Đề tài Động học enzym đồng thể

Lời Mở đầu Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, các chế phẩm enzym được sản xuất và ứng dụng ngày càng nhiều ở hầu hết các lĩnh vực như trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y tế… Enzym đã và đang từng bước thay đổi và nâng cao các quá trình công nghệ. Việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm enzym có ý nghĩa rất lớn, phạm vi nghiên cứu nhằm đẩy nhanh các quá trình sinh hóa trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh kẹo, trong sản xuất bia rượu nước giải khát và sản xuất đồ hộp. Ngoài ra, nó còn được ứng dụng rộng rãi trong việc chuẩn đoán và điều trị bệnh, trong công nghiệp dệt nhuộm, thuộc da, sản xuất giấy và trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc. Sự phát triển các phương pháp sử dụng các chế phẩm enzym trong các ngành khác nhau của nền kinh tế quốc dân đòi hỏi phải hoàn thiện và cải tiến hơn nữa trong công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym. Do đó, việc đi sâu nghiên cứu sản xuất các chế phẩm enzym, tìm hiểu các thông số tối ưu cho các phản ứng enzym chính là nghiên cứu động học Enzyme bao gồm: động học Enzyme đồng thể, dị thể và Enzyme tái tổ hợp. Vì thời gian nghiên cứu có hạn không đi sâu được tất cả các lĩnh vực nên trong tiểu luận này em xin chọn nghiên cứu một vấn đề đó là“Động học enzym đồng thể”, bao gồm những nội dung chính như sau: Phần I : Tổng quan về động học enzyme đồng thể Phần II:Tìm hiểu động học enzyme Cellobiose phosphorylase từ Clostridium thermocellum Phần I –Tổng quan Động học phản ứng enzym đồng thể I.1 các khái niệm Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hoà tan trong nước và trongdung dịch muối loãng. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20 000 đến 100 000 dalton nên không qua được màng bán thấm. Động học Enzyme là quá trình nghiên cứu vận tốc của phản ứng hoá học do enzyme xúc tác. Qua đó ta biết được bản chất, cơ chế của quá trình xảy ra phản ứng đó và được thể hiện bằng các thông số: vpư, Km, Ki...Thông qua đó để điều khiển các yếu tố ảnh hưởng tới vận tốc phản ứng ngoài cơ thể cũng như trong cơ thể bằng cách bổ sung Enzyme hoặc giảm cơ chất. Vận tốc phản ứng enzyme được biểu diễnbằng lượng cơ chất bịchuyển hoá hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một đơn vị thời gian. Động học Enzyme đồng thể là quá trình phản ứng enzyme chỉ xảy ra trong một pha đồng nhất. I.2 Thứ bậc của phản ứng Khái niệm: Bậc phản ứng là tổng số mũ các nồng độ trong phương trình động học. I.2.1 Phản ứng bậc nhất Một phản ứng bậc nhất thường tương ứng với sự chuyển đổi chỉ một cơ chất thành sản phẩm . S - hàm số mũ của thời gian :[s]= [S0]exp(-kt) k- hằng số vận tốc Lấy logarit ta được phương trình ở dạng tuyến tính Ta thấy, vận tốc của phản ứng ở thời điểm t được xác định bằng các phân tử p tạo thành (hoặc số các phân tử cơ chất bị mất đi) trong một đơn vị thời gian: Nếu nồng độ được biểu diễn bằng mol/lit hoặc M và thời gian được biểu diễn bằng giây (s) thì v được biểu diễn bằng M .s-1 và k được biểu diễn bằng s-1 Ta thấy