Đề tài DNA Marker

DNA MARKER °¨¨°º°¨¨° Nhóm thực hiện: Trần Như Khoa Nguyễn Duy Lan Nguyễn Thị Bích Liễu Lê Hoàng Lâm Nguyễn Thị Kim Ngân Đặng Thị Ái Trinh Nội dung Khái niệm DNA marker. Các kỹ thuật: Kỹ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism). Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism). Kỹ thuật RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA). Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat). DNA MARKER Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể được xem như một DNA marker. Các DNA marker có thể chia thành hai nhóm:-Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP, minisatellite. -Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD. Dựa trên kiểu hình có thể phân loại DNA marker thành 2 loại: -Marker đồng trội: là những marker có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử, đó là các marker allozyme, microsatellite, PCR nhân RFLP. Trong trường hợp này tần số alen có thể được tính trực tiếp từ dữ liệu kiểu gen. -Marker trội: RAPD marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Marker  Tên đầy đủ   RFLP  Restriction fragment length polymorphism   ALP  Amplicon length polymorphism   AFLP  Amplified freagment lenth polymorphism   RAPD  Random Amplification Polymorphic DNA   DAF  DNA amplification fingerprinting   SSR  Single sequence repeat (microsatellite)   AP-PCR  Arbitrary primer-PCR   SSCP  Single strand conformation polymorphism   MRDHV-DNA  Moderately repeated, dispersed and highly variable DNA (minisatellite)   Restriction fragment length polymorphism (RFLP) Định nghĩa: Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length Polymorphism) RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác. Nguyên tắc Dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.

 T-RFLP method Ưu và nhược điểm Ưu điểm : Là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Hạn chế: Do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu). DNA yêu cầu có chất lượng cao. Ứng dụng 1.Xác định thông tin di truyền: Schematic for RFLP by cleavage site loss.
2.Phân tích cấu trúc di truyền DNA ứng dụng trong Y pháp nhận dạng : Từ những năm 30s dấu vân tay được đưa vào ứng dụng trong Y Pháp (Forensics) và trở thành một công cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm của cảnh sát hình sự và thám tử để nhận dạng. Tuy nhiên dấu vân tay bộc lộ nhiều khiếm khuyết một khi áp dụng trong thực tế. Chẳng hạn, dấu vân tay thông thường chỉ có thể lấy mẫu được từ các đầu ngón tay mà thôi. Đã thế ngày nay nó không còn đặc hiệu cho từng cá thể nữa từ khi phẫu thuật chỉnh hình phát triển mạnh, người ta có thể chủ định thay đổi dấu vân tay qua phẫu thuật. Chỉ trong vòng trên dưới 50 năm từ khi cấu trúc chuỗi di truyền DNA được Watson và Crick công bố [1], ngành sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi. Một trong những ứng dụng quan trọng của sinh học phân tử là sử dụng đặc tính của cấu trúc chuỗi di truyền DNA của từng cá thể vào trong Y pháp để nhận dạng đối tượng coi như là một cuộc cách mạng trong Y học hình sự của nhân loại. Tương tự như dấu vân tay, mỗi một con người đều có một đặc trưng riêng về cấu trúc di truyền của mình, được xác định bằng chuỗi di truyền DNA. Cấu trúc của DNA [1], và"điểm chỉ" DNA: Đặc tính của tất cả các sinh vật, kể cả con người, đều được cấu tạo từ đơn vị căn bản nhất là tế bào, từ nguyên thuỷ là hợp tử được thụ tinh bởi trứng và tinh trùng. Về phương diện sinh học phân tử, mỗi tế bào của cơ thể (trừ hồng cầu) đều có nhân, trong nhân chứa các chất liệu di truyền, nhiễm sắc thể (chromosome) quyết định cấu trúc đặc tính cho mỗi cá thể. Con  người có 23 bộ nhiễm sắc thể (22 đôi thường và một đôi xác định giới tính). Các nhiễm sắc thể này được tạo bởi các chuỗi chất liệu chứa đựng thông tin di truyền DNA (viết tắt của từ DeoxyriboNucleic Acid) thừa kế từ cha và mẹ. Mỗi cá thể sống nhận chất liệu DNA 50% từ cha và 50% từ mẹ.  