Đề tài Cloning

.
 1-đđịnh nghĩa:công nghệ DNA tái tổ hợp còn gọi là nhân dòng gen hay nhân dòng phân tử, là một khái niệm tổng quát, bao gồm 1 số qui trình thí nghiệm dẫn đến việc chuyển thông tin di truyền (DNA) từ sinh vật sang sinh vật khác. Có thể sử dụng nhiều phương pháp để thực hiện mục đích này. 2.cơ sở khoa học:trong những năm cuối thế kỉ 20,di truyền học và kĩ thuật gen đã phát triển nhanh chóng;đạt được nhũng thành tựu to lớn về lý thuyết và thực tiễn. 1865:Gregor Meldel phát hiện các qui luật di truyền. 1869:Fredrich Miescher phát hiện ra acid nucleic. 1902:Walter Sutton, theodor boveri nêu lên thuyết cấu trúc nst. 1910:Thomas hunt morgan và cộng sự phát hiện vị trí sắp xếp của các gen trên nst. 1944:Avery,Mc Leod,Mc Carty xác định gen cấu tạo từ DNA. 1953:James Watson,Francis Crick và cộng sự phát minh mô hình cấu trúc xoắn kép của phân tử DNA. 1970:Hamilton Smith phát hiện enzim cắt giới hạn (restriction enzim). 1972:Paul Berg thành công tạo DNA tái tổ hợp in vitro. 1973:Herb boyr,Stanley cohen lần đầu tiên sử dụng plasmid tách dòng DNA. 3.Hệ thống tế bào chủ: Vi khuẩn Escherichia coli (E.co). Nấm men Saccharomyces cervisiae. Hệ thống tế bào thực vật. Hệ thống tế bào động vật I-Tế bào chủ: Một tế bào chủ lý tưởng là một tế bào dễ nuôi cấy ,dễ nhân giống,dễ chấp nhận nhiều loại vector.E.coli đáp ứng đýợc những yêu cầu này. Tùy vào mục đích để chọn hệ thống tế bào chủ Các vật chủ nhân sơ: E.coli: vi khuẩn gram(-) có một nhiễm sắc thể nằm riêng lẻ.
 Ngoài E.coli còn có các vi khuẩn khác: Bacillus, Psneudomonas, Streptomyces. Tuy nhiên có những hạn chế nhất định: thường ít có vector thích hợp. Các vật chủ nhân chuẩn: Nấm men Saccharomyces arevisiae. Nấm Aspergillus nidulans và Neurospora crassa. Tảo đơn bào: Chalamydomonas reinhardii.
 Nấm men Saccharomyces arevisiae
 Tảo đơn bào: Chalamydomonas reinhardii. Các vector chuyển gen: Các vector chuyển gen plasmid: Thường dùng rộng rãi nhất là pBR322
Các phage λ Plasmid Ti
 Và một số vector ít thông dụng: Các vector khác ở Procaryote: -Cosmid -Phage M13 Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC Sử dụng trong chuyển gen thực vật. Enzyme: Các enzyme cắt giới hạn: -Là các enzyme cókhả năng cắt DNA ở những vị trí đặc hiệu nhất định.

 Enzyme nối(ligase):-Nối hai phân tử DNA với nhau để tạo DNA tái tổ hợp.-Xúc tác phản ứng nối bằng cách hình thành cầu phosphodiester gắn với các nucleotide kề cận hay chụm đầu với nhau. Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase): -Có khả năng tổng hợp nên DNA một mạch đượcc gọi là c-DNA từ khuôn mRNA hoặc từ poyribonucleotide. Các enzyme khác: Enzyme  Chức năng   Dnase I  Phân hủy DNA mạch kép bằng thủy giải nội liên kết phosphodiester.   Nuclease BAL31  Phân hủy cả hai đầu mút 3' và 5' của DNA không cắt nội liên kết.   S1 nuclease  Phân hủy DNA mạch đơn.   Đoạn Klenow  DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease 3'→5'   Taq DNA polymerase  DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquatus   Các bước trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA : Bước 1: nuôi tế bào chủ tạo vector chuyển gene và nuôi tế bào cho cung cấp DNA. Bước 2: tách DNA plasmide và DNA tế bào cho. Bước 3: cắt cả hai DNA bằng cùng một loại enzyme restriction endonuclease. Bước 4: trộn chung DNA plasmide và DNA tế bào cho để chúng gắn với nhau. Bước 5: thêm enzyme nối Ligase tạo liên kết hóa trị thành DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh. Bước 6: biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (thường là tế bào E.coli). Bước 7: chọn lọc và tạo dòng vi khuẩn mang gene lạ ( tế bào nhận có plasmide tái tổ hợp mang một đoạn gene hay đoạn nucleic acide được nhân bản thành dòng gồm vô số bản sao giống nhau).Sau khi có dòng sẽ tạo điều khiện cho gene biểu hiện tạo ra sản phẩm. Thực hiện ba bước đầu tiên cần chọn lọc và xử lí vector cũng như DNA cần tạo dòng cẩn thận. Vector chuyển gene và DNA tế bào cho được cắt ở vị trí xác định bằng cùng một loại enzyme cắt giới hạn; hai đầu chỗ mối cắt được loại phosphate để không nối trở lại.Điều này tránh sự hình thành của các dòng vi khuẩn mang vector không tái tổ hợp. Xử lí DNA tế bào cho: trước hết cần chọn lọc sơ khởi các đoạn DNA có kích thước gần nhau và tương ứng với vector đã chọn. Sau đó, hai đầu của DNA này được cắt bởi cung loại enzyme với vector. Bước thứ tư và thứ năm thì vector và DNA cần tạo dòng đã được xử lí sẽ được trộn chung theo một tỉ lệ nhất định với sự hiện diện của Ligase. Enzyme nối Ligase xúc tác phản ứng nối bằng cách hình thành cầu phosphodiester gắn các gắn các nucleotide kế cận hay cụm đầu với nhau.
Bước thứ sáu, chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Tùy thuộc loại tế bào chủ , người ta sử dụng kĩ thuật chuyển thích hợp. Biến nạp được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau như: Hóa biến nạp: DNA tái tổ hợp được ủ với số lượng lớn tế bào nhận có khả năng dung nạp. Xử lí CaCl2 lạnh, kèm sốc nhiệt (420C trong 2 phút ). Điện biến nạp: sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung (pulse) làm tế bào hấp thụ DNA. Hiệu quả :109 – 1010 thể biến nạp / 1 mg DNA. Đoạn biens nạp có kích thước lớn: 25 – 135 kb. Nhưng tỉ lệ tế bào chết đáng kể : 50 – 75 %. Vi tiêm ( micro – injection): tiêm thăng DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận. Phương pháp này thích hợp với chuyển gene ở tế bào động vật có vú. Bắn DNA vào tế bào: các hạt kim loại Tungsten hay vàng ( đường kính trung bình 4 micrometre ) mang DNA hay RNA , được bắn với tốc độ nhanh, xuyên thủng vách tế bào để đưa DNA hoặc RNA vào trong. Một quy trình biến nạp tự nhiên thường bao gồm : Sự bám dính của DNA sợi kép vào thành phần của thành tế bào. Sự xâm nhập của DNA vào ngăn trong, ở đây nó được bảo vệ trước các enzyme nuclease. Sự vận chuyển một sợi vào tế bào chất và sợi khác bị phân hủy. Nếu DNA là phân tử mạch thẳng, nó có thể hội nhập vào nhiễm sắc thể tế bào chủ, hoặc nếu nó là plasmide,sau khi sợi thứ hai được tổng hợp ,nó được lưu giữ trong tế bào chất. Cuối cùng là chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gene: Người ta có thể phát hiện dòng tái tổ hợp bằng nhiều phương pháp ,có hai phương pháp thông dụng nhất: Phương pháp sử dụng các oligonucleotide tổng hợp: Đây là phương pháp thông dụng nhất hiện nay. Cho phép tạo dòng một gene khi xác định được một phần nhỏ trình tự amino acide của protein do gene mã hóa. Nguyên tắc: Protein cần nghiên cứu được tách chiết tinh sạch.Vài trình tự ngắn (15- 20 amino acide ) của protein được xác định. Do mã di truyền có tính thoái hóa nên các trình tự trên được xử lí bằng kĩ thuật vi tính để xác định trình tự oligonucleotide phù hợp nhất với thực tế. Trình tự này được tổng hợp với số lượng lớn và được đánh dấu ở đầu 5’ Bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng hóa chất nhờ polynucleotide kinase. Mẫu dò oligonucleotide đem lai với các thư viện gene và dòng tái tổ hợp được phát hiện hoặc bằng phóng xạ tự ghi hoặc bằng kĩ thuật miễn dịch tế bào. Phương pháp sử dụng kháng thể: Điều kiện sử dụng: Có được kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa bởi gene càn tạo dòng. Vector sử dụng phải là vector cho phép dịch mã đoạn DNA tạo dòng thành protein trong tế bào. Nguyên tắc: Khi các đĩa phân giải do các phage tái tổ hợp tạo ra trên mặt lớp vi khuẩn đạt kích thước nhất định (1-2 mm) thì đặt lên trên một màng nitrocellulose tẩm IPTG ,chất cảm ứng của operon lac. IPTG sẽ cảm ứng sẽ cảm ứng sự tổng hợp protein “lai”. Protein “ lai” hấp thụ lên bề mặt màng và màng được đem ủ với kháng thể đặc trưng . Phức hợp kháng thể - protein sẽ được phát hiện nhờ một protein đánh dấu bằng 125I có khả năng gắn với kháng thể. Kết quả thu nhận dưới dạng một bảng phóng xạ tự ghi.