vận tốc v của phản ứng sẽ giảm theo thời gian và sẽ tiến đến 0 khi t tăng. Hằng số vận tốc chỉ phụ thuộc vào một cơ chất và nồng độ của cơ chất này liên tục bị giảm. Trong thực tế, nếu nồng độ cơ chất rất cao, thì có thể coi như là không đổi trong quá trình phản ứng, khi phản ứng được xem xét trong khoảng thời gian ngắn. Trong điều kiện này vận tốc phản ứng là không đổi, lượng sản phẩm tạo ra chỉ phụ thuộc vào thời gian phản ứng có thứ bậc không. I.2.2 Phản ứng bậc hai Là một phản ứng có hai cơ chất phản ứng với nhau để cho một (hoặc nhiều) sản phẩm : Vận tốc của phản ứng có thể v: ở đây, ta thấy tỉ lệ với một sản phẩm hai nồng độ. Vận tốc luôn được biểu diễn bằng , còn hằng số vận tốc được biểu diễn bằng Nếu một trong hai cơ chất chẳng hạn A rất lớn so với B thì nồng độ [A] thực tế coi như không đổi và bằng nồng độ ban đầu [A]0 trong thời gian phản ứng và có thể viết : Trong đó Điều này có nghĩa là một phản ứng bậc 2 có thể xem như một phản ứng bậc 1 nếu một trong hai cơ chất có nồng độ rất lớn. Chẳng hạn phản ứng thuỷ phân một cơ chất : A - B +HOH AH +BOH ở đây phản ứng là bậc nhất đối với nồng độ [A-B] vì nước là rất lớn. Và dù thứ bậc của phản ứng thế nào, thì là một hàm nghịch biến của thời gian vì lẽ các nồng độ cơ chất giảm trong khi nồng độ sản phẩm lại tăng. Vậy v là một tham số biến đổi mà người ta chỉ có thể đo trong những điều kiện đặc biệt, là điều kiện có v không đổi .Các điều kiện này được gọi là điều kiện ban đầu và vận tốc được gọi là vận tốc đầu. Vậy khi nồng độ của cơ chất thấp phản ứng xảy ra có thứ bậc 1: Còn khi nồng độ cơ chất khá cao thì phản ứng có bậc không Nồng độ cơ chất[S] Vận tốc V Bậc không: Bậc nhất: Tất cả các Enzym đều ở trong ES Bậc 0 x t 0 Đồthị: Bậc 2 t 0 Bậc 1 x t 0 Hình1: ảnh hưởng nồng độ cơ chất tới thứ bậc phản ứng Enzym: x- lượng cơ chất bị chuyển hóa trong thời gian t I.3 Động học của enzym monome có một cơ chất I.3.1 Mô hình Michaelis Sự xúc tác của enzym thường được thực hiện bằng cách cấu tạo ra ít nhất một phức hợp tạm thời giữa enzym và cơ chất. Mô hình đơn giản nhất là mô hình của Michaelis .Mô hình này thừa nhận rằng phản ứng chỉ xảy ra với một cơ chất và tao thành chỉ một sản phẩm : a) Các pha của phản ứng enzym Khi enzym và cơ chất của nó có mặt dưới dạng dung dich thì phức ES được tạo thành một cách nhanh chóng và tăng theo thời gian , đặc biệt là khi S có nồng độ rất lớn. Người ta nói là phản ứng ở trạng thái tiền dừng (prestationaryphase). Thường pha này chỉ kéo dài trong khoảng thời gian vài phần ngàn giây. Khi pha này kết thúc thì phản ứng bắt đầu vào trạng thái dừng (stationaryphase). ở trạng thái dừng, cơ chất vẫn bão hoà enzym, phức hợp ES có nồng độ cực đại và ổn định. Lượng sản phẩm tạo ra tăng lên một cách tuyến tính. Người ta nói phản ứng đang ở trong điều kiện ban đầu. Vận tốc phản ứng lúc này không đổi và phản ứng có thứ bậc không. Vận tốc phản ứng lúc này không đổi và phản ứng có thứ bậc không. Vận tốc lúc này được gọi là vận đầu và đặc trưng cho trạng thái dừng. Đôi khi người ta cũng gọi là vận tốc dừng vì nó vẫn giữ không đổi chừng