Có thể hình tượng cấu trúc phân tử của một DNA như là một cái phéc-mơ-tuya (zip), mỗi răng kéo là một trong bốn khối chất liệu căn bản, viết tắt bằng các ký tự A (adenine), C (cytosine), G (guanine), và T (thymine), mà mỗi một ký tự đó gọi là một nucleotide, chúng cũng đứng song đôi như các răng kéo của phéc-mơ-tuya theo cặp cố định A-T hoặc G-C. Thông tin chứa đựng trong DNA được xác định cơ bản bằng chuỗi tiếp nối các ký tự này dọc theo cái "phéc-mơ-tuya" di truyền đó. Các 'ký tự' này đứng theo một thứ tự và một số lượng nhất định để tạo thành đơn vị lớn hơn gọi là gien. Nhiều gien nối lại với nhau tạo thành nhiễm sắc thể. Theo ước tính mới nhất, con người có khoảng 35000 bộ gien. Trong đó chỉ có 1% số lượng gien đóng vai trò chức năng (thí dụ như gien quy định màu da, tóc v.v..), 99% còn lại là những gien không có chức năng,  các gien này rất đa dạng, khác nhau ở từng cá thể. Cho nên chẳng thể có người nào giống người nào về cấu trúc di truyền DNA cả, trừ đó là người sinh đôi cùng trứng. 'Hồ sơ' DNA (tạm dịch từ DNA profiling) là một phần nhỏ trích từ cấu trúc toàn bộ của chuỗi DNA (của một cá thể), tức là các bộ gien và thuộc phần gien không có chức năng, đủ để phản ánh đặc thù riêng nhất của mỗi cá thể không lẫn lộn với người khác. Và cũng từ đó mà thuật ngữ "Điểm chỉ" DNA (tạm dịch từ DNA fingerprint)- cũng chính là 'hồ sơ DNA', do một nhà Di truyền học người Anh, Alec Jeffreys đề xuất, để nói lên một đặc trưng duy nhất cho mỗi cá thể giống như là dấu vân tay (hay điểm chỉ). 'Điểm chỉ' DNA là hoàn toàn giống nhau ở tất cả các tế bào, tổ chức mô, tạng phủ trong một cơ thể; và điểm chỉ DNA không có thể thay đổi được bằng bất cứ hình thức nào với tri thức của nhân loại hiện nay. Về nguyên lý nhận dạng cá thể sống bằng DNA rất đơn giản, đó là nguyên lý so sánh và ghép cặp. Đối với nhận dạng vết tích thì người ta đem mẫu DNA của vết tích so sánh với mẫu DNA dự trữ hoặc với các mẫu nghi ngờ. Đối với việc nhận dạng quan hệ huyết thống (cha mẹ chẳng hạn), người ta đem so sánh DNA của cha, mẹ với cá thể đó để xem có quan hệ di truyền hay không. Nói nôm na là như biển số đăng ký xe. Mỗi một chiếc xe có một biển số riêng, người ta có thể dựa vào hồ sơ đăng ký có thể xác định chính xác chủ nhân hiện thời của chiếc xe đó, tương tự mỗi chủ nhân có một thẻ đăng ký xe, khi mất xe họ có thể dùng số đăng ký đó đi truy tìm chiếc xe ở đâu. Kỹ thuật nhận dạng bằng DNA cũng y như vậy nhưng điều đặc biệt là DNA không thể thay đổi được, và nó 'ẩn' bên trong cơ thể, phải dùng các phương pháp kỹ thuật nhất định để có thể đọc được nó mà thôi. Tuy nhiên như đã trình bày vì cấu trúc di truyền DNA đầy đủ của mỗi một cá thể rất phức tạp, người ta không thể và không cần thiết phải sử dụng toàn bộ 35 nghìn bộ gien để đi phân tích, so sánh. Do đó chỉ sử dụng những bộ gien (khoảng chừng 12 gien hoặc ít hơn) hoặc các marker (đoạn đặc trưng) của các gien (không có chức năng) sao cho đủ để đặc trưng cho mỗi cá thể để phân tích mà thôi. Ứng dụng thực tế của công nghệ điểm