kéo dài có thể đạt được. Trạng thái cân bằng của tế bào: Có đặc tính được xác định bằng: số tb đầu tiên, thể tích tb đậm đặc, trọng lượng khô tb, tp protein, DNA và RNA, tốc độ hô hấp. Có tốc độ không đổi đồng hóa nitrogen, không đổi nồng độ các amino acid và sự hoạt động của các enzyme có liên quan đến sự đồng hóa nitrogen, và trong hô hấp protein. Khi tình trạng ổn định được thiết lập trong chemostat, MTNC cũng có tp không đổi. Turbidostat có thể được sử dụng để khảo sát, trong NC đạt tới tốc độ cao sx sinh khối tương tự, chất điều hòa ST kiểm soát sự cân bằng giữa sự phân bào và sự nở lớn của tb. CHỌN VÀ TẠO DÒNG ĐB QUA NCTB: ĐB chống chịu amino acid: ĐB chống chịu bệnh: ĐB chống chịu mặn: ĐB chống chịu nhiệt: NCTB ĐƠN MÍA VÀ CHỌN DÒNG TB CHỐNG CHỊU AMINO ACID: Tạo mô sẹo: cấy Tái sinh cây từ mô sẹo: Kỹ thuật tách và NCTB đơn trong MT lỏng: cấy đặt trên máy lắc lọc và gạn dd Kỹ thuật gieo tb đơn trên đĩa petri và tái sinh cây từ tb đơn: gieo Mảnh mô sẹo MT dd bán rắn Mô sẹo Bình tam giác Huyền phù Huyền phù (3-5 ngày tuổi) MT thạch Mô sẹo Chồi… Ảnh hưởng của Lysine, Thrionine, Methionine và Homoserine đến ST của mô sẹo, cây con, cụm chồi, tb đơn mía. cấy Chọn dòng tb chống chịu ngược Lys+Thr (2mM+2mM) và khảo xác hàm lượng amino acid của dòng chống chịu Cấy cấy lại cấy Chồi mía MT thạch Lys+Thr(0,5-2mM) Mô sẹo sống sót LT2 MT không có Lys+Thr MT có Lys+Thr Dòng mô sẹo MT mới Thu nhận C- Nuôi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp 1. Các hợp chất thứ cấp thực vật 2.Nuôi cấy tế bào thực vật 3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 4. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học 1. Các hợp chất thứ cấp thực vật -Tieán hoá của thực vật: là sản phẩm của các phản ứng hóa học giữa thực vật với môi trườngchaát độc,màu saéc vaø höông vò ñaëc bieätvai troø heát söùc quan troïng trong quaù trình ñaáu tranh sinh toàn -Con người: các hợp chất dùng làm hóa học ,dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị. Những chất thứ cấp như: alkaloid, antibiotic, tinh dầu, resin,taxol, tannin, các glycoside, sterol, polysaccharide, hormone thực vật và saponin. Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid Họ alkaloid gồm: codein,nicotine, caffeine và morphinetác dụng lên hệ thần kinh,hệ cơ,mạch máu,bộ máy hô hấp,làm thuốc chữa bệnh. Cà độc dược Trà xanh và quả thuốc phiện Cây cà phê Các tinh dầu chất mùi, chất thơm và dung môi. Giống như những lipit khác,không tan trong nước. Các glycoside thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm. 2.Nuôi cấy tế bào thực vật 2.1-Phương pháp tái sinh mô sẹo và dịch huyền phù: khối callusđặt trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy)tế bào dịch huyền phù nuôi cấy callusnuôi cấy trên môi trường rắntế bào mô sẹo 2.2-Phương pháp chọn lọc dòng đột biến: a)Kỹ thuật dòng hóa tế bào đơn: Nguyên tắc: dựa trên kỹ thuật trải tế bào trên đĩa petri có agar Có 2 kĩ thuật thường được sử dụng để trải tế bào: -Nuôi cấy khối mô sẹo dinh dưỡng bên trên lớp tế bào được trải để lớp tế bào này nhận những chất thúc đẩy sinh trưởng tiết ra từ mô sẹo. -Nuôi cấy tế bào trên môi trường điều kiện. b)Phát sinh đột biến : Chất gây đột biếnnhững dòng tế bào đơn bội những dòng tế bào đột biến với tỉ lệ cao c) chọn dòng tế bào đột biến  3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật Điều kiện tích lũy các hợp chất thứ cấp: Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao Cung cấp tiền chất c dòng tế bào cho năng suất cao Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Quá trình thu nhận các chất có hoạt tính sinh học được điều khiển bởi nhiều nhân tố khác nhau 4.Những thành tựu trong nuôi cấy tế bào thực vật sản xuất các hoạt chất sinh học Nuôi cấy tế bào các loài Taxus nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó nuôi cấy dịch huyền callus có nguồn gốc thân và lá cây T. Mairei(Đài Loan)  sản xuất khoảng 200 mg taxol. nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosanasản xuất imperatorin chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến Nuôi cấy callus rễ của cây Panax ginseng(nhân sâm)  saponins và sapogenins dược phẩm quý giáchữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể Nuôi cấy tế bào cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum Podophyllotoxin  điều trị chống khối u 5.Thu nhận taxol từ nuôi cấy mô cây thông đỏ- dược phẩm chủ yếu trong hoá trị ung thư Phần 1: Tổng quan về thông đỏ: Taxus wallichiana zucc - Giới :Plantae - Ngành : Pinophyta - Lớp: Pinopsida - Bộ : Pinales - Họ : Taxaceae - Các chi:Taxaceae Cephalotaxaceae -Phân bố :Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Philippines, Indonesia, Nepal, Afghanistan…  Một số giá trị từ cây thông đỏ - Lá trị hen suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hoá. - Cành và trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân non dùng trị bệnh đau đầu. -Từ cây thông đỏ  Taxol . Taxol chiết xuất từ vỏ các loài: T.brevifolia, T. cuspidata, T. yunnanensis, T. baccata và T. wallichiana. Taxol chữa trị các bệnh ung thư Phần 2: Nuôi cấy thông đỏ để thu nhận taxol Nuôi cấy tạo callus thông đỏ Mẫu thực vật Xử lý mẫu thực vật Nuôi cấy tạo thành mô sẹo Nuôi cấy trong môi trường lỏng trong các bình thủy tinh có dung tích nhỏ, lắc liên tục Nuôi cấy trong các thiết bị lên men có dung tích lớn, khuấy đảo liên tục Ly tâm hoặc lọc Bã Dịch lọc được xử lý để thu nhận sản phẩm Đặc biệt, "Trong thời gian sắp tới, sẽ tiếp tục tiến hành thử nghiệm hình thức nuôi cấy tế bào thông đỏ dạng bioreactor ("lắc lớn") trong môi trường lỏng để có thể tạo nguồn nguyên liệu tách chiết taxol một cách nhanh chóng: Cứ 32.000 lít vừa tế bào vừa dung dịch được nuôi cấy dạng bioreactor sẽ thu được 1kg taxol". Xin chân thành cảm ơn cô và các bạn đã lắng nghe