nào nồng độ S còn bão hoà enzym. Điều kiện ban đầu thường có thời gian phản ứng ngắn(một vài phút và có thể tới hàng chục phút ) và lượng cơ chất được tạo thành sản phẩm còn rất ít (do dó có thể bỏ qua phản ứng nghịch). Tiền dừng (S)o t1 t2 Pha dừng Pha sau dừng Thời gian Nồng độ (S)t (ES) (S) (P) (P) (E) d(ES)/dt = 0 0 Sau thời một thời gian dài hay ngắn phụ thuộc vào enzym (thường từ vài phút đến một giờ), lượng cơ chất bị cạn kiệt và nồng độ phức ES cũng giảm dần theo. Vận tốc phản ứng giảm và cuối cùng triệt tiêu hoàn toàn. Phản ứng ở trạng thái sau dừng (post-stationry state). Dựa vào cơ chế phản ứng có thể chia chản ứng enzym ra làm hai giai đoạn Hình 2. Các pha của phản ứng enzym một cơ chất b) Hai giai đoạn của phản ứng enzym Trong những điều kiện ban đầu, nồng độ của cơ chất rất lớn so với nồng độ enzym. [S]0>>[E]0, ta có thể mô tả quá trình enzym qua hai giai đoạn kế tiếp nhau. *Giai đoạn đầu: Phức hợp enzym – cơ chất được tạo thành một cách nhanh chóng và thuận nghịch nhờ các tương tác phi đồng hoá trị giữa cơ chất và các axit amin nhận biết của tâm hoạt động của enzym: Sự kết hợp giữa E và S là một phản ứng bậc 2 nên hằng số kết hợp k1 được đo bằng (M-1.s-1), còn sự phân ly phức ES là phản ứng bậc 1 nên k-1 được đo bằng s-1. Thường tỉ số là khá cao và được gọi là hằng số ái lực kal của enzym đối với cơ chất: *Giai đoạn 2: hoặc giai đoạn xúc tác gồm một chuỗi các phản ứng trung gian nhằm biến đổi phức ES thành trạng thái quá độ trong đó cơ chất được liên kết với các gốc axit amin xúc tác của tâm hoạt động enzym (thường bằng liên kết đồng hoá trị). Rồi trạng thái quá độ này sẽ tự chuyển hoá thành phức enzym – sản phẩm và cuối cùng phức enzym – sản phẩm sẽ phân ly thành enzym tự do và sản phẩm: Vậy, toàn bộ chuỗi sự kiện này có liên quan với các axit amin xúc tác và vận tốc chung (tổng) của quá trình này thường được đặc trưng bởi hằng số xúc tác . Vì phản ứng tổng là phản ứng bậc nhất đối với phức ES do đó kcat được biểu thị bằng s-1. Và quá trình enzym tổng thể có thể viết: (3.2) Thường thì giai đoạn xúc tác chậm so với giai đoạn tạo ra phức ES do đó hằng số xúc tác kcắt nhỏ hơn hằng số kết hợp k1. Vận tốc đầu: Theo (3.2), vận tốcđầu có thể viết: Vì trong pha đầu, sự hình thành mỗi mol P đều tương ứng với sự chuyển hoá một mol [ES]. Do đó việc tính v0 có liên quan với việc tính nồng độ [ES]. I.3.2 Giả thuyết của Brigg và Haldane Để tính toán nồng độ này, Brigg và Haldane đã đề ra giả thuyết về trạng thái gần dừng (quasi stationnaire) hoặc dừng bề ngoài (biểu kiến). Họ coi rằng nồng độ [ES] là không đổi trong giai đoạn đầu, có nghĩa là vận tốc đầu tạo thành ES (va) bằng vận tốc phân giải phức ES (vd): Vậy phương trình trạng thái ở trạng thái dừng có thể viết: hay với (3.3) Km được gọi là hằng số Michaelis-Menten. Km được đo bằng nồng độ mol M. I.3.3 Phương trình Michaelis – Menten Enzym là một chất xúc tác nên trong quá trình phản ứng số lượng enzym tổng khộng thay đổi, có nghĩa : Thay [E] bằng vào phương trình Brigg Haldane (3.3), ta được hay Vậy (3.4) Phương trình này gọi là phương trình