Đề tài Kỹ thuật điện di trên Gel

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH. BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH SINH HỌC PHÂN TỬ: ĐỀ TÀI:
THÀNH VIÊN: VŨ THỊ NGUYỆT TRƯƠNG THỊ THUỲ LAM NỘI DUNG CHÍNH 1. Định nghĩa điện di 2.Phương pháp điện di a.Nguyên tắc điện di b.Cách tiến hành 3. Điện di DNA trên gel a. Điện di trên gel agarose b. Điện di trên gel poly acrylamide c. Điện di trường xung điện d.Tinh sạch axit nucleic bằng điện di trên gel agarose 4. Ứng dụng kĩ thuật điện di 1. Điện di: Điện di là sự dịch chuyển của các thành phần tích điện về hướng các điện cực tích điện trái dấu trong dung dịch dưới tác dụng của điện trường. Các phần tích điện dương chuyển tới cực âm và các phần tích điện âm chuyển về cực dương. Tốc độ dịch chuyển thay đổi theo hình dạng và kích thước phân tử. Kĩ thuật này có thể dùng để tách hoặc phân tích các phân tử như DNA, RNA hay prôtein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng. Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo một điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử và các chất nhuộm khác nhau (Ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di. 2.Phương pháp điện di: Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong phân tích định tính và trong việc thu nhận mẫu axit nucleic hiển thị trực tiếp. a) Nguyên tắc điện di: Điện di là kĩ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR. Dựa vào đặc tính cấu tạo của các axit nucleic, các axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là khối lượng phân tử tức là số lượng nucleotic hay cặp nucleotic và nồng độ các chất cấu thành gel. Hai loại gel được sử dụng trong axit nucleic là gel polyacrylamide và gel agaroza. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel phụ thuộc kích thước trung bình của các đoạn axit nucleic. Trên cùng một bảng gel, có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau một gian như nhau. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, người ta dùng phương pháp làm hiện hình. Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidi bromua (C21H20BrN3). Chất này sẽ gắn xen các bazơ của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại. Như vậy dễ dàng cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel và có thể phân biệt được phân tử DNA trên cùng một bảng gel. Đối với gel polyacrylamid, các phân tử thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kĩ thuật phóng xạ tự ghi. Trong điện di người ta sử dụng thang DNA chuẩn, thường là DNA người, khi điện di cho chạy cùng với mẫu nghiên cứu, qua đó có thể so sánh với DNA mẫu với DNA chuẩn để biết trọng lượng phân tử hoặc trích ly được DNA khác nhau. b) Cách tiến hành: Hệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di, khuôn đổ gel và hệ thống soi chụp ảnh. Các bước được tiến hành như sau: Cân khoảng 1g agarose cho vào 100 ml đệm TBE (tris-borate-EDTA) hoặc TAE (tris-acetate-EDTA) ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lò viba (làm nóng chảy gel và không tạo bọt). Làm nguội gel xuống 50-550 C, thêm 1 µl ethidi bromua đổ gel vào khuôn gel và lắp lược. Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2-5 mm. Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắm điện cực. Điện di trong khoảng 30 phút với điện thế 100 -120 V. Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả. Lưu ý: tuỳ thuộc vào kích thước của DNA mẫu mà người ta chọn loại gel (agarose,polyacrylamid), nồng độ gel, loại đệm (TBE hoặc TAE). Đệm TAE cho độ phân giải cao các phân đoạn lớn hơn 4 kb, trong khi đệm TBE có phân giải cao từ 0,1 đến 3 kb. Ngoài ra độ phân giải các phân đoạn DNA còn phụ thuộc vào phương pháp điện di, tối ưu điện thế, tối ưu lượng DNA nạp và đệm nạp. Thuốc nhuộm ethidi bromua (EtBr) là một thuốc nhuộm huỳnh quang mà có thể nhận biết cả hai loại DNA sợi đơn và sợi kép. Mặc dù vậy, ái lực liên kết với DNA sợi đơn tương đối thấp hơn so với DNA sợi kép. DNA nhuộm EtBr được nhận biết bằng tia cực tím. Tại bước sóng 254 nm, ánh sáng UV được hấp thụ bởi DNA và chuyển sang thuốc nhuộm. Tại bước sóng 302 nm và 366 nm ánh sáng UV được hấp thụ bởi chính thuốc nhuộm. Trong cả hai trường hợp, năng lương được phát xạ ứng với tia tại bước sóng 590 nm trong vùng vàng đỏ của quang phổ thấy được. EtBr là chất gây đột biến mạnh, cần phải mang găng tay khi thao tác với dung dịch thuốc nhuộm này và các gel nhuộm. Để tạo độ phân giải cao rõ nét, các vạch và nền nhạt nên nhuộm gel với EtBr ngay sau khi điện di 3. Điện di DNA trên gel: Sản phẩm cắt của DNA được điện di trên gel agarose (hoặc polyacrylamic) sẽ tạo thành các giải băng khác nhau. a) Điện di trên gel agarose: Agarose là một loại polymer tách từ rong biển, cấu tạo bởi 2 monomer là D-galactose và 3,6 anhydro-L-galactose. DNA mang điện tích âm, di chuyển từ (-)đến (+). Tốc độ di chuyển phụ thuộc: .Kích thước phân tử. .Dạng cấu trúc DNA .Nồng độ agarose trong gel. .Điện thế. .Nhiệt độ. .Thành phần chất đệm điện di… Đây là loại gel thông dụng nhất, thao tác đơn giản, Gel agarose được dùng để phân tích những đoạn có kích thước 0,5-20 kb, được để trên một giá thể nằm ngang, sau khi đun tan để nguội gía có lắp lược. Rút lược ra sau khi gel đã đông lại, đặt gel nằm ngang trên buồng điện di, chứa dung dịch đệm. Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Các axit nucleic trong gel agarose được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen giữa các bazơ của axit nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của UV. Ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ. Sau điện di, gel được chiếu sáng bằng UV (
=300 nm), axit nucleic hiện vạch đỏ da cam, để ước lượng kích thước các trình tự axit nucleic trong gel agarose, người ta dùng yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử là một tập hợp nhiều trình tự DNA, có kích thước đã biết. b) Điện di trên gel polyacrylamide: Điện di trên gel polyacrylamide được dùng trong nhiều năm để tách RNA và Protein dựa vào trọng lượng phân tử của chúng. Vào năm 1970, Daniel Nathans dùng điện di trên gel polyacrylamide như công cụ đơn giản và nhanh chóng để tách các đoạn DNA bị cắt. Dùng để tách các đoạn có kích thước <1000 bp (cặp bazơ) (bảng 7.1), tuy nhiên thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn gel agaroza. Do đó gel này chỉ thao tác với mục đích đặc hiệu như: -Tinh sạch các oligonucleotid tổng hợp. -Xác định trình tự đoạn DNA nhỏ. -Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài <500 bp. -Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phương điện di thực hiện theo chiều thẳng đứng. Điện di trên gel có ưu điểm vì: DNA giống như một axit hữu cơ, nó tích điện âm, DNA nhờ tính axit của nhóm phosphat liên kết với deoxyriboza tạo nên trục của thang xoắn kép. Trong dung dịch, ở PH trung tính, các