chỉ DNA: Điểm chỉ DNA được ứng dụng trong cuộc sống hàng ngày với mục đích: (a) Trong Y pháp, hình sự : để xác định quan hệ phụ hoặc mẫu hệ; để nhận dạng tội phạm cũng như loại trừ nghi can thông qua dấu vết của cơ thể để lại hiện trường; nhận dạng cá nhân, nạn nhân vô thừa nhận. (b) Trong Y học điều trị: để chẩn đoán các bệnh về di truyền; phát triển các phương pháp để chữa các rối loạn về di truyền. (c) Trong các ngành khoa học khác: Như trong khảo cổ học; hoặc trong nông-lâm-ngư nghiệp dùng để vẽ bản đồ gien (mapping), tạp giao, lai giống, chuyển gien, để nhận dạng dấu vết các loài thú quý hiếm. Một trong ứng dụng mới nhất của công nghệ phân tích điểm chỉ DNA trong nông nghiệp là để bảo vệ tác quyền thương mại các sản phẩm, hay giống lai tạo mới. Tuỳ theo các mục đích khác nhau mà người ta tiến hành cách thức thu thập mẫu để có được chuỗi DNA cơ bản đầu tiên để phân tích khác nhau. Trong ứng dụng nhận dạng con người các mẫu thu thập cũng tuỳ theo yêu cầu mà có thể lấy mẫu máu, tóc, lông, da v..v đặc biệt trong nhận dạng tội phạm hình sự, mẫu thu thập rất đa dạng tuỳ theo tính chất sự kiện các dấu vết được để lại hiện trường. Các kỹ thuật phân tích điểm chỉ DNA hiện hành [2]:Có nhiều kỹ thuật  phân tích nhưng hai kỹ thuật thông dụng nhất hiện nay là: Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length Polymorphism) (tạm dịch là các đoạn gien có độ dài giới hạn đa hình thái). Xuất phát từ thực tế là các đoạn DNA chức năng và các đoạn DNA không chức năng có thể tồn tại dưới nhiều hình thái khác nhau. Bằng cách sử dụng các enzyme đặc hiệu, chẳng hạn Restriction enzyme, có thể cắt ra các đoạn gien RFLP. Người ta đã có thể nhận dạng được đến vài nghìn loại RFLP, rất đặc hiệu cho cơ thể. Kỹ thuật phân tích PCR/STR (Polymerase chain reaction/Short Tandem Repeat) Tức là kỹ thuật dùng phản ứng chuỗi enzyme đa phân để 'khuếch đại' các đoạn gien ngắn có độ lặp ngắn theo thứ tự (Short Tandem Repeat, STR). Ở đây polymesase tức là một loại enzyme có thể cho phản ứng tạo ra nhiều bản copy của một đoạn DNA nào đó; phản ứng chuỗi tức là một phản ứng diễn ra liên tục. Như vậy bằng kỹ thuật PCR có thể trong một thời gian ngắn tạo ra hàng triệu triệu đến hàng tỷ bản copy của một STR. Kỹ thuật này còn được gọi là kỹ thuật "khuếch đại DNA" hay "Photocopy phân tử" trong một lối nói rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật hiện đại nhất hiện nay được dùng trong Y pháp DNA. Về mặt cơ bản kỹ thuật này cũng tiến hành tương tự như kỹ thuật RFLPs. Lợi điểm của kỹ thuật này so với RFLP là: - Mẫu thu thập không nhất thiết phải đạt tiêu chuẩn cao, những mẫu lấy từ các mô bị huỷ hoại hoặc cháy bỏng nặng, xác thối rữa do chôn lâu đều có thể dùng được, hoặc chỉ lấy các 'vi vết' như tàn thuốc lá, vết dính nước bọt, những mẫu bệnh phẩm bị trộn lẫn như máu của nạn nhân lẫn với máu hay dịch của phạm nhân. Các đặc điểm khác nhau về kỹ thuật cơ bản giữa PCR/STR vơi RFLP là: (a) Trong nhận dạng quan hệ huyết thống, nếu phân tích một gien bằng kỹ thuật RFLP chỉ có thể cho ra tối đa hai dị hợp tử (allele)  và ba kiểu gien (genotype), trong khi đó dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại số lượng gien này lên, thì có thể cho ra đến 20 dị hợp tử và đến (20x21)/2 kiểu gien, và vì thế kỹ thuật này cho phép đánh giá chính xác hơn, (b) kỹ thuật PCR/STR gắn huỳnh quang rất tốt, nên rất dễ phát hiện tự động, thuận lợi cho phân tích pháp y, bảo quản và dễ phục hồi số liệu. Sau khi có các đoạn gien cần thiết được cắt đoạn, xếp theo kích thước, phân loại, thông qua hai kỹ thuật trên, các đoạn DNA này được chuyển dạng, nhuộm màu hoặc gắn huỳnh quang và tạo thành các thanh (như các thanh mã (bar codes) trong các gói hàng bán trong siêu thị), và dùng để so sánh đối chiếu.  Tuy nhiên công nghệ DNA cũng như moị công nghệ khoa học khác, ưu điểm và nhược điểm vẫn luôn song đôi với nhau. Một số vấn đề đối với điểm chỉ DNA Kết quả sai lầm của điểm chỉ DNA không phải do sự trùng hợp giữa cấu trúc di truyền của nhiều người mà do sai sót trong khâu kỹ thuật cũng như điều kiện tối ưu để cho ra kết quả chính xác. Ngoài ra kỹ thuật phân tích điểm chỉ DNA còn liên hệ đến mặt đạo đức. Thứ nhất phải kể đến tình trạng nhiễm DNA ngoại lai, có khi bị nhiễm ngay trên kính hiển vi khi soi tiêu bản. Do đó cần phải đặt vấn đề tiêu chuẩn chất lượng của phòng thí nghiệm phải đạt yêu cầu. Ngay ở Mỹ cũng chỉ có 20 trên tổng số 60 phòng thí nghiệm làm DNA tiêu bản được Ban giám đốc kiểm nhận phòng thí nghiệm của Hiệp Hội Tội phạm của Mỹ công nhận đạt tiêu chuẩn mà thôi. Ở Úc, cho đến 1991 vẫn chưa có một cơ quan kiểm nhận chất lượng các phòng thí nghiệm DNA nào [3], cũng như không có các chương trình kiểm tra chất lượng của nội bộ phòng thí nghiệm đó. Thứ hai, liên quan đến kỹ thuật chọn mẫu, nhiều khi mẫu không đại diện, không điển hình, hoặc mẫu bị thoái hoá. Tuy nhiên với kỹ thuật mới PCR/STR nêu trên có thể khắc phục được nhược điểm này, nhưng kỹ thuật này lại không cho độ chính xác cao. Cũng trong vấn đề phân tích kết quả, cần phải đề cập đến độ tin cậy của dữ kiện trong quần thể (population data). Ví dụ như FBI đã xây dựng được một hệ dữ liệu thống kê quần thể tham khảo cho các sắc dân da trắng, đen, da màu và dân Á châu. Vấn đề là ngay trong mỗi nhóm sắc dân đó cũng có sự biến đổi (chẳng hạn Á châu thì gồm Đông Á, Tây Á, Đông Nam Á v.v..). Xác suất để có thể khớp được một mẫu DNA với một mẫu trong quần thể tham khảo là rất thấp (1 phần 6 triệu!), do đó xác suất này có thể cao hơn nếu dùng phụ nhóm của quần thể tham khảo (có thể tăng lên 1/800000). Một trở ngại khác liên quan đến bằng chứng. Kết quả báo cáo của chuyên viên DNA được toà ghi nhận, thế nhưng lại không có bằng chứng cụ thể nào để xác nhận mẫu DNA đó là sản phẩm lấy từ mẫu bệnh phẩm nguyên thuỷ cả. Điểm sau cùng trong tính phức tạp của kỹ thuật điểm chỉ DNA là liên quan đến vấn đề đạo đức và pháp lý. Đây là vấn đề tranh cãi rất nhiều và chưa hoàn toàn thống nhất trong hệ thống pháp luật của nhiều quốc gia. Thứ nhất là về ngân hàng dữ liệu DNA tội phạm. Luật lệ nhiều nước gần như thống nhất là tội phạm hoặc như nghi phạm bắt buộc phải làm DNA. Còn những người bình thường thì không có cơ sở luật pháp bắt họ phải làm, như vậy về mặt dữ liệu sẽ bị thiếu hụt. Trong một số trường hợp những bệnh nhân bình thường, vì lý do gì đó phải xét nghiệm DNA thì đây là một trong những trường hợp nguy cơ kết quả DNA bị lạm dụng. Hoặc giả sử một trường hợp khác vừa liên quan đến đạo đức, vừa luật pháp. Ví dụ một đôi vợ chồng có một đứa con bị bệnh Cystis Fibrosis (hay CF, dịch là bệnh xơ nang tổn thương chủ yếu là tuỵ tạng và phối) là một bệnh di truyền lặn, do đó về di truyền thì bố mẹ phải có gien ẩn của bịnh này mới 'truyền' được cho đưá con. Nhưng khốn thay, khi xét nghiệm ra thì chỉ có người mẹ mang gien lặn mà thôi. Vấn đề đặt ra là, liệu có nên thông báo cho người chồng của bà mẹ biết rằng ông không phải là bố của đứa trẻ hay không? Và có nên thông