Michaelis Manten. Nếu tất cả phân tử enzym đều ở trong phức với cơ chất thì nồng độ [ES] bằng nồng độ tổng của enzym [E]0. Vận tốc đầu của phản ứng sẽ đạt đến giá trị cao nhất của nó: vận tốc cực đại: Phương trình Michealis- Menten (3.4) có thể viết: (3.5) Vậy vận tốc cực đại sẽ đạt được nếu nồng độ cơ chất là rất lớn so với nồng độ enzym. Hằng số Km có thể xác định như là giá trị của của nồng độ cơ chất mà tại đó vận tốc đầu bằng một nửa vận tốc cực đại. Hằng số Km cũng liên quan với ái lực của enzym đối với cơ chất: ở trên, ta đã thấy hằng số kcắt là rất nhỏ so với k1 nên có thể coi , có nghĩa là Km bằng nghịch đảo của hằng số ái lực. Vậy, việc đo hằng số Km là cách tốt nhất để đánh giá ái lực của một enzym với cơ chất đã cho. Thường hiệu quả xúc tác của enzym được đánh giá qua hằng số đặc hiệu kA k1 là giới hạn trên của tỷ số này và tỷ số này sẽ đạt đến giới hạn trên nếu k-1 là bé so với kcắt. k1 lại bị giới hạn bởi vận tốc khuếch tán của enzym và cơ chất đến với nhau nên không thể vượt qua giá trị tối đa của vận tốc khuếch tán này, thường vào khoảng 108- 109M-1.s-1. Với một enzym cắt có k-1 và kcất =103s-1, k1 = 109 M-1.s-1 ta sẽ có giá trị như sau: vậy I.3.4 Tính thuận nghịch và hệ thức Haldane ở chừng mực nào đó, các phản ứng enzym đều có tính thuận nghịch, có nghĩa là các enzym có thể xúc tác cả phản ứng ngược: Ta có thể viết: với Vận tốc cực đại của phản ứng Vmax Vận tốc cực đại của phản ứng nghịch V’max Ta có thể suy ra: và Từ đây ta có hệ thức Haldane: Kcb: là hằng số cân bằng cảu phản ứng tổng. Hệ thức này chỉ rõ sự phụ thuộc lẫn nhau giữa hằng số cân bằng và các tham số động học của một phản ứng enzym thuận nghịch do đó không thể bỏ qua phản ứng nghịch khi sản phẩm đã được tích tụ. Chú ý: Hằng số kcắt là tổng hợp nhiều giai đoạn liên tiếp chuyển hóa phức Michaelis- Menten đến trạng thái quá độ, rồi từ trạng thái quá độ này đến phức “enzym –sản phẩm” và cuối cùng phân ly phức này đến enzym tự do và sản phẩm: Do đó, giá trị của hằng só kcắt phụ thuộc vào giá trị của hằng số tương ứng với giai đoạn chậm nhất tức là giai đoạn giới hạn. Phải luôn nhớ rằng phương trình Brigg-Haldane và phương trình Michaelis-Menten chỉ có giá trị khi được đặt trong những điều kiện ban đầu đã xác định trước. Ngoài ra, cũng cần chú ý rằng trong các phương trình ở trên người ta luôn coi nồng độ cơ chất tự do [S] bằng với nồng độ cơ chất [S]0 lúc khởi đầu. Và trong điều kiện ban đầu này thì nồng độ sản phẩm được tạo ra còn rất bé so với nồng độ cơ chất. Khi nồng độ sản phẩm đạt đến mức có ý nghĩa thì các phương trình này sẽ không áp dụng nữa. I.4 Động học của các enzym monome nhiều cơ chất I.4.1 Động học của các enzym monome hai cơ chất Trong thực tế, ít có phản ứng enzym một cơ chất. Phần lớn các phản ứng enzym có hai hoặc nhiều cơ chất và tạo ra hai hoặc nhiều sản phẩm. Một số lớn enzym thường gặp có hai cơ chất. Phản ứng tổng của các enzym có hai cơ chất và hai sản phẩm thường có dạng như sau: Trong cơ chế của phản ứng giữa enzym và cơ chất thường tạo ra nhiều kiểu tổ hợp khác nhau: Tổ hợp hai (binary): EA, EB, EP, EQ. Tổ hợp ba (Ternary): EAB, EAQ, EBP. Cleland (1963) đã biểu diễn các cơ chế của phản ứng enzym hai cơ chất như sơ đồ dưới đây, trong đó: A, B, C… là các cơ chất theo thứ tự kết gắn. P, Q, R… là các sản phẩm theo thứ tự xuất hiện. E là enzym tự do ban đầu. F, G… là các dạng tạm thời của enzym trong quá trình phản ứng. Uni, bi, ter… là những tiếp đầu ngữ để chỉ số cơ chất và số sản phẩm trong phản ứng. Trong thực tế, ít gặp những cơ chế enzym vượt quá ba cơ chất và hai sản phẩm (Bi Bi). A B P Q E EA EAB EPQ EQ E I.4.1.1 Phản ứng Bi Bi có trật tự Trong mô hình này, một cơ chất A bắt buộc phải gắn vào E ở giai đoạn đầu tiên. Cơ chất B chỉ có thể được gắn thứ hai để tạo ra tổ hợp kép ba EAB. Phần tiếp theo của phản ứng sẽ dẫn đến giải phóng P (từ B) rồi sản phẩm Q (từ A). Một phản ứng có tính chất cổ điển của cơ chế này là enzym malat dehydrogenase: (A) (B) (P) (Q) Vận tốc của phản ứng tổng có dạng: hay vẽ đồ thị với A không đổi ta được một đường thẳng. Với các giá trị nồng độ [A] khác nhau ta được một chùm các đường thẳng đồng quy ở một điểm. Tương tự ta cũng làm như thế với cơ chất B; cố định nồng độ [B], vẽ đồ thị với các nồng độ [B] khác nhau ta cũng được một chùm các đường thẳng. Từ đó ta xác định được các tham số đặc trưng. Độ nghiêng tăng Độ nghiêng tăng Hình 3. Động học enzym hai cơ chất – cơ chế Bi Bi có trật tự I.4.1.2 Phản ứng kiểu Bi Bi bấp bênh A B P Q EA B A E AEB EB EQ Q P APQ E EP Trong trường hợp này, hai cơ chất A và B có một ái lực riêng đối với enzym. Chúng tự kết gắn với enzym một cách ngẫu nhiên để tạo ra tổ hợp kép đôi EA hoặc EB và cuối cùng thì tạo ra tổ hợp kép ba EAB. Các sản phẩm của phản ứng P và Q cũng được giải phóng ra theo một trật tự bấp bênh. Các enzym phosphatranferaes có động học theo cơ chế bấp bênh này. Ví dụ đối với enzym creatin phosphokinase xúc tác phản ứng: Phương trình vận tốc có dạng: hay Vẽ đường biễu diễn với [A] cố định, sẽ thu được một đường thẳng. Với các giá trị nồng độ [A] cố định khác nhau, sẽ thu được một chùm đường thẳng cho phép xác định được kB. Tương tự, vẽ đường biễu diễn với [B] cố định cho phép chúng ta xác định được kA Hệ số góc tăng Hình 4. Động học enzym hai cơ chất – cơ chế bấp bênh I.4.1.3 Phản ứng kiểu Bi Bi Ping-pong A P B Q E EA FP F FB EQ E Cơ chế này khá đơn giản: cơ chất thứ nhất kết gắn với enzym để tạo ra sản phẩm đầu tiên; rồi cơ chất thứ hai sẽ gắn vào và tạo ra sản phẩm thứ hai. Vì có sự trao đổi giữa hai cơ chất, nên hiển nhiên là cơ chất thứ nhất đã phải để lại ở tâm hoạt động của enzym một hay nhiều nguyên tử . Các nguyên tử này sau đó sẽ đến kết gắn với cơ chất thứ hai. A B P Q Trong mô hình này, A và B , cả hai đều có ái lực với enzym. Các transaminase có nhóm ngoại là phosphat pyridoxal thường theo cơ chế này, trogn đó nhóm NH2 đóng vai trò như quả bóng bàn(ping- pong) (ở các enzym này, nhóm ngoại được liên kết chặt chẽ với apoenym và được coi như là một phần toàn vẹn của enzym). Ví dụ trong phản ứng thuận nghịch sau đây được xúc tác bởi enzym transaminase: Thực tế, phản ứng xảy ra lần lượt như sau: Kết gắn cơ chất thứ nhất: axit aspartic Tách nhóm amin đ đến kết gắn với nhóm phosphat pyridoxalđ tạo thnàh phospat pyridoxamin. Giải phóng ra sản phẩm thứ nhất : axit oxalacetic Kết gắn cơ chất thứ hai: axit a-xetoglutaric. Chuyển nhóm amin từ phosphat pyridoxamin (chất này lại trở về dạng phosphat pyridoxal) đến axit a-xetoglutaricđ tạo ra axit glutamic Giải phóng sản phẩm thứ hai axit glutamic. Phương trình vận tốc của phản ứng có dạng: tăng [A1] [A2] [A3] Hệ số góc Hệ số góc [B1] [B2] [B3] tăng đ Hình5. Động học enzym hai cơ chất – cơ chế ping- pong A B P Q E EA EQ E I.4.1.4 Phản ứng kiểu Theorell-Chance Trong một số phản ứng kiểu Bi Bi có trật tự, phức kép ba EAB có nồng độ rất thấpvà có đời sống rất ngắn. Nguyên nhân là do hằng số phân ly của cơ chất thứ hai B và sản phẩm P rất cao so với cơ chất A và sản phẩm Q. Các enzym alcoldehydrogenase và lactatdehydrogenase vận hành với NAD theo cơ chế này. Các coenzym được sử dụng vừa như cơ chất thứ hai và sản phẩm thứ hai. Alcol + NAD+ aldehyt tương ứng + NADH +H+ Lactat + NAD+ pyruvat +NADH + H+ Trong mô hình này, sự biểu diễn động học cũng tương tự như ở cơ chế Bi Bi có trật tự, chỉ khác ở mối tương quan giữa các sản phẩm và cơ chất (ở đây Q là chất kìm hãm của A và P là chất kìm hãm của B, điều này làm cho nó giống cơ chế Ping pong hơn). I.4.2 Động học của các enzym monome nhiều hơn hai cơ chất Nguyên lý chung của các phản ứng nhiều hơn hai cơ chất bao gồm ba hoặc bốn cơ chất cùng tham gia phản ứng. Và được miêu tả theo ba nguyên lý Bi Bi chính. Tuy nhiên trong đó có sự kết hợp của các kiểu Bi Bi khác nhau. Ví dụ như sự kết hợp của kiểu phản ứng Bi Bi có trật tự và Bi Bi bấp bênh. I.4.2.1 Phản ứng Bi Bi ter-ter có trật tự A B C P Q R E EA EAB EABC EQR ER E EPQR Vận tốc phản ứng được xác định theo biểu thức sau: Mỗi sản phẩm đều do hai cơ chất tạo thành, mỗi cơ chất đó tưng ứng với nồng độ khác nhau cố định. Cơ chất thứ ba hầu như không thay đổi nồng độ trong suốt quá trình. I.4.2.2 Phản ứng Bi Bi hexa-uni-ping pong Trong kiểu phản ứng này cả ba cơ chất đều kết hợp tại ba trung tâm kết hợp theo sơ đồ sau: A P B Q C R E EA F EB G GC E FP GQ ER Tốc độ phản ứng của kiểu phản ứng này như sau: I.4.2.3 Kiểu phản ứng Bi Bi four Ping pong A B P C Q R E EA EAB F FC ER E FP EQR Vận tốc phản ứng được xác định theo biểu thức: I.5 phương pháp xác định bằng thực nghiệm các tham số động học. Phươngpháp xác định thông số động học gồm 2 cách cơ bản: - Phương pháp tính trung bình cộng - Phương pháp đồ thị I5.1 Phương pháp đồ thị của Linewearver và Burk Phương trình có dạng đường thẳng ở đây độ nghiêng ; * Với đ (điểm A) * Với đ (điểm B) B A Vmaxạ 0 I.5.2 Phương pháp đồ thị Eadie-Hofstee đ Û ; . I.5.3 Phương pháp đồ thị Eadie- Scatchart I.5.4 Phương pháp đồ thị Woolf-Hofstee (nhân hai vế của phương trình Lineweawer- Burk với tích (Vmax.v) Vmax v Vmax I.5.5 Phương pháp đồ thị Michealis- Menten Nếu [S] >> [E0] Vận tốc phản ứng được tính: , Vẽ đồ thị: I.6 ảnh hưởng của các tác nhân vật lý đến động học của các phản ứng Enzyme I.6.1 ảnh hưởng của nhiệt độ Tác động của nhiệt độ đến hoạt độ của Enzyme