oxy tích điện âm phát ra từ phosphat ở phía bên ngoài của phân tử DNA. Khi đặt vào điện trường, DNA sẽ bị thu hút về cực dương và chạy khỏi cực âm. Trong lúc điện di, các đoạn DNA được phân loại theo kích thước trong gel polyacrylamide. Những lỗ gel làm việc như các lỗ rây phân tử mà những phân tử nhỏ dễ dàng qua hơn các phân tử lớn. Do đó, khoảng cách mà đoạn DNA đi qua sẽ tỉ lệ nghịch với trọng lượng phân tử của nó. Trong một khoảng thời gian cho trước thì các đoạn cắt càng nhỏ càng đi xa nơi xuất phát hơn là các đoạn lớn. Do kích thước lỗ nhỏ nên gel polyacrylamide chỉ tách một cách có hiệu quả những đoạn DNA nhỏ hơn 1000 cặp nucleotide. Bởi vậy, khả năng này không thoả mãn được yêu cầu tách các đoạn gen vài ngàn nucleotide, ít tốn thời gian hơn li tâm. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide vẫn được dùng phổ biến, sử dụng kết hợp với việc đánh dấu phóng xạ các đoạn DNA. Tiếp theo, người ta cắt gel polyacrylamide thành nhiều khúc rồi đo hoạt tính phóng xạ trong mỗi khúc đó bằng máy đếm xang. Hình ảnh hoạt tính phóng xạ được dùng để vẽ nên hình ảnh các giải DNA trên gel. loại gen  phạm vi phân tách (cặp bazơ)   0,3% agaroza  50000 đến 1000   0,7% agaroza  20000 đến 300   1,4%agaroza  6000 đến 300   4% acrylamid  1000 đến 100   10% acrylamid  500 đến 25   20% acrylamid  50 đến 1   Bảng 7.1 Đặc tính phân tách của các gel agarose và polyacrylamide. c) Điện di trường xung điện: Phương pháp điện di trường xung điện sử dụng để phân tách các phân tử DNA rất lớn >50 kb, không thể phân tách được bằng gel agaroza dù ở nồng độ tối thiểu là 0,4%. Nguyên tắc của loại điện di này dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di. Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải tự định hướng lại. Thời gian cần cho sự định hướng tuỳ thuộc vào kích thước của phân tử, phân tử càng dài thì thời gian tự định hướng càng lớn khiến cho nó di chuyển chậm hơn một phân tử kích thước nhỏ. d) Tinh sạch axit nucleic bằng điện di trên gel agroza: Sau khi điện di các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại theo một trong các phương pháp sau: -Phần agaroza chứa các vạch đó được cắt ra và DNA được thu nhận sau khi đã khuyếch tán từ gel agaroza vào một dung dịch đệm thích hợp. - Một “giếng nhỏ “được khoét trong agaroza ngay trước vạch DNA. “Giếng “ này được bơm đầy dung dịch đệm và điện trường được tái lập. DNA di chuyển vào “giếng” chứa đầy dung dịch đệm và được thu nhận lại. -Điện di được thực hiện trong một gel agaroza đặc biệt như ( nusieve hay seaplaque) có điểm nóng chảy thấp (650C ). Khi agarose đã hoàn toàn tan chảy DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và tủa. Nhóm nghiên cứu tại phòng thí nhiệm Cold Spring Harbor do Joseph Samborook lãnh đạo đã có hai cải tiến quan trọng nhất cho việc dùng điện di DNA làm cho việc phân tách các đoạn DNA nhanh hơn. Thứ nhất, họ thay thế gel polyacrylamide bằng gel agaroze - một dạng agar rất tinh khiết. Cơ chất agaroze tách rất hiệu quả các đoạn DNA có kích thước từ 100-50000 nucleotide. Các đoạn DNA kích thước khác nhau có thể được tách ra bằng cách thêm nồng độ agaroze. Ở nồng độ thấp ( thấp hơn 0,3%) ta có gel thưa để tách các đoạn lớn, còn ở nồng độ cao ( 2% ) ta có gel mau – dùng tách các đoạn nhỏ. Thứ hai, họ dùng thuốc màu huỳnh quang ethidium bromit để nhuộm các giải DNA trên gel. Sau khi nhuộm các đoạn được phát hiện trực