báo cho cha chính thức của đứa trẻ rằng chính ông có mang gien lặn của bệnh CF, về mặt di truyền ông không nên cưới vợ có cùng mang gien lặn bệnh như ông nữa, hay không? Điểm chỉ DNA và vụ thảm hoạ hoả hoạn ở ITC thành phố HCM tháng 10/2002: Áp dụng của điểm chỉ DNA trong nhận dạng tử thi của thảm hoạ hoả hoạn  vừa mới xảy ra trong hạ tuần tháng 10 vừa qua tại ITC, thành phố HCM [4], theo báo cáo của nhà chức trách thì có 60 người tử vong, do sự huỷ hoại của lửa, 7 tử thi không có khả năng nhận dạng. Giới chuyên môn có thẩm quyền có hứa hẹn sẽ thu mẫu làm điểm chỉ DNA cho các trường hợp đó. Vậy ta có quyền hy vọng không? Câu trả lời là hoàn toàn có thể nếu dưạ trên bài tổng quan trên đây. Thực sự nhận dạng cá thể trong trường hợp này không hoàn toàn phức tạp như truy tìm dấu vết tội phạm. Các bước cần phải làm là chỉ cần thu mẫu mô bệnh phẩm, rồi lấy mẫu của thân nhân có người mất tích nghi ngờ trong vụ hoả hoạn. Chế khắc nhược điểm của mô bị cháy, nhiễm bẩn thì kỹ thuật phân tích PCR/STR hoàn toàn có khả năng. Vấn đề chỉ còn là kinh phí và khả năng thực hiện kỹ thuật. Về mặt thực tế, giới chuyên môn Phillipines đã thành công trong việc ứng dụng công nghệ điểm chỉ DNA để nhận dạng các nạn nhân trong một vụ thảm hoạ hoả hoạn [5] tại một trại mồ côi ở Paco, Manila năm 1998. Vụ hoả hoạn này đã cướp đi ít nhất là 28 sinh mạng, trong đó hầu hết là trẻ em. Điều phức tạp là tất cả những thi thể đã gần như cháy thành than ngoài khả năng nhận dạng cơ học, và các thi thể này vì lý do vệ sinh lúc đó đã được chôn cất đến 3 tháng mới được khai quật để lấy mẫu. Vấn đề đạo đức đặt ra trong trường hợp này là sau vụ thảm nạn, nhiều bố mẹ trước đó đã từng gửi con vào trại mồ côi ở đây, bây giờ không biết nạn nhân có phải là con của mình không, nếu nhận dạng được thì họ có thể làm được điều duy nhất họ có thể là nhang khói cho đứa con xấu số của mình trong quá khứ họ không có khả năng nuôi dưỡng. Mặc dù có một số nhược điểm, nhưng cho đến nay điểm chỉ DNA  vẫn được coi là công nghệ tối tân nhất trong khoa học nhận dạng cá thể đặc hiệu và chính xác,  do tính đặc trưng duy nhất cho mỗi cá thể. Điểm chỉ DNA đã không những đưa hình sự Y pháp lên một bước tiến mới mà nó còn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành khoa học khác, kể cả ứng dụng trong nghiên cứu tế bào mầm và tạo sinh vô tính. 3.Xét nghiệm phát hiện quan hệ huyết thống, truy tầm tông tích, phát hiện thủ phạm. Một người da đen (gọi là "X") sinh tại Anh đã bỏ qua sống với cha của mình tại Ghana. Sau đó anh ta xin qua trở lại Anh để sống với mẹ (gọi là "M") và ba người anh chị em ruột của mình thì bị từ chối cho nhập cảnh vì người ta nghi ngờ đã bị thay thế bởi một người cháu hay một người không thân thuộc gì với bà mẹ. Câu chuyện từ chối visa nhập cảnh này xảy ra vào năm 1985, lúc này xét nghiệm dấu ấn protein (protein markers) đã được thực hiện và xác định được bà mẹ có liên hệ với "X?", tuy nhiên không thể loại trừ được M là cô hay dì của "X?". Thắc mắc trên tưởng chừng bế tắc, không có cách giải quyết, nhưng may mắn Jeffereys và các cộng sự đã được nhờ đến và lần đầu tiên xét nghiệm dấu ấn DNA được áp dụng trong trường hợp này. Kết quả xét nghiệm đã xác định được đúng "X?" chính là "X" vì "X?" có mang các dấu ấn DNA từ M, đồng thời có chung các dấu ấn DNA với những đứa con của "M" thừa hưởng từ người cha. Vậy dấu ấn DNA là gì? Nguyên tắc hoạt động của các xét nghiệm dấu ấn DNA như thế nào? Những tiến bộ và các phạm vi ứng dụng