Đề tài Kỹ thuật nhân giống hoa Lan

GVHD: Ths. Võ Thị Xuyến SVTH :Trần Thị Liên Phan Mỹ Linh Phan Thu Hà Ngô Quang Hùng Trương Thị Thu An Nguyễn Thị Anh Thư Trần Thị Thùy Trang Tô Thị Hồng Phượng Châu Huỳnh Kim Phụng Đoàn Thị Bích Nhung Bộ Giáo Dục – Đào Tạo Trường Đại Học Dân Lập Văn Lang Khoa Công Nghệ Sinh Học Bài thuyết trình : Kĩ thuật nhân giống lan Mục lục A/. Giới thiệu chung B/. Giá trị kinh tế C/. Phương pháp nuôi cấy I.Phương pháp cổ điển. II.Phương pháp in vitro A. Giới thiệu chung Phân loại khoa học: Giới : plantae. Ngành : Angiospermatophyta. Lớp: Liliopsida. Lớp phụ : Liliidea Bộ : orchidales. Họ : Orchidaceae. Giống: Dendrobium sp Hoa lan là một trong những giống hoa rất được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp rất sang trọng và trang nhã rất nhiều chủng loại, mỗi loại mang một vẻ đẹp khác nhau, hương thơm lại quyến rũ. Chính vì vậy mà hiện nay, rất nhiều gia đình đang có thú chơi hoa lan. B. Giá trị kinh tế Hoa lan là sản phẩm trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao, ngày càng có nhiều cơ sở kinh doanh hoa lan mọc lên, kinh doanh nhiều chủng loại . Ngày nay việc trồng hoa lan đem lại một nguồn lợi đáng kể cho người trồng.Hoa lan được xuất khẩu đi khắp thế giới. C. Phương pháp nuôi cấy I. Phương pháp cổ điển 1. Nhân giống vô tính: a) Tách bụi: - Thường được sử dụng cho các giống lan đa thân Cattleya, Bendrobium, Cymbidium… và những giống tương tự : ở mỗi gốc giả hành có ít nhất một chồi ngủ  mỗi giả hành thành một đơn vị để trồng b) Giâm cành - Là các chồi “mắt ngủ” có thể sản xuất ra một hoặc nhiều cây.  - Chọn mẫu Mắt cây phù hợp: cắt 3 cm ở phía trên và dưới mắt của cành hoa. phải dùng dao bén để không làm các mô bị tổn thương nhiều. gỡ bỏ các màng bao. - Giâm cành trên đất Đặt mắt cây đã chuẩn bị nằm ngang trong đất trồng, mắt cây phải ở phía trên. Tưới ẩm và đậy khay với lớp plastic - Chăm sóc Đặt cái khay vào nơi sáng và ấm và tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp chiếu vào. Ưu và nhược điểm: Ưu điểm: + Cách thực hiện đơn giản. + Dễ chăm sóc. Nhược điểm: + Thời gian trồng rất lâu. + Sản phẩm tạo ra ít. 2. Nhân giống hữu tính: Sự thụ phấn: trong thiên nhiên lan thụ phấn được là nhờ côn trùng. Có 2 pp thụ phấn: Sự tự thụ phấn Sự thụ phấn chéo Tạo hạt: sau tự thụ phấn, bầu noãn từ từ trương phù to tạo thành quả. Mỗi trái chứa hàng nghìn đến hàng triệu hạt. Gieo hạt: trong thiên nhiên hạt muốn nảy mầm phải được nhiễm một loại nấm kí sinh. II. Phương pháp hiện đại: Cải tiến phương pháp giâm cành Nuôi cấy mô Nuôi cấy hạt Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 1. Cải tiến phương pháp giâm cành a. Môi trường nuôi cấy:Để khởi đầu phát triển của "mắt ngủ“ dùng chất dung môi: cytocinins (chất kích thích sinh trưởng - phytohormon). Sigma's P6793 (Phytotechlab P793). b. Cách thực hiện: Chọn mẫu: Cắt chéo với 1cm ở trên và dưới mắt của nhánh hoa. Điều quan trọng là phải dùng dao bén để tránh làm tổn thương các mô. Cẩn thận gỡ bỏ vỏ bao mắt cây Cách khử mẫu: Ngâm mắt cây đã cắt vào cồn 70% vài giây. - Đặt các mắt cây vào trong nước Oxi già 0,5% trong 30 phút. - Đặt chúng vào trong nước Oxi già (H2O2) 3% trong 15 phút. - Đặt các mắt cây đã khử trùng (trong ống nghiệm) nằm trên vỉ trong vùng hơi nước sôi. Đặt mẫu vào môi trường nuôi cấy - Dùng nhíp vô trùng lấy mắt cây đã khử trùng vào đáy lọ trong dung môi nuôi - Đậy ống nghiệm lại (trên hơi nước sôi) ống nghiệm kế tiếp cũng làm giống như vậy. Nếu muốn sản sinh nhiều hơn một mầm nên cắt 1/3 trên mắt cây. Bởi vì điều này mắt cây phát triển hàng chục chồi. Nuôi cấy mắt cây Cây con từ một mắt cây Chăm sóc: - Đặt các ống nghiệm bạn đã làm các mắt cây vào nơi ấm và sáng (khoảng 20°C). Tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp. chồi Chiloschista lunifera đang lớn Chồi Chiloschista lunifera đang lớn Có nhiều mắt cây tiết ra các hợp chất vào trong dung môi nuôi cấy làm đen dung môi nuôi cấy. Các hợp chất tiết ra sẽ giết chết các mắt cây nếu không thay dung môi nuôi mới. Khi mắt cây có 2 hay 3 lá nên thay dung môi không có chất kích thích tố (như Sigma P6668) để rễ bắt đầu phát triển. Ưu và nhược điểm: Ưu điểm: - Cây mới sinh sản sau này hoa sẽ trông giống cha mẹ chúng. - Từ một chồi ngủ có thể tạo được nhiều cây con… Nhược điểm: - Do kích thước và cấu trúc của các mắt cây đã làm tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn dùng cách nẩy mầm không cộng sinh.  Phải kiểm soát mỗi ngày trong tuần đầu tiên… 2. Kỹ thuật gieo hạt trong ống ngiệm( cách gieo hạt lan nẩy mầm trong điều kiện in-vitro) - Hạt lan rất khó nẩy mầm trong tự nhiên( chỉ nẩy mầm từ 1-2%) do hạt lan không có chứa anbumin và một phôi chưa phân hóa, có kích thước rất nhỏ nên không chứa chất dự trữ. - Dựa trên nguyên tắc này, các phòng thí nghiệm  nuôi cấy mô đã tạo môi trường gieo hạt lan trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo có khoáng, đường và hạt lan nảy mầm với tỷ lệ rất cao. - Hiện nay, phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp duy nhất có thể nhân giống lan trên qui mô công nghiệp. a. Đặc điểm của hạt lan: - Hạt lan rất nhỏ, như hạt bụi và không chứa nguồn dự trữ thức ăn. Trong tự nhiên, hạt có thể nẩy mầm nhưng sẽ không phát triển nếu không có sự tác động của nấm mycorrhizal. - Khi hạt lan đã nẩy mầm, nó sẽ tạo ra một lượng lớn các tế bào không phân hóa được gọi là protocorm. Sau đó, protocorm sẽ tiếp tục trong vài tuần, vài tháng, thậm chí cả năm tùy loài, đến khi đủ lớn để tạo thân và rễ. Hạt lan protocorm - Ở các loài lan đất,duy trì mối quan hệ cộng sinh này rất quan trọng trong suốt giai đoạn đầu tiên của cây, vì protocom nằm dưới đất nên không thể tự tổng hợp thức ăn. - Ở các loài lan phụ sinh, protocorm thường xanh và vì thế nó có thể tự tổng hợp được một ít thức ăn. b.Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi: 24-280o C. Cường độ chiếu sang: 2000-3000 lux. Thời gian chiếu sáng: 8 giờ/ngày. Ẩm độ trung bình: 60- 70% c. Phương pháp: .Khử trùng trái lan: Sử dụng Hypochlorite de calcium 10%: Ca(OCl)2. Việc khử trùng trái lan có thể thực hiện như sau: - Quả lan sau khi mổ ra, hạt thu được trước khi đem gieo cần tuyển chọn các hạt chắc, các hạt lép không thụ tinh loại bỏ bằng cách đem ly tâm trong nước cất; các hạt lan tốt sẽ lắng phía dưới ống nghiệm, hạt lép nổi lên trên, được gạn bỏ đi. - Các hạt tốt được tiếp tục khử trùng bằng Hypochlorite de calcium 10%: Ca(OCl)2. - Cho hạt lan và nước khử trùng vào ống nghiệm, vừa đủ phủ kín hạt lan, lắc mạnh, đều và để yên trong vòng 10 phút, sau đó đổ nước khử trùng và tiếp tục rửa hạt lan 3 lần bằng nước cất vô trùng. - Cuối cùng hạt lan đã khử trùng sẽ được gieo vào các bình chứa môi trường. Kĩ thuật gieo hạt trong ống nghiệm: - Sử dụng chai thủy tinh 100ml và 500ml để nuôi cấy.Tất cả môi trường được hấp khử trùng ở 1atm,1210C trong thời gian 20 phút. - Hạt sẽ nảy mầm trong ống nghiệm bằng thủy tinh hay bằng nhựa trên môi trường rắn có chứa đường và các loại khoáng chất cần thiết để hạt nảy mầm và phát triển. - Sau 2 tuần , hạt gieo bắt đầu biến đổi tạo thành một đám tế bào có màu xanh. - Số lượng protocorm ngày càng tăng nhanh sau 3-4 tuần , phình to lên và có lá mầm.(Sự tạo protocorm trong môi trường Knudson’C có bổ sung kích tố BA là tốt nhất). Đối với lan có 2 kiểu nảy mầm cơ bản: Nảy mầm cần mấm cộng sinh : + Gieo hạt với một lượng nhỏ mấm mycorrhizal thích hợp .Nấm này sẽ phát triển trên môi trường,bao phủ các hạt nảy mầm và mối quan hệ cộng sinh xuất hiện sẽ duy trì sức sống của protocorm cho đến khi nó tạo ra lá và có khả năng tự dưỡng→thường được áp dụng cho lan đất. + Ưu điểm: môi trường đơn giản (gồm bột yến mạch và một ít dịch chiết nấm men), cây sinh ra khỏe hơn,có khả năng kháng tác động của nấm tốt hơn cây đối chứng không cần nảy mầm. + Nhược : cần chủng nấm men mycorrhizal thuần khiết , hoặc quan hệ cộng sinh không phát triển, hoặc trở thành kí sinh và gieo hạt sẽ chết. Nảy mầm không cần nấm cộng sinh : sử dụng để nhân giống loài lan nhiệt đới.Môi trường sử dụng phức tạp hơn:muối khoáng,chất hữu cơ và đường với lượng thích hợp để hạt lan nẩy mầm mà không cần nấm. c.Ứng dụng của việc gieo hạt: - Gia tăng lượng hoa lan trên thị trường. - Nhân giống các loài lan hiếm nhằn nhân nhanh số lượng cả trong tự nhiên và trong các chương trình bảo tồn. - Cung cấp cây con để bán . giúp hạn chế sự khai thác cây hoang dại,kích thích sự quan tâm của công chúng và tạo nguồn thu ngân sách. - Kết hợp với kĩ thuật lai tạo giống tạo ra những cây lan khỏe mạnh có màu sắc đặc biệt. 3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: Hoa lan là một trong những giống hoa rất được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp rất sang trọng và trang nhã. Do đó kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền và đáp ứng nhu cầu của con người. Các bước thực hiện tách đỉnh sinh trưởng lan Dendrobium Quy trình trên được tiến hành qua các giai đoạn sau: a) Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy: - Theo Champagnat (1997) và Fast (1980), các chồi lan đang tăng trưởng dài 10-15 cm vừa mới nhú lá thường được dùng làm nguyên liệu cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng  Cắt bỏ gốc của mỗi mầm Khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70% 30 giây rửa sạch bằng nước cất vô trùng  ngâm trong Ca(OCl)2 2% 25 phút  mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4 - 5 lần. Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non. Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 700 trong 1 giây và rửa với nước cất vô trùng. Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng. Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô. b) Nhân giống: Môi trường nuôi cấy: tương đối đơn giản. Môi trường khoáng MS (1962) có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng BA 1mg/l và NAA 0.1 mg/l. Ngoài ra các chất chiết từ trái cây cũng được sử dụng như nước dừa 10%, khoai tây Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 220C - 260C và tuỳ vào mỗi loài. Sau khi tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô  cấy vào môi trường nhân giống. Sau 4 - 8 tuần, các đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn nhỏ gọi PLB (protocorm like body). Các PLB này được tách ra thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trường kích thích nhân nhanh PLB. c.Tái sinh cây hoàn chỉnh Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ). Sau 4 -5 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con. d) Chuyển cây ra vườn ươm: Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá  cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng. Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật. Ưu và nhược điểm: 1. Ưu điểm: Tạo ra cây con mang đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ, cây con không nhiễm bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Ít chiếm diện tích, không quá khó trồng, cho hoa đẹp lại lâu tàn. Là sản phẩm trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao, ngày càng có nhiều cơ sở kinh doanh hoa lan mọc lên, kinh doanh nhiều chủng loại. 2. Nhược điểm: - Nuôi cấy phải được thực hiện thật nghiêm túc và tỉ mỉ theo đúng quy trình, phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt. - Đối với các loài không phải là cây bản địa, phải được thuần hoá tại vùng mới chọn mẫu đem nuôi cấy mới đảm bảo hiệu quả. 4.Cấy mô: - Là kỹ thuật nhân giống nhanh chóng và hữu hiệu nhất. Người ta có thể cấy một loạt ra hàng ngàn hay hàng trăm ngàn cây lan nhỏ với đặc tính y hệt như cây lan mẹ. Điều kiện nuôi cấy: - Môi trường: + Có nhiều môi trường khác nhau được dùng trên thế giới để nuôi cấy mô nhưng môi trường Knudson 's C được xem là tốt nhất để cấy cho hầu hết các loài lan. + Môi trường cấy và nước cất phải được tiệt trùng ở nồi hấp ở áp suất 15 PSI trong 10 -30 phút. - Nhiệt độ lý tưởng cho việc nuôi cấy là 200 C+ 1 cho đa số các loài đa thân và 260 C +3 cho đa số các loài đơn thân. - Ánh sáng: nhân tạo được cung cấp bởi 2 loại đèn huỳnh quang và đèn nóng sáng. ánh sáng phải được sử dụng liên tục 16 giờ,18 giờ hoặc 24 giờ tùy loài. Các đèn phải đặt cách môi trường cấy 0,4 - 0,5m. - Độ pH của môi trường thích hợp cho mô phát triển:khoảng 4,8 - 5,5, thông thường trong khoảng 5 - 5,2 là tốt nhất. -Máy lắc : các kết quả về cấy mô cho biết rằng, môi trường lỏng được xáo trộn trên máy lắc có hiệu quả hơn môi trường đặc. Tốc độ quay của máy lắc thay đổi tùy theo loài lan và giai đoạn cấy. + Trong giai đoạn đầu, điều chỉnh máy lắc với tốc độ 1/4 - 1/5 vòng/phút (làm cho môi trường dinh dưỡng hòa đều) + Sau đó, tốc độ tăng dần 100 vòng/phút phổ biến cho các loài. Thời gian của mô quay trên máy lắc có thể thay đổi tùy loài lan, thưường từ 3 - 4 tuần Vật liệu cấy: Người ta có thể cấy nhiều bộ phận khác nhau của cây lan để hình thành các thể giống protocorm . Vd: lấy từ đáy lá, đỉnh lá, rễ, lõi của các mầm non mới mọc… Phương pháp khởi tạo protocorm từ mô lá : - Các mẫu lá thu được từ các chồi sinh dưỡng được cắt theo kích thước 5 x 5 mm. - Các mẫu lá được đặt nuôi trên môi trường MS 1/2 bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thực vật NAA 1mg/l, BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l   - Cho vào máy lắc chậm xoay vòng . - Sau 10 tuần nuôi cấy: các protocorm được hình thành chủ yếu từ các mảnh lá ở phần gốc và ít ở các mảnh lá phần đỉnh. - Khi đã có Plbs, người ta cắt thành 3 - 6 phần, mỗi phần sẽ sự đâm chồi và chưa đầy 1 tháng sẽ sản xuất đến 12 plbs mới (tiến trình này có thể tiếp tục mãi, vì thế mỗi tháng có thể nhận được 4 lần con số cây đó và sau một năm sẽ có đến 4 triệu cây con từ một chồi duy nhất.) - Sau một thời gian, các chồi xuất hiện xung quanh mép lá tiếp tục phát triển trong khi phần mô lá ban đầu bị hoại đi. - Sự tái sinh chồi từ protocorm: khi tái sinh thành cây con từ protocorm chỉ cần sử dụng các môi trường khoáng có bổ sung nước dừa, peptone, khoai tây…mà không sử dụng bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào. - Sự ra rễ : các chồi tái sinh từ PLB sẽ ra rễ và phát triển mạnh trên môi trường có bổ sung nước dừa, chuối, khoai tây… và cũng không cần bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào. Tuy nhiên, việc này còn tùy thuộc vào giống. - Chồi sẽ ra rễ dài, lá to. Sau 3-4 tháng nuôi cấy có thể đem cây con ra trồng ngoài vườn ươm. 5.Biến đổi gene: -Người ta đã phát hiện ra 1gene đặc biệt và biến đổi gene đó làm cho cây lan mau ra hoa hơn và có thể thay đổi hình dạng của cánh hoa. Cách tiến hành: - Để cho hoa nở sớm hơn, người ta đã biến đổi gene AGL24 được tìm thấy trong cây Aarabidopsis. -Người ta đã hoạt hóa gene này để nó hoạt động mạnh hơn bình thường trong giai đoạn đầu thảo mộc tăng trưởng, lúc các tế bào của thảo mộc đang thay đổi thành những lọa mô khác nhau. Điều này làm cây ra hoa sớm hơn. -Ngay khi hoa bắt đầu phát triển, gene này phải được ngưng hoạt động, dẫn đến kết quả cánh hoa cũng bị biến dạng.