tiếp bằng tia tử ngoại (UV). Kĩ thuật này rất nhạy, có thể phát hiện đến 5ng(0,005g) DNA. Bởi vậy, chúng ta dễ hiểu vì sao ethidium bromit nhanh chóng thay thế cho việc đánh dấu pháng xạ trong phân tích các đoạn DNA bị cắt. Hiện nay, phương pháp thường dùng giống như nhóm nghiên cứu ở Cold Spring Harber đã mô tả năm 1973. Dòng điện trên gel, DNA tích điện âm chuyển từ hốc chứa vào gel, di chuyển qua các lỗ gel để tới cực dương. Phân tử thuốc màu tích điện âm không tác động gì với DNA, nhưng di chuyển một cách độc lập tới cực dương. Ví dụ: Loại phẩm màu làm dấu thông thường là bromophenol blue có tốc độ di chuyển tương đương với đoạn DNA 300 nucleotide. Sự di chuyển trông thấy được của thuốc màu cho phép ta phỏng đoán sự di chuyển tương ứng của dải DNA không thấy. Sau khi điện di, gel được ngâm lắc trong dung dịch loãng ethidium bromit. thuốc nhuộm khuyếch tán qua gel và tập trung tại nơi có DNA xen vào giữa hai sợi DNA xoắn kép. Gel đã nhuộm này được xem dưới tia tử ngoại. phức DNA/ethidium bromit hấp thụ tia tử ngoại ở 300nm, còn lại một ít năng lượng và phát ra dưới dạng tia sáng thấy được 590nm. dưới tia tử ngoại, các đoạn DNA hiện ra có huỳnh quang màu cam trên gel. điều này quan trọng nhất để hiểu rằng dải DNA thấy trên gel không phải là phân tử DNA sợi đơn. Hơn nữa, đây là nơi tập trung của hàng triệu phân tử DNA có cùng độ dài nucleotide như nhau. Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel, người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử”. đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DNA – DNA ladder), thông thường người ta sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể
được thuỷ giải bởi enzym giới hạn HindIII. 4. Ứng dụng kĩ thuật điên di: Điện di thuốc trị liệu Tác dụng: chữa bệnh vào cơ thể hoặc lấy các ion thuốc có hại ra khỏi cơ thể. Ví dụ: Muốn lấy một ion có hại (Ca++) ra khỏi cơ thể thì ta đặt điện cực trái dấu vào vùng da nhiễm ion, điện cực đó sẽ hút các ion này ra khỏi cơ thể về phía nó. Tác dụng của dòng điện một chiều: Tác dụng giãn mạch: Làm tăng cường tuần hoàn và dinh dưỡng, tăng chuyển hoá, chống viêm. Tác dụng lên hệ thần kinh: Tại cực dương có tác dụng giảm đau, giảm co thắt, giảm trương lực cơ. Tại cực âm: Có tác dụng kích thích, làm tăng trương lực cơ Tác dụng của ion thuốc: Không gây tổn thương da, không gây đau, không gây lây truyền các bệnh đường máu như khi tiêm. Điện di protein Tác dụng: Giúp phát hiện nhanh những tính chất nổi bậc của lúa như mùi thơm, protein, amylose… Giúp các nhà chọn giống thực hiện công tác chọn lọc, tạo giống lúa thuần, giống lúa mới một cách nhanh nhất, rẻ tiền và hiệu quả cao. chọn ra được dòng Nếp Bè 1-2 có chiều dài hạt dài hơn giống đối chứng, năng suất cao hơn 15% và hàm lượng protein trên 10%. Ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong kĩ thuật nhuộm, thuộc da, tạo màu, hoá dầu, mĩ phẩm, sơn,… Tài Liệu Tham khảo: Di Truyền Học Phân Tử-Phan Cự Nhân-trang 105-107 Cơ Sở khoa Học Công Nghệ Chuyển Gel Ở Thực Vật-Viện khoa Học Kĩ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam – trang 46-47. Cơ Sở Di Truyền Và Công Nghệ Gel-Nhà Xuất Bản Khoa Học Và Kĩ Thuật- TS.Trần Thị Xô, THS. Nguyễn Thị Lan – trang 171-172. Công Nghệ Gen – Nhà Xuất Bản Khoa Học Kĩ Thuật-GS.TSKH. Đái Duy Lan –trang 121-123. Lê Đình Lương - Từ Điển Sinh Học – Nhà Xuất Bản Khoa Học Và Kĩ Thuật –trang 97. Google.Com.vn