Đề tài Công nghệ gen trong sản xuất thuốc trừ sâu

Lời mở đầu Trong cuộc sống con người luôn luôn phải đối mặt với các sinh vật gây bệnh do vậy phải tự bảo vệ mình bằng các cơ chế bảo vệ thích ứng. Còn đối với các thực vật thì sao ? Nước ta là một nước nông nghiệp với hơn 80% dân số sống ở vùng nông thôn. Vì vậy, sản phẩm tạo ra từ nông nghiệp là rất quan trọng. Do đó, để nâng cao năng suất chất lượng cây trồng nhiều nơi đã áp dụng hàng loạt các biện pháp kỹ thuật tiên tiến như : thâm canh tăng vụ, thay đổi cơ cấu cây trồng. Nhưng các biện pháp này càng phát triển thì cây trồng càng xuất hiện các loài sâu bệnh hại mới. Để phòng trừ các loài sâu bênh hại, nhiều nơi đã sử dụng biện pháp hoá học, trước đây biện pháp này được xem là một biện pháp hữu hiệu trong bảo vệ thực vật vì biện pháp này đã phòng trừ được sâu bênh ngay. Nhưng cho đến nay, thì biện pháp này đã bộc lộ khá nhiều điểm như : gây ô nhiễm môi trường sống, làm huỷ hoại nhiều loài sinh vật (SV) có lợi cho con người. Ngoài ra chúng còn để lại nhiều dư lượng xấu trong các nông sản và thực phẩm, chính điều này làm nhiễm độc thực phẩm gây ngộ độc cho con người và gia súc. Để phòng chống các loại côn trùng phá hoại mùa màng, lương thực... bao gồm dạng chất bột là DDVT, malathion và dạng chất xông hơi là metyl – bromide, phosphin ; dạng chất lỏng monocrotophosphat, parathion – metyl... Trong những năm gần đây cùng với sự phát triển của các nghành công nghệ mới thì công nghệ sinh học là một nghành mũi nhọn được xã hội quan tâm. Mặc dù đây là một nghành mới nhưng công nghệ sinh học đã được các nhà khoa học vận dụng một cách sáng tạo những công nghệ tiên tiến trong sản xuất nông nghiệp như : công nghệ (CN) nuôi cấy mô tế bào, CN gen, CN lai tạo giống, công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học... ở các nước trên thế giới cũng như ở nước ta, hiện nay việc sử dụng các chế phẩm VSV để phòng trừ sâu bệnh hại đã trở thành một hướng mới đang được các nhà khoa học đi sâu và nghiên cứu do nó có ưu điểm : không làm nhiễm bẩn môi trường, không gây độc hại cho người và gia súc, không làm mất đi hệ SV có ích trong tự nhiên mà có tính chọn lọc cao. Trong số các chế phẩm sinh học như vi khuẩn, vi rút, nấm... thì vi khuẩn Bacillus Thurigiensis (BT) là loài vi khuẩn có tinh thể độc đối với loài côn trùng nó được dùng để diệt côn trùng bộ cánh vẩy, cánh cứng và bộ hai cánh. Vì vậy, việc nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh độc tố của BT, đặc biệt là công nghệ sản xuất BT đang là mục tiêu cũng là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học. Do vậy, sau một thời gian nghiên cứu em chọn đề tài “Cụng nghệ gen trong sản xuất thuốc trừ sõu” với hy vọng sẽ đưa ra cái nhìn tổng quát về tác dụng của thuốc trừ sâu BT trong thời gian vừa qua và phương hướng để nâng cao hiệu quả trong thời gian tới. Với mục đích như vậy kết cấu đề tài bao gồm các nội dung sau : Phần I : Lý luận chung về công nghệ gen trong sản xuất thuốc trừ sâu BT. I. Sơ lược lịch sử về vi khuẩn BT II. Đặc điểm chính của BT III. Khả năng sinh độc tố IV. Công nghệ sản xuất BT Phần II : Thành tựu và đánh giá hiệu quả về công nghệ gen trong sản xuất thuốc trừ sâu BT. Phần III : Phương hướng và giải pháp. Kết luận Phần I : Lý luận chung về công nghệ gen trong sản xuất thuốc trừ sâu. I. Sơ lược về lịch sử vi khuẩn BT. BT là loài vi khuẩn đất điển hình có khả năng tổng hợp protein độc tố trong quá trình hình thành bào tử. Năm 1901, ishitawa đã phát hiện ra loài vi khuẩn này và tác nhân gây bệnh ở ấu trùng tằm tơ Bombyxmori và đặt tên là B.sotto. Tên theo danh pháp hiện nay là B. Thurigiensis subsp. Sotto. Nhưng mãi đến năm 1911 loài vi khuẩn này mới được Berliner phân lập ở vùng Thurigen (Đức). Sau đó ông đã nghiên cứu và đặt tên mới cho vi khuẩn này là Bacillus Thurigiensis (BT). Ngay từ những năm 30 Bt đã được dùng thử nghiệm chống sâu đục thân ngô Châu âu. Năm 1938 để diệt sâu hại lúa mì, Pháp sản xuất chế phẩm sinh học đầu tiên từ Bt. Vào các thập niêm 60 á 70 rất nhiều chủng vi khuẩn có hoạt tính cao được phân lập và sử dụng trong các thương phẩm. Đặc biệt có chủng B. kurstski HD –1 kháng được hơn 50 loài côn trùng cánh vẩy gây hại trên 200 loài cây lương thực. Những diện tích rừng lớn ở Canada, Mỹ bị sâu cắn chồi, sâu bướm tàn phá và Bt đã chiếm tới 74% lượng thuốc trừ sâu đã được sử dụng để cứu rừng. Thuốc trừ sâu Bt với hiệu quả diệt côn trùng cao, phổ hoạt động rộng, không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái... trở thành đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Bulla và cộng sự đã nghiên cứu cấu trúc và quá trình hình thành tinh thể của Bt, mối quan hệ giữa bao tử và tinh thể. Carlton và Gonzalef nghiên cứu đặc tính di truyền của Bt và nhiều chủng mới có khả năng ra đời nhờ kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Hiện nay Bt đã được coi là thuốc trừ sâu sinh học có triển vọng nhất và chiếm tới 90% tổng lượng thuốc trừ sâu sinh học 2,3 triệu kg Bt được sử dụng khắp nơi trên thế giới, doanh thu hàng năm từ các chế phẩm Bt đạt 150 triệu US$. Người ta dự đoán Bt sẽ chiếm tới 30% thị trường thuốc trừ sâu vào năm 2005. Đó là chưa kể đến những cây được chuyển gen Bt với khả năng kháng sâu mạnh mẽ. II. Đặc điểm chính của vi khuẩn Bt. Bacillus Thurigiensis là trực khuẩn sinh nội bào tử, gram dương, hiếu khí hoặc không hiếu khí bắt buộc. Kích thước tế bào dài 3 á 6mm, có phủ tiên mao không dày, có khả năng di động được, tế bào xếp riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Bào tử của vi khuẩn có dạng hình trứng dài 1,6 á 2mm và có thể nảy mầm khi gặp điều kiện thuận lợi. Bt có quan hệ gần gũi với B. cereus và B. anthrais. Một số nghiên cứu dựa trên những đoạn DNA tương đồng và đặc điểm sinh hóa cho thấy Bt và B. creus thuộc cùng một loài. Như ta đã nói trên, Bt có khả năng hình thành bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi : nhiệt độ cao, khô hạn... Đây là đặc tính thích nghi giúp chúng tồn tại trong môi trường khắc nghiệt. Trong giai đoạn tạo bào tử, protein độc tố được tổng hợp, kết tinh thành các thể vùi và có thể chiếm tới 5 á 30% trọng lượng khô của bào tử. Hình dạng của tinh thể độc tố phụ thuộc vào gen mã hoá protein tinh thể. Chúng có thể là hình hai chóp (protein diệt côn trùng cánh vẩy do gen CryIA mã hoá), dạng vô định hình (protein diệt côn trùng hai cánh do gen CryIV mã