Ví dụ :sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp .
Hình 1. Cấu trúc của phân tử insulin
Hình 2. Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt
Hình 3. Sản xuất insulin tái tổ hợp trên vi khuẩn Từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy của động vật như heo và bò. Tuy nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B). Do đó gây ra những tác dụng không mong muốn (như dị ứng) khi sử dụng insulin có nguồn gốc từ heo hay bò. Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều khó khăn. Sau đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo và bò đã được phát triển bằng các sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) sử dụng trypsin. phương pháp sản xuất của Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất này biểu hiện chuỗi A và chuỗi B riêng biệt bằng cách sử dụng Escherichia coli, sau đó thu chuỗi A và chuỗi B, trộn với nhau in vitro tạo cầu nối disulfur. Phương pháp này có hiệu quả sản xuất thấp. Do đó, Eli Lilly phát triển một phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằng trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin. Một phương pháp khác được phát triển bởi tập đoàn Novo Nordisk, phương pháp này biểu hiện miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối với nhau bằng 2 acid amin, được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin in vitro bằng trypsin tạo thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như cầu nối disulfur được hình thành trong quá trình biểu hiện và quá trình tiết miniproinsulin, và miniproinsulin này được tách chiết và tinh sạch dễ dàng do được tiết thẳng ra môi trường nuôi cấy. 4-Ứng dụng của cloning: Trong trồng trọt: phát triển nông nghiệp bền vững để giải quyết nạn đói những năm 2025-2030 và đáp ứng nhu cầu gia tăng mạnh cho chăn nuôi, thực hiện chức năng mới như sản xuất hóa chất và dược phẩm. Trong chăn nuôi: tăng hiệu quả cải thiện giống và nhân giống, cung cấp các sản phẩm mới như dược phẩm và cơ quan cấy ghép. Trong y học: phòng và chữa bệnh 1-ứng dụng di truyền trong trồng trọt Cây đậu tương: Giống DT 96 được trồng nhiều ở An Giang. Đặc tính:hạt to, sinh trưởng 80-85 ngày, chất lượng cao(protein 43%), kháng bệnh đốm nâu, gỉ sắt, sương mai, kháng thuốc diệt cỏ, chịu hạn-úng-nóng-lạnh, năng suất trung bình từ 18-35 tạ/ha. Thích ứng 3 vụ: xuân, hè đông trên các vùng sinh thái của cả nước. Phương pháp: chuyển gene nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Cơ sở: dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang T- plasmid kháng kanamycin và có hoạt tính gus A, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate. Bước khởi đầu của quá trình nhiễm là A. tumefaciens gắn vào một tế bào của cây( thường là ở phần gốc của thân cây). Sau bước gắn khởi đầu, A. tumefaciens sản sinh một mạng lưới các sợi xenluloza liên kết chặt vi khuẩn vào bề mặt tế bào cây. Sau khi một tế bào của A. tumefaciens bám vào tế bào thực vật chủ và các gen vir (các gen độc) bị cảm ứng, T-DNA(các gen của một đoạn DNA plasmit vi khuẩn đặc biệt) được chuyển là một phân tử sợi đơn, mạch thẳng đi vào tế bào thực vật, và cuối cùng được cài nhập vào DNA nhiễm sắc thể thực vật(tạo ra cây chuyển gen.
Hình 2.23: Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium
 Một số loại đậu tương khác như:DT2001, DT2006, DT99, DT02, DT06. Cây ngô: Ở các tỉnh Miền Bắc, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ đã có những giống ngô mới như:LVN14, LVN15, LVN18, LVN37, LVN885, LVN61. Đặc tính:Thời gian sinh trưởng ngắn và trung ngày, khả năng chịu hạn và chịu bệnh tốt, năng suất cao. Phương pháp: Chuyển gen Bt kháng sâu vào cây ngô bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. (Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens: các phôi ngô chưa chín được nhúng vào huyền dịch tế bào A. tumefaciens trong vài phút và sau đó ủ vài ngày ở nhiệt độ phòng trong điều kiện không có áp lực chọn lọc. Sau đó các phôi được chuyển vào môi trường có kháng sinh chọn lọc chỉ cho phép các tế bào đã biến nạp phát triển. các tế bào này được nuôi trong bóng tối trong vài tuần. Cuối cùng, khối các tế bào thực vật đã biến nạp được chuyển đến một môi trường sinh trưởng khác và nuôi dưới ánh sáng để làm tái sinh toàn bộ cây chuyển gen.