là kết quả của hai hiện tượng: Nhiệt làm hoạt hoá các phản ứng hoá học Nhiệt làm biến tính protein và làm vô hoạt hoá Enzyme a. Hoạt hoá các phản ứng hoá học bởi nhiệt Vận tốc của các phản enzyme cũng như tất cả các phản ứng hoá học đều bị ảnh hưởng do sự tăng lên của nhiệt độ, theo hẹ thức Arrhenius: Trong đó, k : hằng số vận tốc của phản ứng Ea: năng lượng hoạt hoá của phản ứng ( được đo bằng kJ.mol-1) s: hằng số R: hằng số khí lý tưởng, R = 1.987cal/mol.độ T: nhiệt độ tuyệt đối Hệ thức này cho thấy vậ tốc của một phản ứng hoá học tăng cùng với sự tăng nhiệt độ ( tăng nhiệt độ lên 10 độthì vận tốc của phản ứng tăng lên 2 lần). Với phản ứng Enzyme thì sự tăng này lớn hơn nhưng không phải là vô hạn, thường chỉ trong một vùng nhiệt độ nào đó. Nói chung, nhiệt độ làm biến tính enzyme là từ 450 đến 500. Một số enzyme bề nhiệt thì có thể hoạt động ở nhiệt độ cao hơn nhiều( đến 1000C). b. Biến tính và vô hoạt các enzyme bằng nhiệt Khi nhiệt độ tăng, các nguyên tử của phân tử enzyme tu được một năng lượng lớn hơn nên có x hướng chuyển động nhanh hơn. Năng lượng mà chúng thu đợc có thể đủ thắng các tương tác yếu vốn quyết định cấu trúc của các protein hình cầu, dẫn đến ột sự biến đổi hình thể protein và do đó là giảm hoạt tính của enzyme. Phản ứng vô hoạt một enzyme bởi nhiệt thường có động học bậc một: [E] =[E0].e-kt ln Trong đó: K là hằng số vận tốc của phản ứng [E]-Là nồng độ của Enzyme hoạt động ở thời điểm t ` [E0]-Nồng độ ban đầu của Enzyme hoạt động I.6.2 ảnh hưởng của pH Tất cả các Enzyme đều nhậy cảm với sự thay đổi của pH của môi trường. Có một vùng pH mà hoạt độ của Enzyme là cực đại.Vùng pH này là kết quả của nhiều tham số: Nhiệt độ, lưc Ion, nồng độ cơ chất ... Enzyme là protein do các axit amin trùng ngưng với nhau tạo nên. Trong số các gốc axit amin của phân tử enzyme có các nhóm Ion hoá được, một số gốc tham gia vào liên kết và định vị cơ chất, một số khác tham gia vào phản ứng, còn đa phần gốc được dùng để duy trì hình thể của enzyme. Các gốc này cũng như cơ chất trong nhiều trường hợp, rất nhậy vơi pH và thường có các trạng thái Ion hoá khác nhau phụ thuộc vào giá trị của pH. Ta có thể dễ dàng hiểu được khi một nhóm –COO- của tâm hoạt động vốn cần thiết cho sự kết gắn cơ chất, nếu giảm pH của môi trường dẫn đến biến thành nhóm COOH thì nó sẽ không kết gắn được cơ chất nữa và enzyme bị mất hoạt tính. I.6.3 ảnh hưởng của các tác nhân hoá học tới phản ứng enzyme A.1 Chất hoạt hoá Chất hoạt hoá có bản chất hoá hoc rất khác nhau. Có thể phân ra những loại như sau: Chất hoạt hoá thực: các ion kim loại Chất chống kìm hãm: ion xianua (CN-) Có thể làm mất tác động lìm hãm của muối đồng đến enzyme urease Chất tác nhân bảo vệ: như cystein có tác dụng bảo vệ các nhóm thiol của tâm hoạt động nhiều enzyme. Chất hoạt hoá tiền enzyme: như enterokinase của dịch ruột có khả năng chuyển tripsinogen không hoạt thành tripsin hoạt động. Hoạt hoá bởi các ion kim loại Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc với các nguyên tử nitơ... của các nhóm cacboxyl,imidazol, amin hoặc peptit của các coenzyme hoặc của các apoenzyme. Một số các ion nầy như coban trongcác enzyme có vitamin B12, hoặc sắt trong các enzyme có coenzyme hematinic... là những phần toàn vẹn của cấu trúc coenzyme mà chưa hẳn là những ion hoạt hoá. Các ion này thường àm cho tâm hoạt động của enzyme có một độ bề rất lớn do sự ảnh hưởng các liên kết của mình theo một hìn học hoàn toàn xác định. Một sự hoạt hoá thực sự ởi các ionkim loại thường xuất hiện khi ionphânly được khỏi enzyme, nhưng ngược lại nó lại rất cần thiết hoặc tạo điều kiện rất thuận lợi cho sự tiến hành xúc tác của enzym. Ion kim loại có thể góp phần tạo ra mộthình thể thuận lợi cho enzyme hoặc làm dễ dàng cho enzyme kết gắn được cơ chất hoặc đơn giản là tham gia trực tiếp vào xúc tác như trong nhiều phản ứng oxy – hoá khử. Trong những trường hợp này,ion kim loại đóng vai trò như một cơ chất thứ hai. Vì thế phương trình phản ứng gần giống với các phương trình biểu diễn hệ hai cơ chất kiểu bibi bấp bênh hoặc thường gặp hơnlà kiểu bibi có trật tự. Nhiều enzyme được hoạt oá bởi các ion kim loại. Kinase đều được hoạt hoá bởi Mg2, các lipase, tripsin và chimotrypsin được hoạt hoá bởi Ca2+, pyruvatdecacboxylase hoạt hoá bởi Mn2+, còn alcoldehydrogenase được hoạt hoá bởi Zn2+. A.2 Chất kìm hãm Có ba kiểu chất kìm hãm: a, Chất kìm hãm cạnh tranh ( competitive inhibitor) Kìm hãm cạnh tranh tuệt đối ( toàn phần – absolute competitive inhibitor) Cơ chất và chất kìm hãm kết gắn với enzyme tại cùng một địa điểm ( một tâm) và tạo ra các phức ES và EI. Chỉ có phức ES là hoạt động và cho sản phảm. Nồng độ chất kìm hãm là rất nhỏ so với nồng độ enzym [E] >> [I]. Phương trình vận tốc: hay Ki - hằng số phân ly của phức enzyme – chất kìm hãm Không có kìm hãm ư [I] tăng Hình A.2.1 – Kìm hãm cạnh tranh Hằng số Michaelis ( Km) được nhân lên một hệ số được gọi là hệ số kìm hãm Fi có nghĩa là sự phân ly của phức ES sẽ được dễ dàng tức là ái lực của E với S sẽ bị giảm đi. Sự kìm hãm có thể bị mất đi khi thừa cơ chất : Khi tăng nồng độ S, theo định luật tác dụng khối lượng, Ssẽ di chuyển I ra khỏi tâm xúc tác mà nó đang chiếm. Chất kìm hãm cạnh tranh bộ phận. Cơ chất và chất kìm hãm gắn với enzyme tại hai vùng ( tâm) khác nhau và tạo ra các phức ES, EI, và EIS. Cơ chất có ái lực với enzyme tự do mạnh hơn với enzyme của phức EI Chất kìm hãm có ái lực với enzyme tự do mạnh hơn với phức ES. Các phức ES và EIS đều hoạt động vàcho sản phẩm với cùng một hằng số vận tốc. Nồng độ chất kìm hãm là rất nhỏ so với nồng độ enzyme. Phương trình vận tốc: b, Chất kìm hãm không cạnh tranh (non – competitive inhibitor) Chất kìm hãm không cạnh tranh tuyệt đối ( absolute non – competitive inhibitor) Cơ chất và kìm hãm kết gắn với enyme tại hai tâm khác nhau và tạo ra những phức ES, EI, EIS. Cơ chất có cùng ái lực với enzyme tự do cũng như với phức EI Chất kìm hãm có cùng ái lực với enzyme tự do cũng như với phức ES Chỉ có phức ES là hoạt động. Nồng độ của chất kìm hãm là rất nhỏ so với nồng độ enzyme [E]>> [I] Phương trình vận tốc: ; Chất kìm hã không làm thay đổi ái lưc của cơ chất với enzyme. Khi có chất kìm hãm nà