hiện nay của xét nghiệm dấu ấn DNA ra sao? DNA bộ gen người của chúng ta có đến 30% chứa các trình tự base lặp lại và hầu như không mang những mã có ý nghĩa chức năng. Cũng như các trình tự base có ý nghĩa chức năng (gọi là gen), các trình tự base lặp lại này được di truyền từ cha mẹ sang con cái theo định luật phân ly độc lập của Mendel. Tuy nhiên khác với gen, rất khó tìm thấy sự khác biệt về trình tự base của gen giữa các cá nhân, có nhiều trình tự base lặp lại có thể giúp phân biệt được cá nhân này với các nhân khác, không những thế, có thể giúp tìm xem họ có quan hệ huyết thống với nhau hay không? Các trình tự base lặp lại này được gọi là các dấu ấn DNA. Có hai loại dấu ấn DNA hiện đang được dùng trong xét nghiệm dấu ấn DNA là:Các tiểu vệ tinh (minisatellite)Ðó là các trình tự base lõi lặp lại, gọi là các tiểu vệ tinh VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats = Số lượng thay đổi các trình tự base lặp lại), có các kích thước thay đổi từ 1.000 base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB). Các VNTRs này hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đa vị trí (multilocus minisatellite); Hay chỉ có tại một vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đơn vị trí (single-locus minisatelite). Xét nghiệm dấu ấn DNA mà Jeffereys thực hiện năm 1985 là xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đa vị trí bằng kỹ thuật phát hiện sự đa hình về chiều dài các đoạn DNA của bộ gen bị cắt bởi men cắt hạn chế (Restriction Fragments Lenght Polymorphism = RFLP). Kỹ thuật này được tóm tắt như sau (hình 1): (1) Trước hết mẫu máu được lấy từ những người cần thử nghiệm để tách được bạch cầu, sau đó ly trích toàn bộ bộ gen nguyên vẹn của bạch cầu trong các mẫu thử nghiệm; (2) Cắt đoạn các bộ gen đã ly trích này bằng men cắt hạn chế, là một loại men cắt nhận diện được 4 trình tự base đặc hiệu, nhờ đó cắt đoạn được bộ gen thành những mảnh DNA dài ngắn khác nhau, trong đó có những mảnh chứa các trình tự base lặp lại; (3) Ðiện di mẫu thử nghiệm để phân tách các đoạn DNA này trên thạch agarose, sau đó chuyển các đoạn DNA trên thạch này qua một màng nylon bằng kỹ thuật thấm Southern (Southern blotting); (4) phát hiện vị trí các trình tự base lặp lại trên màng nylon bằng cách lai với một trong những dò DNA đánh dấu đồng vị phóng xạ và đặc hiệu cho các trình tự base lặp lại này. Trong thử nghiệm, Jeffereys đã thiết kế 2 dò DNA có mã số là 33.6 và 33.15. Kết quả xét nghiệm ở trường hợp trên đã cho thấy "X?" có 61 vị trí của trình tự lặp lại đặc hiệu với hai loại dò 33.6 và 33.15, và tất cả 61 vị trí này đều thấy hiện diện được trên M (do "X?" đã di truyền được từ "M") hoặc trên 3 người con của "M" (do "X?" và họ đã di truyền được từ cha mình, tức là chồng của "M" dù không có mẫu thử nghiệm lấy từ ông này).Xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đa vị trí, vì dùng kỹ thuật RFLP, nên được gọi ngắn gọn là xét nghiệm RFLP. Xét nghiệm này được dùng khá nhiều trong xác định quan hệ huyết thống. Xin dẫn thêm một trường hợp bị chứng minh loạn luân tại Anh (ảnh 1). Kết quả xét nghiệm RFLP cho thấy mẹ đứa bé là "D" và cha của nó là "F" có đến 62% các vạch vị trí của tiểu vệ tinh đa vị trí trùng nhau; đồng thời "F" và "B" lại có đến 78% các vạch trùng nhau. Chính nhờ vậy mà đã xác định được chẳng những "F" là cha của "D" đồng thời cũng là cha của "B", có nghĩa là "F" vừa là ông ngoại, vừa là cha của "D". Tuy nhiên xét nghiệm RFLP có một hạn chế là phải có mẫu thử nhiều tế bào để có thể trích được bộ gen nguyên vẹn (phải lấy không dưới 10ml máu để tách đủ bạch cầu dùng trong ly trích bộ gen). 