 Chuyển gen bằng súng bắn gen Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật. Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA. Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung)). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các hạt.
Hình 2.20 : Súng bắn gen (Hãng Biorad) Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân không. DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm (các kim loại năng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng. Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng về phía các tế bào đích. Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA (Hình 2.21). Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đã phân phối. Các tế bào biến đổi di truyền có thể được sử dụng để tạo thực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyền mong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng (Voiland, 1999).
Hình 2.21: Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va chạm mạnh và đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các phân tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào từ đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu hiện DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối tiếp và Northern blots. Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone thực vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các tế bào mô, cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây. Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào nảy mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền mới.
Hình 2.22: Chuyển gen bằng súng bắn gen Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn....Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Các ứng dụng của kỹ thuật bắn gen bao gồm - Tạo thực vật chuyển gen: đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay trong lĩnh vực tạo ngũ cốc chuyển gen. Một số giống cây khác: Đu đủ chuyển gen kháng virus
 Cà chua, khoai tây chuyển gen

 Cà chua chuyển gen chín chậm
 Các cây trồng chuyển gen khác
 Hình 2.3. Hiệu quả kháng thuốc diệt cỏ ở thuốc lá chuyển gen Bảng 7.1: Một số cây trồng chính đã được chuyển gen stt  loài  Phương pháp chuyển gen  Thử nghiệm trên đồng ruộng   1  lúa mì  Bắn gen  Kháng vius   2  Ngô    Bắn gen/ Agrobacterium  Kháng côn trùng/ chống chịu thuốc diệt cỏ   3  Bông  Bắn gen/ Agrobacterium  Kháng côn trùng/ chống chịu thuốc diệt cỏ   4  đu đủ  Bắn gen/ Agrobacterium  Kháng vius   5  đậu phộng  Bắn gen/ Agrobacterium  Kháng vius   6  Khoai tây  Agrobacterium  Kháng côn trùng, kháng vius, chống chịu thuốc diệt cỏ   7  Lúa  Bắn gen/ Agrobacterium  Chống chịu thuốc diệt cỏ   8  Đậu tương  Bắn gen/ Agrobacterium  Chống chịu thuốc diệt cỏ   9  Bí  Bắn gen/ Agrobacterium  Kháng vius   10  Củ cải đường  Agrobacterium  Chống chịu thuốc diệt cỏ   11  Cà chua  Agrobacterium  Quả chín muộn/ kháng vius   Hình 2.1. Tỷ lệ (%) của các loại cây biến đổi gen được đưa vào sản xuất.
 2-ứng dụng di truyền trong chăn nuôi
 Hình:kháng nguyên di truyền giúp dự đoán số con trong lứa heo chuyển gen: đưa tổ hợp gen, cấu trúc của hormone sinh trưởng và promoter methallothionein vào gia súc. cấy chuyển phôi, biến nạp gen, tạo dòng vô tính. (Cấy chuyển phôi ở bò: gây rụng trứng ở bò cái có các đặc điểm mà ngành chăn nuôi cần đến và cho thụ tinh với tinh trùng của bò đực cũng mang những đặc điểm mong muốn. Các hợp tử hay phôi thu nhận bằng cách rửa dạ con. Đông lạnh phôi và bảo quản chúng trong nitrogen lỏng ở nhiệt độ -179◦C, phôi ở điều kiện này được vận chuyển dễ dàng đến nơi cần thiết. Sau đó, phôi được cấy vào bò cái khác để mang thai hộ. Bê con phát triển từ các phôi này sẽ ra đời trong môi trường sống của nó và không gặp phải những bất lợi về mặt môi trường như các gia súc nhập nội.
 Hình 3.2. Cá hồi chuyển gen hormone sinh trưởng có trọng lượng lớn gấp 11lần so với đối chứng.
Hình: bò chuyển gene Kết quả: thành công ở thỏ, lợn, bò, cừu. 3-Trong y học: a.Tạo những chủng vi khuẩn mới có khả năng sản xuất trên qui mô công nghiệp nhiều sản phẩm sinh học như: axit amin, protein, vitamin, hoocmôn, enzim, kháng sinh. b.Dùng plasmid để chuyển gen mã hóa insulin của người vào vi khuẩn E.coli → insulin chữa bệnh tiểu đường cho người c.Thay thế các protein người: -Sản xuất Insulin. -Sản xuất hormon tăng trưởng. -Cơ sở :dựa vào kĩ thuật DNA tái tổ hợp.