hoá), hình chữ nhật hoặc hình lập phương... Bt có thể được tìm thấy trong đất, lá cây, xác côn trùng. Ngày nay, Bt được chia thành hơn 50 thứ khác nhau, dựa vào các tuyp huyết thanh của kháng nguyên tiên mao H, các thử nghiệm hoá sinh học (lên men đường). Quá trình sử dụng acginin, dritinaza, ureaza, sự hình thành protein độc tố và các dạng plasmid của chúng. III. Khả năng sinh độc tố. Trong loài Bt người ta chia thành nhiều loại phụ khác nhau căn cứ vào các đặc điểm sau : Khả năng hình thành enzim lơxitinaza. Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng. Đặc tính huyết thanh học (kháng huyết thanh tiên mao H) Phản ứng ngưng kết của tế bào vi khuẩn dinh dưỡng với kháng huyết thanh. 3.1. Các loại độc tố do Bt sinh ra ở loài Bt có bốn loại độc tố được sản sinh : Ngoại độc tố a (a - exotoxin) Ngoại độc tố b (b - extoxin) Ngoại độc tố g (g - exotoxin) Nội độc tố d (d - endotoxin) Trong bốn loại độc tố này người ta chú ý đến nội độc tố vì nó quyết định đến hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn. 3.1.1. Ngoại độc tố a (a - exotoxin) Ngoại độc tố a (a - exotoxin) hay còn gọi là phospholipaza C Bt varelesti sản sinh ra enzim lơxitinaza. Tác động độc của enzim này liên quan đến sự cảm ứng của phospholipit trong mô của côn trùng làm côn trùng bị chết. Eizim này đầu tiên liên kết với tế bào ruột của côn trùng, sau đó được tách ra và được hoạt hoá bởi một chất không bền nhiệt. Chất này có trọng lượng phân tử thấp có thể là lipit. Độc tố này đặc biệt chỉ có tác động với loài ong xẻ. Có pH đường ruột phù hợp tác động của enzim. 3.1.2. Ngoại độc tố b (b - extoxin) Còn gọi là độc tố bền nhiệt ở 1200 C trong 15 phút vẫn còn hoạt tính. Một số Bt không sinh tinh thể độc, nhưng có thể sinh ra ngoại độc tố b. Hoạt tính của ngoại độc tố b bắt đầu xuất hiện trong giai đoạn vi khuẩn phát triển mạnh, trước khi hình thành bào tử. Ngoại độc tố b là một nucleotit có trọng lượng phân tử thấp (707 á 850), có các adenin, riboza, phospho với tỷ lệ bằng nhau. Tác động của nó là kìm hãm nucleotidaza và RNA – polymeraza phụ thuộc DNA, các enzim này gắn với ATP và dẫn đến việc ngừng tổng hợp mRNA. Ngoài ra ngoại độc tố b còn có tác dụng cộng hưởng với nội độc tố d sau khi nội độc tố có tác dụng gây dập vỡ, phá huỷ hoàn toàn biểu mô, ruột giữa của côn trùng mẫn cảm, ngoại độc tố nhanh chóng xâm nhập vào huyết tương và máu, tới các cơ quan gây thay đổi sinh lý và dẫn tới cái chết nhanh chóng đối với ấu trùng. Ngoại độc tố b rất hiệu quả trong việc chống sâu non của côn trùng mẫn cảm. Nó gây ra những trì trệ trong việc chuyển hoá lột xác và có tác động đối với con trưởng thành và phát triển từ các ấu trùng đã âưn phải độc tố dưới ngưỡng gây chết. 3.1.3. Ngoại độc tố g (g - exotoxin) Hay còn gọi là độc tố tan trong nước. Độc tố này có chứa các peptit với trọng lượng phân tử thấp từ 200 á 2000 và một số axit amin tự do. Độc tố này tan trong nước không ổn định mẫn cảm với không khí, ánh sáng, O2 và nhiệt độ (bị bất hoạt từ 600C trở lên trong vòng 10 đến 15 phút). 3.1.4. Nội độc tố d (tinh thể độc) Nội độc tố d là một protein kết tinh gồm 1180 gốc axit amin (aa). Các aa chủ yếu là axit glutamic, axit asparaginic chiếm trên 20% tổng số aa trong phân tử và là nguyên nhân gây điểm đẳng điện thấp. Lượng xitin nhỏ qui đinh sự không hoà tan của tinh thể. Ngoài ra còn có các axit amin khác như treonin, loxin, izoloxin... Ngoài protein tinh thể còn chứa các những thành phần khác như hydratcacbon chỉ kết hợp với tinh thể như một sự pha tạp hình thành bào tử. Về thành phần nguyên tố tinh thể ngoài các nguyên tố C, N, H, O, S còn có 19 nguyên tố nữa là Ca, Mg, Si, Fe và một số lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Mn, Cu... hầu như không có P. Sự tổng hợp tinh thể xảy ra trong khoảng 3 giờ, trong pha cân bằng mỗi bào tử có thể có từ 1 á 3 tinh thể độc và chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào mang bào tử và tinh thể. 3.2. Cơ chế và ảnh hưởng của độc tố Bt lên côn trùng. 3.2.1. Cơ chế Các chủng Bt khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau. Trước đây các chủng Bt được xem là chỉ có độc tính với côn trùng cánh vẩy, cuối những năm 70 và đầu những năm 80, các chủng Bt phân lập được cũng có độc tính với côn trùng hai cánh và côn trùng cánh cứng. Gần đây người ta phát hiện ra các chủng có độc tính đặc biệt với mầm bệnh động vật nguyên sinh, sán lá ký sinh động vật. Với số lượng gen sinh protein tinh thể được xác định tăng cùng với số lượng các chùng nghiên cứu ngày càng nhiều, người ta thấy rõ rằng , hoạt tính và phổ tác dụng diệt côn trùng hầu như được quyết định cấu trúc của protein tinh thể. Người ta đã có trình tự của khoảng 50 gen mã hoá protein tinh thể từ các chủng thuộc các tuýp huyết thanh khác nhau. Trong đó có khoảng 20 gen phân biệt chịu trách nhiệm tổng hợp các protein tinh thể. Cơ chế tác động của protein tinh thể do gen CryI và CryIII tổng hợp bộ cánh vẩy và cánh cứng được nhiều nhà vi sinh vật quan tâm nghiên cứu. Một số nghiên cứu đang được triển khai với protein do CryII, CryIV, cytA tổng hợp và người ta đã nghiên cứu ảnh hưởng độc tố của Bt nên tế bào thượng bì màng ruột của sâu xanh hại cải và nghiên cứu ảnh hưởng độc tố của một số chủng Bt subsp. Israekusis lên tế bào côn trùng và mô tả cơ chế tác dụng của độc tố như sau : trước hết tinh thể độc được côn trùng nuốt vào ruột, do tác dụng của pH cao đường ruột mà tinh thể hoà tan, thuỷ phân tiền độc tố diệt côn trùng có trọng lượng phân tử khoảng 130 kDa hoặc 70 kDa thành d - endotoxin, độc tố này bám dính lên tế bào thượng bì của ruột tạo nên các lỗ rò để cho ion nước chảy vào làm tế bào bị căng ra và phân huỷ. Tuỳ theo côn trùng mà có ít nhất 3 cơ chế tác động gây chết của tinh thể độc. 1 : Sau khi ăn phải tinh thể một thời gian khoảng từ 5 á 20 phút, ruột giữa bị tê liệt, pH trong máu và bạch huyết tăng lên từ 1 á 1,5 đơn vị, còn pH ruột giữa hạ xuống do chất kiềm của ruột thấm vào máu. Tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ, sau 1 giờ toàn bộ cơ thể bị tê liệt. 2 : Sau khi ăn phải tinh thể thì côn trùng ngừng ăn, ruột bị tê liệt nhưng pH của máu và bạch huyết không tăng. Sau 24 ngày côn trùng chết mặc dù không bị tê liệt toàn thân. 3 : Đặc biệt là tinh thể nhất thiết phải kèm theo bào tử mới gây chết. Côn trùng chết sau 2 á 4 ngày không có hiện tượng liệt. 3.2.2. Yếu tố ảnh hưởng Tất cả các yếu tố ảnh hưởng của đến quá trình sinh trưởng và phát triển của Bt đều ảnh hưởng đến quá trình hình thành tinh thể độc tố. Vi khuẩn Bt thường sinh trưởng ở khoảng nhiệt độ 27 á 300C, topt là 300C. Nếu nuôi cấy ở 150C trở xuống thì bào tử không hhình thành và pHopt cho sinh trưởng là 7, pH quá cao (pH = 12) hoặc quá thấp (pH = 3,3) đều làm biến tính tinh thể. Một số chất dinh dưỡng có hiệu quả rõ rệt khi cho vào môi trường nồng độ 0,3 á 0,5. Nồng độ O2 ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành bào tử và tinh thể độc vi khuẩn. Quá trình hình thành bào tử đòi hỏi sự tổng hợp của một loại proteaza ngoại bào, ở những chủng đột biến do không có khẩ năng tổng hợp enzim này nên cũng sẽ không sinh ra được bào tử tinh thể. Như vây, sự tạo thành bào tử và tinh thể có liên quan đến sự chuyển hoá phần protein của tế bào sinh dưỡng. Một số axit amin có tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn cũng như hình thành tinh thể như loxin, izoloxin. Tuy nhiên khi có va lin trong môi trường thì tác dụng này cũng mất đi. Nếu bổ xung thêm treonin hoặc serin vào môi trường thì gây ức chế, nhưng nếu đưa cả hai vào môi trường thì không có hiện tượng này. Tác dụng ức chế của serin cũng mất đi nếu có mặt của methionin. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự trao đổi chất axit axetic cũng làm ức chế sự tạo thành bào tử và tinh thể độc . Chất kháng sinh erytromcyin ở nồng độ thấp chưa đủ ức chế Bt sinh trưởng nhưng nó lại cản trở sự hình thành bào tử. Sự có mặt của chất kháng sinh này làm thể mang bào tử không bị phân giải và tinh thể còn lại sẽ bị giữ lại trong phần còn lại của thành tế bào. 3.3. Các gen mã hoá độc tố Hàng loạt chúng Bt có khả năng sản sinh tinh thể độc tố diệt ấu trùng của một số loài côn trùng cánh vẩy, cánh cứng, hai cánh đã được nghiên cứu ở mức độ phân tử. Người ta đã nghiên cứu trình tự 50 gen độc tố. Một số giống nhau hoàn toàn, một số khác gần giống nhau đại diện cho cùng một gen hoặc biến dạng từ một gen. Có 14 gen riêng biệt trong đó 13 gen được gọi là gen độc tố (gen Cry) mã hoá tổng hợp protein gây độc với côn trùng và một gen tổng hợp protein gây độc với tế bào động vật có xương sống gọi là gen CytA . Hiện nay gen Cry được chia thành 6 lớp chính có ký hiệu : CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV, CryVI trên cơ sở cấu tạo giống nhau và phổ tác dụng với côn trùng thì : Nhóm gen Cry Kích thước Hình dạng Phổ tác dụng CryI(A,B,C,D,E,F) 130 –138 kDa Tinh thể hình tháp. Côn trùng cánh cứng, vảy CryII(A,B,C) 70 –71 kDa Tinh thể hình lập phương . Côn trùng cánh cứng, vảy CryIII(A,B,C,D) 66 – 73 kDa Tinh thể hình thoi dẹt . Côn trùng cánh cứng CryIV(A,B,C) 135 – 145 kDa Tinh thể hình cầu, chữ nhật. Côn trùng hai cánh CryV(A,C) 81 kDa Tinh thể hình tháp . Côn trùng cánh cứng,vảy CryVI 44 – 45 kDa Tinh thể hình tháp. Giun tròn Bảng tra nhóm gen Cry Trong tất cả các gen Cry thì gen CryI được nghiên cứu kỹ nhất. Vì gen CryI có trọng lượng phân tử 130 á 138 kDa. Mã hoá cho các protein độc tố, có cấu trúc tương đồng và kháng ấu trùng cánh vẩy. Gen CryI bao gồm 6 nhóm phụ ký hiệu từ CryIA đ CryIF. Trong đó CryIA được phân thành 3 nhóm nhỏ hơn là CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c). Với lí do là gen CryI có tỷ lệ aa đồng nhất cao (vì có hơn 80% aa đồng nhất). Nhóm gen Cry được nghiên cứu nhiều và nó có 20 gen khác nhau ddã đươc giải trình tự và từ năm 1980 người ta thành công lần đầu tiên là tạo được thuốc trừ sâu baừng kỹ thuật gen . Những nghiên cứu ban đầu cho thấy quá trinh hình thành tinh thể độc tố liên quan mật thiết đến sự có mặt của plasmid. Gen mã hoá độc tố tự nhiên thường nằm trên plasmit cỡ lớn và dài tới 3 kb. Nhưng chỉ có đoan 2 kb tính từ đầu 5’ mã hoá đoạn protein có tính độc, phần còn lại mã hoá đoạn protein có liên quan tới tính gắn. Bảng tra kí hiệu protein độc tố (Các serotype Bt nguồn gốc Crickmore 1996) Kí hiệu Chủng Bt Diệt sâu hại Bộ CryI (a,c) Kusstaki Sâu xanh đục thân Lepidoptera Alesti Sâu đo, sâu xám, mối Lep. Diptera CryI (b) Berlinet Sâu keo, mối, sâu hại kho Lep. Coleoptera CryI (b,c) Thurigens Sâu tơ, sâu xanh hạt cải Lep CryI (d,l,f) Aizawai Sâu bộ cánh vẩy Lep CryIII (a,b,c) Ruristaki Sâu bộ cánh vẩy Lep CryIII a Shangai Bọ khoai tây Coleoptera CryIII a Tenebrionis Bọ cánh cứng Coleoptera CryIV a Israelausis Muỗi Culex và Aedes Diptera Mỗi chủng Bt có ký hiệu protein độc tố riêng, căn cứ vào các protein độc tố này mà người ta đã nhận biết được chủng Bt có khả năng diệt sâu hại ở bộ nào mà định hướng cho việc sản xuất ra chế phẩm Bt. IV. Công nghệ sản xuất Bt 4.1. Sản xuất chế phẩm Bt (theo phương pháp cổ truyền ) Sản xuất Bt được thựchiện bằng cả hai phương pháp lên men chìm và lên men xốp. Trong công nghệ lên men xốp thường dùng những hạt cơ chất rắn, những hạt này có thể hoặc không có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trên bề mặt. Các hạt cơ chất rắn này đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng hoặc chất mang vô cơ. Bên cạnh đó công nghệ sản xuất Bt qui mô lớn gặp nhiều khó khăn. Đó là việc cung cấp khí cho môi trường, ngăn chặn sự nhiễm. Điều chỉnh sự lên men thu hoạch. Phương pháp lên men xốp có sản lượng thấp so với lên men chìm và nó không phải là phương pháp thực tế để sản xuất chế phẩm thương mại. Đối với phương pháp lên men chìm, việc nghiên cứu tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu là rất càn thiết. Ngoài ra phải quan tâm tới các thông số trong quá trình lên men như : nhiệt độ, độ pH, độ O2 hoà tan, tốc độ không khí, để xác định thời gian thu hoạch tối ưu. Quá trình sản xuất lên men Bt : Chủng BT (trong ống thạch) Nhân giống cấp I (trên máy lắc) Nhân giống cấp II Kích thích lên men (nhiệt độ, thông gió, pH) Lọc Ly tâm + chất phụ gia(trộn) Sấy chế phẩm thô đóng gói sản phẩm Chất bảo quản + chất phụ gia Dung dịch đóng chai bảo quản 4.2. Sự chuyển gen Bt vào thực vật 4.2.1. Chuyển nạp gen Cry IA(b) vào cây lúa Gen CryIA(b) dạng khảm tinh thể cụt với 2 promoter có tính chất cấu trúc là 355 CaMV và Actin – 1, hai promoter chuyển tính trên mô chúng được chuyển nạp vào cây lúa với hai dạng hình khác nhau và bằng phương pháp bắn gen trên tế bào trần (Datta và công sự năm 1998) đã sử dụng 1800 cây lúa được giả định đã chuyển nạp thành công gen Bt này. Sau đó người ta phân tích và kết quả là có hơn 100 cây chuyển nạp được xác nhận có sự có sự hợp nhất của gen CryIA(b) và genome của cây lúa. Người ta cũng ghi nhận mức độ cao của CryIA(b) protein trong mô lá tươi và thân lúa với những cây sử dụng( PEPC) promoter. Và sự khác biệt nhỏ về protein ở lá và thân cây lúa transgenis sử dụng promoter 355 hoặc Actin – 1 được ghi nhận. Có 81 cây lúa trong 800 cây sau khi có kết quả dương về phân tích Southern được thanh lọc với sâu đục thân màu vàng cho thấy 100% sâu non chết. Gen CryIA(b) này được kết hợp với nhiều promoter cho thấy mức độ thể hiện protein có khác nhau (thấp hoặc cao). Promoter (PEPC) hoặc Pith đã được khuyến cáo và sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với nhau, cho phép thể hiện protein CryIA(b) trên thân, lá, tối thiểu hoá protein này trong hạt lúa. Công trình của( Nayar và cộng sự năm 1997) cho thấy trên cây lúa indica được chuyển nạp gen CryIA(c) cũng có kết quả diệt được sâu đục thân màu vàng. Cả hai CryIA(b) và CryIA(c) đều là những candictate genes đối với sâu đục thân màu vàng trên lúa. Gen CryIA(c) được thiết lập với promoter và terminator. Công thức gen này được chuyển nạp vào calli của phôi giống lúa gây độc tính cho sâu trong đó có hai dòng thể hiện rất ổn định ở thế hệ T2 Phương pháp bắn gen : Đây là phương pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng. Kết quả chuyển nạp Cơ quan Phương pháp Tác giả Hoạt động transient Callus của Japonica ổn định Cây transgenic (Japonica) Cây endica đầu tiên Tế bào trần Tế bào trần Tế bào trần Tế bào trần Tế bào trần Tế bào trần PEG PFG Mở lỗ bằng xung điện Mở lỗ bằng xung điện PEG PEG Cu-Lee và CS 1986 Uchimya và CS 1986 Toriyama và CS 1988 Zhang và CS 1988 Zhang và Wu 1988 Datta và CS 1990 Kết quả chuyển nạp Cơ quan Phương pháp Tác giả Giống lúa Chuyển agrobacterium Thử nghiệm trên ruộng đầu tiên (gen kháng thuốc cỏ) Phôi chưa trưởng thành Phôi Phôi chưa trưởng thành Bắn gen Agrobacterium Bắn gen Christou và CS 1991, 1992 Hiei và CS 1997 Oard và CS 1996 Lịch sử phát triển của công nghệ chuyển nạp gen trên lúa Hiện nay trong phương pháp bắn gen có 3 loại dụng cụ khác nhau và điểm khác nhau chủ yếu là phương pháp điều khiển. Dụng cụ ban đầu là một bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng gây nổ nhờ một kim lửa. Dụng cụ kiểu thứ hai hoạt động theo nguyên tắc phóng điện đưa DNA phủ lên các phân tử bằng vàng cực mịn. Dụng cụ kiểu thứ ba hoạt động bằng áp suất của gas từ một xi lanh chứa gas, nhằm thúc đẩy tiến trình bắn DNA. Vận tốc của tiến trình loại dụng cụ 3 này chậm hơn so với loại 1 nhưng nó lại có hiệu quả trong việc vận chuyển plasmit DNA vào cây trồng. Thí nghiệm đầu tiên người ta phân lập phôi lúa chưa trưởng thành (phôi non) rồi tiến hành bắn gen. Chồi mầm của phôi cũng được thí nghiệm 24 giờ sau khi bắn gen, hoạt động của “transient” đối với gen mới du nhập đã được ghi nhận. Mức độ hoạt động của “transient” thay đổi tuỳ theo loại DNA, mật độ “loading” các phân tử kim loại kèm theo lực bắn, độ sâu để chuyển nạp xâm nhập vào phôi. Thông thường hoạt động GUS có tính chất “transient” được tìm thấy gia tăng theo sự tăng của hàm lượng DNAvà giảm theo lực, giảm theo mật độ thấp của các phân tử kim loại. Mô được bắn gen xong sẽ được đưa vào môi trường tái sinh, bổ sung thêm các chất có tính chọn lọc một cách thích hợp, kháng sinh gromycin B hoặc Basta (thuốc cỏ), hoặc chất đồng phân của nó. Sự xuất hiện của calluscos chứa gen chuyển nạp sẽ được quan sát 5 á 7 ngày sau khi bắn gen. Mô đã được bắn gen với plasmit không chứa kháng sinh hoậc kháng thuốc cỏ hoặc có những phần tử vàng (không phải DNA) thì không phát sinh ra callus chúng sẽ chết trong vòng vài ngày, sau khi đặt vào môi trường có tính chọn lọc. Việc chọn lọc liên tục có phản ứng dương tính trên môi trường có chứa “Hgm” sẽ tạo ra sự thể hiện callus của phôi đã được chuyển nạp. Callus này sau đó phát sinh vào phôi được chuyển nạp và những mô khác có tính chất “transgenis”, như chồi hoặc rễ để ròi cho ra cây transgenis hoàn chỉnh. 4.2.2. Chuyển nạp gen CryIIIA vào cây lúa. Đối với côn trùng thuộc coleoptera như mọt gạo và bọ xít đã được xem như đối tượng quan trọng trong chiến lược sử dụng gen CryIIIA để phòng trị. Endotoxin CryIIA của Bt. Vartenebrionis là một phân tử protein 65 kDa. Gen CryIIIA được phân lập, đầu N được xác định bằng cách sử dụng một codon tổng hợp của threonine và proline. Công thức gen cải tiến của CryIIIA bao gồm promoter CaMV35S, teminator phục vụ sự thể hiện gen. Sự thể hiện gen CryIIIA trong giống lúa indica được chứng minh thông qua xét nghiệm sự thể hiện “transient” trong tế bào trần. Kỹ thuật cloning gen CryIIIAcũng được mô tả : Vector dùng cho thể hiện gen là pCN18, được triển khai bằng cách chuyển đoạn phân tử E. coRI – Hind HI của vector pBH 21 sang pUC18 để hình thành pCN18. Gen uid A cũng có trong phân tử này được loại bỏ nhờ restriotion enzimme smal, sst I theo kiểu cắt “blund end” rồi nối lại sau khi hoàn thiện ở đầu dây bằng Klenow. Gen CryIIIA có trong pBTT2 được cắt bởi Hind HI, một đoạn phân tử có kích thước 2,3 kb, dạng cắt “blunt end” gắn vào vị trí Bam HI của pCN18. Người ta tiến hành chọn lọc một clone (pCN BTI) ở đó gen Cry IIA được gắn vào thế (insert), clone này có thể phục hồi bằng cách phân cách Bam HI và Bgl H. ị ảnh hưởng của gen Bt trên sự biến thái của côn trùng, khi cho chúng ăn với liều lượng 40mg ICP/mg RFP (Johnson và CS 1996). Nghiệm thức Tỷ lệ sống sót (%) Tỷ lệ biến thái (%) Kiểm chứng (không có ICP) Có ICP của isolate thuộc Bt vartenebrionis Dòng xử lý (Ecoli thể hiện ICP do gen CryIIIA) 86,60 36,66 40,00 96,10 45,45 41,60 ị Sự tổng hợp các trường hợp khác trong chuyển nạp gen : Danh sách các cây được chuyển nạp gen Cry Crystal protein Côn trùng Cây chuyển nạp CryIAa Lepidoptera Cranberry, poplar, rutabaga CryIAb Lep Táo, bông vải, bắp, poplar, khoai tây, lúa, thuốc lá, cà chua, White clover CryIAc Lep Táo, broccoli, bắp cải, bông vải, nho, mù tạt, đậu phụng, lúa, đậu nành... CryIBa Lep White clover CryICa Lep Alfalfa, arabidopsis, thuốc lá CryIH Lep Bắp CryIIAa Lep Bông vải CryIIIA Coleoptera Cà tím, khoai tây, thuốc lá CryVIA Coleoptera Alfalfa CryIXC Lep Bắp Bt không chuyên tính Juneberry, hawthorn, đào lông, mía 4.3. Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật. ( Chuyển nạp gen bằng phương pháp Agrobacterium) Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh ghẻ khối u trên cây, nó