4.Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola Wei gây bệnh trrên cây cao su (Hevea brasiliensis) bằng phương pháp RFLP – PCR. (VŨ THỊ QUỲNH CHI. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 09/2005. Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN, ThS. PHAN THÀNH DŨNG.) Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su là một bệnh mới do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra nhưng có tác hại rất lớn đến nền kinh tế của nhiều nước, đặc biệt là những nước sản xuất cao su thiên nhiên. Triệu chứng biểu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và dễ nhầm lẫn với các bệnh về lá khác. Do đó tìm hiểu phương pháp chẩn đoán, phát hiện nhanh bệnh Corynespora cũng là cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước khi bệnh lây lan. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy, nấm C. cassiicola có sự phân hóa trong cùng loài, C. cassiicola trên các dòng vô tính cao su khác nhau có sự khác biệt về di truyền, nhờ đó có thể nhận biết C. cassiicola qua khả năng gây bệnh cho các dòng vô tính cao su khác nhau. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở nước ta là một việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa sự đa dạng di truyền của C. cassiicola với tính kháng của một số dòng vô tính cao su đang được trồng ở Việt Nam. Kết quả đạt được : Nhận diện được triệu chứng đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. Thu thập  mẫu bệnh trên 32 dòng vô tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình chẩn đoán và phân tích đa hình vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng phương pháp RFLP – PCR trên 7 dòng vô tính. Qua phân tích đi đến kết luận: Quy trình phản ứng PCR đối với nấm C. cassiicola của Silva và cộng sự (1998) có thể sử dụng để nghiên cứu vùng ITS nấm C. cassiicola ở Việt Nam. Chẩn đoán bệnh Corynespora bằng cách nhận diện sản phẩm khuếch đại vùng ITS sử dụng cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, sản phẩm thu nhận được không đặc trưng cho nấm C. cassiicola Không tìm thấy bất cứ sự đa hình nào trong vùng ITS của các mẫu nấm nghiên cứu khi sử dụng phương pháp RFLP – PCR với các enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI. Các mẫu nấm được dùng trong phân tích có thể thuộc cùng một chủng nấm C. cassiicola và đây có thể là chủng duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam hiện nay Amplified Fragment Length Polimorphism (AFLP) Khái niệm AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) là sự đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. 1975 Vos và cộng sự đã phát minh ra kỹ thuật này. 1993 Vos và Zabeau cho ra protocol đầu tiên cho kỹ thuật AFLP nhấn mạnh sự quan trọng của việc làm thuần khiết hai enzyme sử dụng (EcoRI và MseI), sau đó là chuẩn bị adapter và thiết kế primer một cách thận trọng. Ngày nay nó được cải tiến khán nhiều với những công dụng như sau: Công cụ có hiệu quả phát hiện tính chất đa hình. Xây dựng bản đồ di truyền có mật độ cao của genome. Xây dựng bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so với những marker khác (Vos và cộng tác viên. 1995). Khám phá ra những clone genome, vd YAC. Fingerprinting các đoạn DNA đã được cloned như cosmid, P1, BAC, YAC (Vos và cộng tác viên. 1995) AFLP marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR.