Đề tài Các phương pháp tách chiết DNA và RNA

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA VÀ RNA DNA chứa thông tin di truyền của sinh vật. Do đó mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid (NA) đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. DNA gồm các loại: DNA bộ gen, DNA ty thể, DNA lục lạp, DNA plasmid, DNA phage. Tuỳ kích thước DNA, loại tế bào mà chọn phương pháp tách chiết khác nhau để đảm bảo chiết được DNA tinh khiết và có hiệu suất cao. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết NA là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hoá học (phân tử bị thuỷ giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các NA cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase, RNase). A.Dụng cụ và hoá chất: A.1 Dụng cụ: (Eppendorf: là ống đựng nhỏ bằng nhựa polyethylen hay polypropylen chịu được nhiệt độ khử trùng (1atm, 121oC, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20oC) và một số dung môi hữu cơ, thường có dung tích 0.2, 0.3, 0.5, 1.5, 2ml. (hãng Eppendorf, hãng BioRad…)
(Micropipet (pipetman): là loại pipet có thể chỉnh được thể tích cần lấy dùng để hút dung dịch thể tích nhỏ, độ chính xác cao. Micropipet có nhiều cỡ: Loại Micropipet  Đầu tip tương ứng   0.1->1, 1->10  0.1->10 (màu trắng)   10->100, 10->200  10->200 (màu vàng)   100->1000  100->1000 (màu xanh)   Cấu tạo micropipet thay đổi tuỳ theo kiểu thiết kế nhưng nhìn chung gồm: cần bơm, ngàm tựa, bộ phận đẩy tip, bộ phận điều chỉnh thể tích, số chỉ thể tích được chọn, đầu hút (nơi gắn tip). Khi sử dụng cần chú ý: Phải gắn chặt tip vào đầu hút nếu không sẽ bị mắc sai số. Không để pipet tiếp xúc với dung môi hữu cơ, hoá chất. Không để pipet gần đèn cồn. Không điều chỉnh dưới ngưỡng thể tích tối thiểu và trên ngưỡng thể tích tối đa. Các đầu tip cần cho vào hộp giá (rack), đậy nắp và hấp cao áp tiệt trùng và chỉ được sử dụng một lần để tránh sự tạp nhiễm.
A.2 Trang thiết bị thông dụng: (Bồn ủ nhiệt, tủ định ôn: sử dụng trong các phản ứng cần nhiệt độ ổn định thường có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ, cài đặt thời gian. (Tủ hút khí độc: dùng trong các thí nghiệm có hóa chất bay hơi độc như: phenol, chloroform, ethidium bromide… (Tủ cấy vô trùng: sử dụng trong các phản ứng cần có sự vô trùng. Tủ phải luôn được giữ sạch, khử trùng bề mặt bằng cồn, trước và sau khi sử dụng tủ cần được thanh trùng bên trong bằng đèn tử ngoại (UV) ít nhất 15 phút.
(Nồi hấp tiệt trùng: dùng để khử trùng các hoá chất và dụng cụ cần thiết. (Tủ lạnh: gồm có tủ mát và tủ âm sâu (-20oC và -70oC) dùng để bảo quản hoá chất, mẫu. (Máy đo PH: dùng xác định pH của các dung dịch. (Máy Vortex: dùng để đồng nhất hoá mẫu hoặc dung dịch. (Máy ly tâm (centrifuge): dùng để phân tách và thu nhận các phần tử khác nhau trong cùng một dung dịch. Khi sử dụng khối lượng mẫu phải đồng đều và đặt đối xứng qua trục máy. Chỉ mở nắp khi máy ngưng hoàn toàn. Nguyên tắc: các phần tử khác nhau trong một dung dịch sẽ lắng với vận tốc khác nhau khi chịu tác động của lực li tâm. Tuỳ thuộc vào khối lượng và tỉ trọng của các phân tử vật chất mà ngưới ta chia làm 2 loại ly tâm: Ly tâm phân đoạn: dùng phân tách các phần tử vật chất khác nhau dựa vào khối lượng của chúng. Vận tốc lắng của các phần tử phụ thuộc vào lực ly tâm, khối lượng, tỷ trọng và lực ma sát của các phần tử với dung dịch ly tâm. Để phân tách thành công các phân tử có trong một dung dịch cần phải có lực ly tâm và thời gian ly tâm thích hợp. Ly tâm đẳng tỷ trọng: phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỷ trọng của chúng. Phương pháp này rất hiệu quả, cho các phân đoạn phân tách thuần khiết. Ống ly tâm chứa một cột dung dịch có tỷ trọng tăng dần từ trên xuống đáy ống tạo nên gradient tỉ trọng.  Các phần tử sẽ lắng trong quá trình ly tâm và nằm trong vùng dung dịch có tỷ trọng tương đương với nó. Saccharose và Glycerol được dùng khi phân tách các bào quan, Cesium chloride (CsCl) được dùng để phân tách protein và NA.
 A.3 Hoá chất: (Những điều cần chú ý: - Tất cả các dung dịch hoá chất và nước cần phải được tiệt trùng bằng nồi hấp hoặc lọc qua màng lọc vi khuẩn. Nếu cần cũng nên bảo quản đông lạnh bởi vì vi khuẩn và nấm phát triển là nguyên nhân phát sinh nuclease. (tuỳ theo khuyến cáo mà các hoá chất được bảo quản ở nhiệt độ phòng, tủ lạnh (4oC) hay tủ âm sâu (-20oC). - Để đề phòng tạp nhiễm giữa các nguyên liệu và các dung dịch hoá chất nên sử dụng đầu pipet và ống nghiệm một lần rồi vứt bỏ. - Hoá chất ở dạng các dung dịch nếu bảo quản ở dạng kéo dài hoặc lặp đi lặp lại việc giải đông thường biến tính. Vì vậy, nên chia thành lượng nhỏ sử dụng hết trong một, hai ba lần và bào quản ở -20oC hoặc -70oC. Ví dụ dithiothreitol,… - Người thao tác phải mang găng tay khi tiếp xúc bình đựng hoá chất. - Một vài dung dịch đệm được sử dụng trong các thí nghiệm với cùng thành phần có trong dung dịch đó nhưng với những nồng độ khác nhau, vì vậy cần phải chuẩn bị những dung dịch gốc đậm đặc để có thể pha loãng khi cần. (Dung dịch gốc: - Tris-HCl 1M (pH 7.5): hoà tan 121.1g trong nước cất. Thêm nước để được 1 lít dung dịch. Điều chỉnh pH đến 7.5, phân phối vào lọ và hấp khử trùng. Chú ý: nếu màu dung dịch đã chuyển sang màu vàng ta nên bỏ đi và chuẩn bị hoá chất mới. - NaCl 5M: hoà tan 292.2g NaCl trong nước cất. thêm nước để được 1 lit dung dịch. Phân phối vào lọ và hấp khử trùng. - EDTA 0.5M (Ethylene diamin tetra acetat (pH 8.0): hoà tan 186.1g EDTA.2H2O vào nước cất, vừa khuấy từ vừa thêm NaOH tinh thể để điều chỉnh pH đến 8.0 rồi thêm nước để được 1 lít dung dịch. Phân phối vào lọ và hấp khử trùng. Chú ý: EDTA sẽ không hoà tan vào dung dịch nếu pH không đạt ở mức 8.0 - SDS 10% (Sodium dodecyl sulfate): hoà tan 100g SDS trong nước cất. Nung nóng đến 68oC để hoà tan dung dịch. Điều chỉnh pH đến 7.2 bằng cách thêm HCl. Thêm nước để được 1 lít dung dịch. Chú ý: sử dụng khẩu trang khi cân SDS và dọn dẹp khu vực đã cân cùng với cái cân sau khi sử dụng vì tinh thể SDS khuếch tán rất dễ dàng. Không cần phải khử trùng SDS 10%. - NaOH 10N: hoà tan 200gNaOH trong 500 ml nước cất. Bảo quản trong lọ chất dẻo. - Sodium acetate 3M (pH 5.2): hoà tan 81.62g trisodium acetate vào 200 ml nước cất. Dung dịch sẽ có pH 5.2 - Kalium acetate 5M pH 4.8: lấy 29.5 ml acid acetic băng, thêm KOH đậm đặc để chỉnh đến pH 4.8, thêm nước vừa đủ 100 ml. Không hấp tiệt trùng, bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Sarkosyl 20%(w/v) (N-lauroysarkosyl): hoà tan 20g N- lauroysackosyl trong nứơc cất (tăng nhiệt độ để giúp hoà tan). Thêm nước đến 100ml và hấp khử trùng bảo quản ở nhiệt độ phòng. Dung dịch có màu vàng nhạt. -RNase 10mg/ml: hoà tan 10mg/ml RNase trong TE, đun sôi 10 để diệt DNase. Chia thành các thánh phần nhỏ và bảo quản ở -20oC. - Phenol đệm: Đun khoảng 100g phenol (tinh khiết, mới) trên bếp cách thuỷ 65oC cho chảy. Rót thận trọng phenol đã chảy vào becher 250ml có chứa sẵn 100mg 8-hydroxyquinoline, thêm 100ml Tris-base 50mM (không chỉnh pH). Đậy bằng giấy nhôm, khuấy nhẹ trên máy khuấy từ khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng. Để yên cho phân lớp. Loại bỏ pha trên (pha nước, lưu ý pha hữu cơ chứa phenol có màu vàng) càng nhiều càng tốt. Thêm 500ml Tris-HCl 50mM, pH 8, và lặp lại bước trên đến khi pha phenol đạt đến pH 8 (đo bằng giấy). Thêm 100 ml Tris-HCl 50mM, pH 8 hoặc đệm TE. Bảo quản ở 4oC được 2 tháng trong chai nâu hay chai bọc giấy nhôm. Sử dụng: trộn với chloroform với tỷ lệ 1/1 hoặc với chloroform –iso amyl alcol theo tỷ lệ 25/24/1. Chú ý: phenol và chloroform đều có tính rất độc. Cần mang bao tay và tránh hít hơi bay ra. Phenol dễ cháy và làm phỏng da tay. Cần giữ lại tất cả những dụng cụ có dính phenol và vứt bỏ an toàn. - Ethidium bromide 1000X (5mg/ml): 0.1 g Ethidium bromide trong 20 ml nước cất. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong lọ bọc giấy nhôm để tránh ánh sáng. Chú ý: hoá chất này rất độc có thể gây ung thư. Phải mang găng tay khi thao tác và pha chế trong tủ hút khí độc. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Lysozyme: 20mg/ml trong nước cất. Lọc tiệt trùng và chia thành các phần nhỏ (250ul), bảo quản ở -20oC. - Protein K 20mg/ml. Pha dung dịch mẹ 20mg/ml trong dung dịch gồm Tris-HCl pH7.5 10mM và NaCl 10mM. B Nguyên tắc chung: Quá trình tách chiết DNA trải qua 3 giai đoạn: (Giai đoạn 1: phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lí hay hóa học. Tuỳ từng loại tế bào, có cấu tạo thành và và màng tế bào khác nhau, chọn phương pháp áp dụng thích hợp, riêng lẽ hay phối hợp. Ví dụ: đối với tế bào thực vật thường ta nghiền tế bào trong nitơ lỏng để phá vỡ vách tế bào hoặc dùng các chất tẩy để phá màng tế bào. Còn đối với tế bào vi khuẩn người ta thường dùng lyzozyme và EDTA để phân giải màng. (Giai đoạn 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipit, polysaccharide…) chủ yếu là protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol hoặc phenol/chloroform (1:1) sau đó bằng chloroform hoặc chloroform-isoamyl alcolhol (24:1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein, đồng thời không hoà tan NA vì thế sau khi ly tâm protein sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước có chứa NA và pha phenol/chloroform. Pha nước có chứa NA sẽ được thu nhận lại.
Chiết xuất bằng phenol: Nguyên lý của việc sử dụng phenol trong chiết suất DNA như sau: - Tuy ở nhiệt độ thường phenol ở dạng tinh thể rắn (tan chảy ở 80oC) nhưng khi lẫn với 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử phenol ở giữa và các phân tử nước vây quanh. - Khi pha hỗn hợp này với dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kị thuỷ nên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị thuỷ của protein ở bên trong cấu trúc của các phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kị thuỷ (của gốc amino acid) ra ngoài. Các nhóm kị thuỷ này của protein khi đó kết hợp với nhau tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác nhau. Trong khi đó DNA vẫn là chất tan trong nước và có thể hút sang ống chứa khác. Phenol có ưu điểm có thể tan trong nước (ở mức độ nhất định) nên không cần khuấy trộn nhiều cũng có thể làm biến tính protein (vì khuấy trộn nhiều có thể làm đứt gẫy DNA). Trong khi đó sử dụng chloroform hoặc chloroform-isoamyl alcolhol thì phải trộn đảo kĩ vì các chất này không tan trong nước. Tuy nhiên nhiều lúc cần phải loại bỏ hoàn toàn phenol khỏi dung dịch, khi đó cần phải lặp lại việc chiết xuất bằng chloroform hoặc ether. Sử dụng cả hai loại dung môi hữu cơ thường cho hiệu quả cao hơn. Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kị thuỷ của phenol tăng lên và làm tăng hiệu quả biến tính protein. (Giai đoạn 3: tủa NA. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận NA dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân huỷ của các enzyme, mặt khác để có thể hoà tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Hai cách tủa thông dụng là: (Tủa trong ethanol: việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2.5:1), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa. Hầu như toàn bộ NA đều tủa trong các điều kiện nêu trên. (Tủa trong isopropanol: điểm khác biệt so với phương pháp tủa trong ethanol là không cần sự hiện diện của muối (1:1). Các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, do đó chúng bị loại ra. Trong cả hai phương pháp, NA sẽ được thu nhận lại bằng li tâm. Sau đó cặn tủa phải được rứa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Tiếp theo nó sẽ được hoà tan trong nước khử ion hoặc dung dịch đệm để bảo quản. Kết tủa bằng ethanol: - Cho 2.5 lần ethanol vào dung dịch DNA có chứa sodium acetate và NaCl nồng độ 0.2M trở lên, trộn đều rồi cho vào buồng lạnh -20 hoặc -70oC để kết tủa. Có thể thay NaCl bằng sodium phosphate với lượng rất nhỏ cũng có thể kết tủa DNA.Tuy nhiên nếu dùng muối này thì cần phải thẩm tích để loại bỏ muối này. - Duy trì nhiệt độ thấp (khoảng 10-15 phút ở -70oC, hoặc khoảng 1-12giờ ở -20oC. - Quay ly tâm ở 15 phút ở 4oC với tốc độ 15000 v/ph để tâp trung kết tủa. Trước khi ly tâm có thể thấy kết tủa trắng trong ống nghiệm, khi đó chỉ cần ly tâm nhẹ 3000 v/ph ở 4oC trong vòng 10phút cũng đủ tập trung kết tủa. Thậm chí có thể dùng móc thuỷ tinh móc riêng phần tủa DNA dưới dạng sợi trắng khỏi dịch ethanol nếu hàm lượng DNA đủ lớn. - Bỏ nước mặt, để loại bỏ muối, cần thêm (khoảng hai lần thể tích mẫu) ethanol 70% vào ống, lại ly tâm rót bỏ ethanol. Nếu nhiều DNA thì có thể nhúng móc mang DNA vào lọ chứa ethanol 70% một ít phút, lượng muối trong DNA sẽ giảm. - Sấy khô hoặc hong khô ống chứa DNA rồi thêm dung dịch đệm TE hoặc nước cất để có dung dịch DNA với nồng độ thích hợp. Chú ý: có thể thay ethanol bằng isopropanol với lượng nhỏ hơn (lượng tương đương với dịch DNA) khi cần kết tủa DNA trong dịch khá lớn với ống không thể thêm 2.5 lần thể tích ethanol. Tuy nhiên sau đó nên kết tủa lại với ethanol vì khó làm khô isopropanol, ít hoà tan muối và chỉ dùng isopropanol khi thật cần thiết vì có mùi khó chịu. Kết tủa bằng butanol: Thêm vào dịch DNA một lượng tương đương n-butanol, trộn đều rồi ly tâm nhẹ. Hút bỏ butanol rồ thêm vào lượng butanol khác và lặp lại thao tác trên. Hút bỏ butanol rồi thêm vào một lượng tương đương ethyl ether so với lượng dịch còn lại. Quay ly tâm rồi hút bỏ ether (ether sẽ chiết xuất butanol khỏi dịch). Loại bỏ vết ether còn lại bằng cách bơm không khí (tốt hơn là nitơ) qua ống hút Pasteur vào trong ống nghiệm để làm khô mẫu. Cũng có thể dùng buồng áp suất thấp (buồng chân không) để làm bay hơi ether. Hoà tan DNA vào TE hoặc nước cất. Phương pháp sử dụng cột (DEAE-cellulose column) Cột DEAE- cellulose có thể được chế từ pipet loại 1 ml hoặc ống hút Pasteur. Trước tiên lấy một ống sạch, nhét vào chỗ thắt của ống một lượng nhỏ bông đã loại dầu mỡ, hấp cao áp tiệt trùng. Cho lên lớp bông khoảng 0.2 ml Sephadex50 đã tiệt trùng, rồi cho lên đó khoảng 0.1 ml DE 52 cũng đã tiệt trùng (hai chất liệu được hoà riêng trong nước rồi hấp cao áp). Cho dịch DNA chảy qua ống để hấp phụ DNA , dịch qua lần đầu được rót cho đi qua cột lần nữa. Rửa cột bằng dung dịch đệm với một lượng gấp mấy lần thể tích cột, chứa Tris-HCl (pH 7.5) 10mM, NaCl 50mM và EDTA 1mM. Dung xuất bằng dung dịch đệm nêu trên nhưng với nồng độ NaCl cao hơn, chứa Tris-HCl (pH 7.5) 10mM, NaCl 1.0M và EDTA 1mM. Kết tủa bằng ethanol. Thẩm tích Ngâm ống thẩm tích (túi thẩm tích, có thể mua được từ một số hãng) trong nước chứa EDTA khoảng 50mM rồi đun sôi trong 10 phút. Thay nước cất mấy lần, quấy để rửa sạch. Để nước cất vậy mà hấp khử trùng 10 phút, rồi bảo quản ở 4oC. Tuyệt đối không để màng (ống) thẩm tích bị khô nước. Thực hiện thẩm tích. Cho mẫu dịch nguyên liệu vào ống thẩm tích, kẹp chặt hoặc buộc chặt hai đầu, cho vào bình (chậu) chứa khoảng 500-1000 lần thể tích dung dịch đệm. Ngoại dịch này có thể cần phải thay trong trường hợp thẩm tích phenol trong DNA trong khi cần kéo dài thời gian thẩm tích đến 48 giờ. Nếu thẩm tích CsCl khỏi DNA plasmid thì cần khoảng 4 giờ. C. Phương pháp ly trích DNA ở thực vật: Nguyên tắc: Chiết tách DNA bộ gen từ các mô thực vật có vấn đề khó khăn là phải phá vách tế bào rất cứng và phải loại các polisaccharide. Việc tách chiết DNA thực vật có nguyên tắc chung đó là: - Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học (nghiền mô trong đá khô, nitơ lỏng bằng cối, chày, sứ) để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần bên trong tế bào. - Sử dụng đệm có chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng nhân, giải phóng DNA. - Sử dụng các hoá chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ DNA khỏi sự phân huỷ bởi các enzyme nuclease nội bào. - Sử dụng các hoá chất như chloroform, isoamyl alcohol, phenol…để loại protein và các tạp chất ra khỏi DNA. - Thu hồi DNA bằng cách kết tủa DNA trong cồn, hoặc isopropanol, sau đó li tâm thu lấy kết tủa DNA. - Hoà tan DNA bằng nước cất hoặc dung dịch đệm. - Loại bỏ RNA bàng cách sử dụng men RNase Thực tế, những phức hợp polysaccharides và phenol khác nhau ở nhiều dạng thực vật, vì thế sẽ có những phương pháp ly trích khác nhau phù hợp cho từng dạng đó. Ví dụ, mô thực vật có một lượng lớn phức hợp của phenol thì ta sẽ thêm vào dung dịch ly trích những tác nhân làm giảm hoặc hoà tan phức hợp đó. Phương pháp dùng CATB: Là phương pháp ly trích sử dụng chất có hoạt tính bề mặt là cation CTAB. Đây là phương pháp đơn giản nhất thường được sử dụng nhất khi ly trích DNA từ thực vật cho phép thu được một lượng DNA tinh sạch lớn, DNA có thể được tách ra từ trong những thành phần có nhiều phức hợp polysaccharide và protein bằng sự thay đổi nồng độ muối trong dung dịch. Nguyên tắc Ly trích DNA sử dụng CTAB (cyltrimethylammornium bromide), dung dịch đệm có thành phần chính là Tris – HCL, EDTA, CTAB và NaCl. Vai trò của các chất sử dụng: - DNA ổn định khi tính acid của dung dịch ở pH 8.0. Do trong mẫu có nhiều acid hữu cơ trong không bào và giữa các khe hở tế bào, vì thế các acid đó làm thay đổi pH dung dịch gây tổn hại đến phân tử DNA. Dung dịch Tris-HCl sẽ đáp ứng để ngăn chặn sự giảm nhanh pH. - Ngoài ra, Mg2+ sẽ kích hoạt men DNase làm phân huỷ DNA, vì thế sẽ làm giảm lượng DNA trong mẫu. EDTA là một chelate và hấp thụ những ion dương đó bằng cách tạo phức. - CTAB là một ion dương có hoạt tính bề mặt, nó sẽ tạo phức với DNA là ion âm trong dung dịch. Khi nồng độ muối trong dung dịch lớn hơn 0.7M, phức hợp DNA-CTAB được hoà tan trong dung dịch. Và khi nồng độ muối trong dung dịch nhỏ hơn 0.7M thì phức hợp DNA-CTAB sẽ được tủa. NaCl thêm vào để điều khiển nồng độ muối trong dung dịch. Và như thế, mercaptoethanol và PVP thường thêm vào dung dịch ly trích để bảo vệ DNA. - Hơn thế nữa, phenol và chloroform được thêm vào để biến tính các phần tử tạp như protein và sắc tố. Isoamylalcohol loại bỏ bọt và ngăn cản sự tạo bọt trong dung dịch khi trộn và ổn định 2 pha nước và phenol hoặc chloroform sau ly tâm. Khi mẫu được ly tâm, trong eppendorf sẽ phân tách thành ba lớp. Lớp thứ nhất là dung dịch DNA, lớp giữa là những cặn bã và protein, lớp cuối cùng là phenol hoặc chloroform. - Isopropanol thêm vào để phân tách thu nhận DNA. Vì đặc tính của DNA thường tủa trong dung dịch isopropanol hoặc ethanol khi có sự tồn tại của những ion dương Na+, K+. Trong trường hợp này, RNA không được tủa do nó bị thoái hoá thành nucleoside triphosphate. DNA tủa được rửa bằng dung dịch ethanol 70% để loại bỏ CTAB và NaCl. Bởi vì, DNA không hoà tan được trong ethanol nên nó được giữ ở trạng thái kết tủa. Sodium acetate, potassium acetate hoặc ammonium acetate được thêm vào để tủa và hồi tính lại DNA. - Sơ đồ: D.Phương pháp ly trích DNA từ nấm: Mục đích - Ý nghĩa Đa số các loài nấm thường được phân biệt dựa vào hình thái phát triển, hình dạng đặc trưng, kích thước bào tử, môi trường chọn lọc hay tính chất sinh hoá. Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử cho phép xác định chính xác tên loài, những đặc điểm di truyền của cá thể và quần thể. Trên cơ sở đó tạo nên tiền đề cho phương pháp định danh bằng phân tử, các nghiên cứu sâu hơn về gen, hệ enzyme hay protein. Từ những mục đích đó, vật liệu ban đầu không thể thiếu được đó là ly trích được DNA tổng số của nấm. Sau đây là phương pháp ly trích DNA từ nấm đơn giản và thường sử dụng trong phòng thí nghiệm. Phương pháp Nghiền mẫu Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng thật mịn, và trong quá trình nghiền nitơ được bổ sung liên tục. Mẫu nghiền tránh tạp nhiễm và phải đồng nhất nhau về lượng để thuận tiện trong quá trình ly trích. Mẫu nghiền xong cho vào eppendorf 1.5 ml (1/2 thể tích), eppendorf đựng mẫu phải giữ trong nitơ lỏng hay trong tủ -80oC. Qui trình ly trích Phần bột nấm được cho vào eppendorf 1.5 ml (1/2 thể tích) và thêm vào đó 500 ul lysis buffer. Trộn đều bằng máy vortex, đem mẫu ủ trong bồn warter bath ở 65oC khoảng 1 – 2 giờ. Lấy mẫu ra và thêm 300 ul dung dịch phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), trộn đều nhẹ bằng máy vortex khoảng 30 giây. Ly tâm mẫu 13500 vòng/10 phút/4oC. Hút khoảng 450 ul phần dịch nổi bên trên cho vào eppendorf 1.5 ml mới. Lặp lại bước 2, nhưng thay bằng dung dịch chloroform / isoamyl alcohol(24:1). Thêm 0.6 thể tích isopropanol và 0.03 thể tích sodium acetate vào eppendorf 1.5 ml trên, đảo eppendorf thật nhẹ nhàng khoảng 8 – 10 lần. Đem mẫu ủ ở -20oC trong 30 phút. Ly tâm mẫu 13500 vòng/5 phút/ 4oC. Loại bỏ phần dung dịch bên trên, thu lấy phần kết tủa bên dưới và rửa lại kết tủa bằng ethanol 70%, ly tâm 13500 vòng/5 phút/4oC. Làm khô mẫu tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng. Hoà tan phần tủa trong 100 ul dung dịch TE 1X. Trữ mẫu ở 4oC. Một số điều cần lưu ý Chú ý trong thao tác Các chất sử dụng phải được vô trùng , bàn thí nghiệm và tay luôn được giữ sạch. Tránh thao tác mạnh có thể làm tổn hại đến DNA. Chú ý: SDS và ammonium acetate không được khử trùng trong nồi hấp. Lượng mẫu ly trích So sánh lượng mẫu trong Protocol với lượng mẫu thực tế, nếu lượng mẫu thực tế lớn gấp đôi thì phải tăng thể tích các chất lên gấp đôi, thời gian ly tâm và thời gian ủ không thay đổi. Tuy nhiên, khi làm với lượng mẫu nhiều thì ảnh hưởng đến quá trình ly tâm, thao tác cẩn thận và mức độ trộn của dung dịch kém. Tuổi mẫu Mẫu sử dụng cho ly trích tốt nhất ở giai đoạn còn trẻ, có nghĩa là tế bào đang ở giai đoạn trưởng thành, các quá trình sinh lý, sinh hóa hoàn chỉnh. Nghiền mẫu - Cẩn thận khi thao tác với nitơ lỏng - Mẫu phải được nghiền thật mịn - Tránh tạp giữa các mẫu trong quá trình nghiền - Mẫu nghiền được lấy và trữ trong tủ âm sâu không quá 2 tuần Tốc độ và thời gian ly tâm Không cần điều chỉnh tốc độ và thời gian ly tâm chính xác sau khi trộn mẫu với chloroform và isoamylalchohol hoặc hồi tính lại DNA tủa. Ngoài ra, không cần thiết ly tâm ở tốc độ cao khi ở tốc độ ấy không có sự phân tách. Sản lượng DNA thu được Phụ thuộc vào đối tượng ly trích Phụ thuộc vào thao tác thí nghiệm Phụ thuộc vào phương pháp ly trích E.Phương pháp ly trích DNA ở động vật: Nguyên tắc: Có thể tách chiết DNA từ các nguyên liệu khác nhau như máu, nước bọt, mô cơ, lông, tóc (còn nguyên chân tóc, chân lông) và các loại mô khác. Có nhiều phưong pháp tách chiết khác nhau. Tuy vậy tách chiết DNA có một nguyên tắc chung là: Tách tế bào có nhân ra khỏi vật mang. Phá vỡ tế bào, màng và phân huỷ protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân. Tách DNA ra khỏi đệm và bảo quản DNA ở 4oC. Các bước tiến hành: Tuỳ theo các nguyên liệu khác nhau mà ta có thể áp dụng một số bước tiến hành khác nhau: a)Tách chiết DNA từ mô động vật: Bước 1: Cắt mô thành từng miếng nhỏ. Nghiền mô trong nitơ lỏng để thành bột mịn. Cho mẫu vào ống nghiệm chờ nitơ bay hết. Cho khoảng 100mg mẫu vào ống eppendorf loại 1.5ml. Bước 2: thêm 500ul đệm STE (0.1M NaCl, 0.05M Tris-HCl (pH 7.5), 0.001M EDTA). Hoà trộn nhẹ nhàng. Bổ sung 12ul protease K (nồng độ 10mg/ml) và 37ul SDS 10%. Trộn đều hỗn hợp, ủ ở 55oC trong 2 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Bước 3: thêm 1 lượng dung dịch PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol với tỷ lệ 25:24:1) bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 9000 vòng/5 phút. Bước 4: chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf sạch. Lặp lại bước 3 và 4 một lần nữa. Bước 5: thêm một lượng dung dịch CI (chloroform: isoamyl alcohol với tỷ lệ 24:1)bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 9000 vòng/5 phút. Chuyển phần dịch nổi sang ống eppendorf sạch. Bước 6: thêm một lượng Sodium acetate 3M (NaOAc) bằng 1/10 lượng mẫu và một lượng cồn ethylic 95% bằng 2.5 lần lượng mẫu ở -20oC ít nhất trong 2 giờ, hoặc qua đêm. Ly tâm 9000 vòng/10 phút. Bước 7: rửa sạch bằng cồn ethylic 70%. Hút sạch ethylic. Bước 8: hoà tan kết tủa bằng 500ul dung dịch TE 1X, bảo quản ở 4oC. b) Tách chiết DNA từ máu bằng chelex: Bước 1: lấy 100ul máu tươi, hoặc 1 miếng giáy thấm, hoặc vải đã thấm máu, kích thước 0.5 x 0.5cm cho vào ống eppendorf. Bước 2: thêm 1ml đệm chiết PBS (137mM NaCl; 2.7mM KCl; 10mM Na2HPO4; 2mM KH2PO4) lắc đều, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Ly tâm 14000 vòng/5 phút. Thu kết tủa. Lặp lại bước 2 khoảng 2-3 lần. Bước 3: Thêm 150ul Chelex, bảo quản ở nhiệt độ 4oC đến -20oC. c) Tách chiết DNA từ máu nhờ muối: Bước 1: lấy khoảng 0.1ml máu tĩnh mạch cho vào eppendorf có chứa 25 ul EDTA 0.4M, lắc đều. Bước 2: thêm vào eppendorf đệm phá hồng cầu (1mM NH4HCO3, 115mM NH4Cl). Ly tâm 500 vòng/ phút. Thu kết tủa, loại bỏ phần dịch nổi phía trên. Bước 3: thêm vào ống 200ul đệm phá bạch cầu (100mM Tris-HCl pH 7.6; 40mM EDTA; 50mM NaCl; 0.2% SDS; 0.05% Sodium azide). Lắc đều. Bước 4: thêm 20ul protein K (10mg/ml). Ủ ở 50oC trong 2 giờ. Bước 5: thêm 80ul NaCl bão hoà 6M. Lắc mạnh bằng vortex. Ly tâm 5000 vòng/10 phút, thu dịch nổi phía trên cho vào eppendorf sạch. Bước 6: kết tủa DNA bằng cồn Ethanol tuyệt đối. Bước 7: hoà tan kết tủa bằng dung dịch TE 1X. Bảo quản ở 4oC đến -20oC.